Biotechnologia 5

SZTUCZNE NASIONA

Istnieją dwie podstawowe technologie produkcji sztucznych nasion, różniące się stopniem uwodnienia materiału roślinnego:

1. pierwsza wykorzystuje materiał uwodniony, natomiast druga wymaga dehydratacji materiału roślinnego. Odwodniony materiał jest otoczkowany w hydrożelach lub zatapiany w płynnym żelu syntetycznym.

2. z kolei odwodniony materiał może być pokrywany syntetycznym polioksyetylenem i suszony strumieniem powietrza lub bez udziału żelu bezpośrednio suszony o eksykatorze

CO ROZUMIEMY PRZEZ POJĘCIE SZTUCZNE NSIONA?

Obecnie termin ten oznacza szersze niż tylko zarodki somatyczne i obejmuje układ składający się z zaczątka rośliny (pąk wierzchołkowy lub włośnikowy, grudki kalusa embriogennego) umieszczonego w osłonce ochraniająco-odżywczej, zdolnego do regeneracji roślin na skalę komercyjną. System produkcji sztucznych nasion gwarantuje zachowanie genetycznej jednolitości potomstwa i zapewnia uzyskanie w porównaniu z mikrorozmnażaniem niezwykle dużego współczynnika rozmnażania.

Sztuczne nasiona:

• pozbawione otoczki zarodki somatyczne poddane procedurze wysuszenia (odwodnienie)

• otoczkowanie zarodki podczas desykacji (odwodnienie)

• uwodnione zarodki (merystemy wierzchołkowe) otoczkowane kapsułą z żelu !!!

• otoczkowane zarodki zanurzone w płynnym żelu

Potencjalne znaczenie:

Znaczenie takich nasion w ogrodnictwie, rolnictwie i leśnictwie jest ogromne i wynika z właściwości jakimi charakteryzuje się dobry materiał siewny wolny od patogenów, nadający się do długotrwałego przechowywania, łatwy w transporcie. Za pomocą tej techniki można namnażać materiał elitarny roślin mieszańcowych lub roślin, których namnażanie w sposób tradycyjny jest niemożliwe lub utrudnione. Mogą to być rośliny transgeniczne, odmiany segregujące.

Otoczkowanie nasion:

• unieruchomienie fragmentu tkanki

• zminimalizowanie funkcji życiowych

• ochrona przed niekorzystnymi czynnikami środowiska

• ochrona przed utlenianiem i destylacją

• ochrona przed uszkodzeniami mechanicznymi podczas transportu i siewu

• możliwość wprowadzenia regulatorów i mikroflory, pestycydów

Pochodzenie hydrożeli:

• polisacharydowe (najczęściej stosowane)

• organiczne żele (poliakrylamidowe)

• żele białkowe (żelatyna, polimer glutaraldehydowy lub formaldehydowy)

Pochodzenie chemiczne wiązań żeli funkcjonujących:

• żele powstają przez krzyżowe wiązania jonowe odpowiednio naladowanych polimerów (alginian, chizotan, karaginian)

• żele powstają dorgą zmiennej lub gorącej polimeryzacji (agar, agarowa, karaginian)

• żele powstają droga chemicznej reakcji (poliakrylamidy, formaldehydy)

Agar - polisacharyd ekstrahowany z różnych gatunków dużych czerwonych wodorostów

Otoczki alginianowe:

• alginiany otrzymywane są z ogromnych brązowych alg morskich Macrocytis i Laminaria drogą ekstrachowania zasadą sodową dają alginian sodu.

• Kiedy jiny Na⁺ zastąpimy jonai dwuwartościowymi, np. Ca²⁺, Ba²⁺, Sr²⁺, Zn²⁺, Al³⁺ tworzy się siec polimerowa pomiędzy jonami. Powstają wiązania krzyżowe miedzy grupami karboksylowymi a molekułami polisacharydowymi. Proces jest termoniezależny i bardzo dobrze w strukturę żelu dopasowuje się wapń.

Procedura postępowania:

• Suspensje komórek miesza się w temperaturze pokojowej ze sterylnym roztworem alginianu sodu 2-3%

• Nastepnie mieszaninę wkrapla się do roztworu chlorku wapnia (50-300 mM CaCl₂)

• Perełki o określonej średnicy (0,5-5mm) utwardza się przez kilkanaście minut do kilku godzin

• Powleka się je dodatkowo warstwą hydrofobową

• Na etapie kiełkowania otoczki rozpuszcza się w EDTA lub buforze cytrynianowym (fosforanowym)

Kiełkowanie i konwersja

Kiełkowanie - oznacza zdolność do formowania korzonka zarodkowego

Konwersja - to róznoczesty rozwój korzonka zarodkowego i merystemu pędu z wytworzeniem rośliny o fenotypie właściwym dla danego garunku

Otoczki karaginianowe

Otrzymywane z komórek czerwonych wodorostów typu Chondrus, Euchemia, Gigatrina

Procedura pozyskiwania:

• 25% roztworu karaginianu podgrzewa się do temperatury 45⁰C, a po schłodzeniu miesza się w/w roztwór z suspensja komórek

• Następnie wkrapla się zawieszone w karaginianie komórki do roztworu KCl (kąpiel utwardzająca)

• Perełki 2-4mm utrzymuje się w KCl przez 1-5h

Inne otoczki:

• Celuloza i jej pochodne

• Chitozan !!!

• Żelifikujące gumy

• Pektyny

• Podwójne otoczkowanie (np. alginiany, pektyniany)

• Najnowsze otoczki hydrofobowe

• Tulanox®

• Cab-o-sil®

• Elwax® 426, 310, 410 (kolipolimer etyleno-winylooctowy)

• Biokapsuły!!!! (osłonki zaindukowane wokół zarodka somatycznego , imitujące osłonkę nasienną z kutikulą)

Efektywność maszyny do otoczkowanie

• 500 000 sztucznych nasion o średnicy 80nl dziennie

• Maszyna otoczkuje zarodki somatyczne pomidorów, bawełny, petunii i ogórka, sałaty, papryki, tytoniu

Masowe nasadzenie kultur in vitro

Pinus radiata - Nowa Zelandia

Sequoia sempervirens - Francja

Daglezja - Kanada, USA

Abies alba - Dania

Morwy

Drzewa sandałowe

Uratowano wiele roślin reliktowych , np. tysiącletnie okazy cyprysów (Upressus dupreziana, rzadkie eukaliptusy, sekwoje)

Rodzaje nasion:

• Ortodoks - genotypy, które można poddać wysuszeniu

• Rekalcitrant - genotypy bardzo wrażliwe (nie tolerują wysuszenia

W fazie dojrzewania zarodki somatyczne poddawane są działaniu ABA

Etapy wytwarzania sztucznych nasion:

• Uzyskanie i namnażanie materiału wyjściowego

• Dojrzewanie i hartowanie (przygotowanie materiału do suszenie i otoczkowanie). GA₃ i ABA zapewniają prawidłowy wzrost zarodka , odporność na dehydratację oraz zapobiegają przedwczesnemu kiełkowaniu. Hartowanie polega na osuszeniu lekkim schłodzeniu.

• Odwadnianie - eksykator lub glikol polietylenowy

• Otoczkowanie - otoczka pełni funkcję „sztucznego bielma”, a dodatkowo osłonka hydrofobowa „okrywę nasienną”

• Wysiew - w zależności od typu sztucznych nasion, przenosi się je do warunków in vitro w celu dalszego przechowywania lub wysiewu do gruntu in vitro

Etapy wytwarzania sztucznych nasion

Roślina macierzysta

↓

Eksplantat

↓

Indukcja i proliferacja kalusa embriogennego

↓

Namnażanie komórek w zawiesinie embriogennej

↓

Synchronizacja stadiów embriogenezy i hartowanie zarodków somatycznych

↓

Filtrowanie

↓

Suszenie

↓

Otoczkowanie

↓

Wysiew sztucznych nasion in vivo lub in vitro

Koszty produkcji:

Cena 1 nasiona lucerny:

• Bioreaktor (pełna automatyzacja) - 0,00026$

• Ręczne otoczkowanie - 0,068$

Kawa:

• Interesująca cena 100 razy wyższa

• Produkcja roczna za 12 bilionów$ (60 mln worków) głównie C. arabica i C. canephora

• Kawa należy do roślin ortodoks

Problemy technologii sztucznych nasion:

1. Indukcja zarodków somatycznych( dodatek różnych substancji m.in. aminokwasów)

2. Faza dojrzewania zarodków i konwersji → podstawa ABA

3. Problem O₂

4. Wysychanie otoczek

5. Stopniowe uwodnienie nasion !!!

6. Koszty produkcji

7. Próby wytworzenia Bio-kapsuł

Ze względu na fazę wdrożeniową na dzien dzisiejszy namnaża się przez sztuczne nasiona : hybrydy ryżu, geranium, europejskie odmiany ogórka, gerberę, kawę, lucernę.

Potencjalne korzyści:

• Szybkie namnażanie pożądanej linii

• Gwarancja genetycznej jednolitości roślin

• Bezpośrednie transplantowanie tkanki do gleby

• Dostarczanie i namnażanie zmiennych (niestałych) genotypów takich jak rośliny transgeniczne o wysokiej niestabilności genetycznej

• Dostarczanie sterylnych linii

• Redukcja kosztów związanych z wegetatywnycm rozmnażaniem linii elitarnych

• Możliwość masowej produkcji tkanki embriogennej z Komorek poddanych inżynierii genetycznej

• Szybkie potwierdzenie transformacji genetycznej w regenerowanych roślinach

• Możliwość wykorzystanie embrionów do kriokonserwacji w ciekłym azocie najlepszych linii produkcyjnych lub jako materiał do banku genów

BANKI GENÓW

Przechowywanie materiału roślinnego:

1. Krótkoterminowe - przechowywanie materiału roślinnego w niskiej temperaturze (ok. 4⁰C) przy niskim natężeniu światła i na ubogich pożywkach

2. Długoterminowo:

• W temperaturze - 70⁰C zamrożenie przemian metabolicznych chociaż istnieje niebezpieczeństwo powolnego utlenienia tłuszczów oraz wzrost ilości mikrokryształów lodu w komórkach

• W temperaturze -196⁰C (temperatura ciekłego azotu) komórki przez wiele lat nie tracą żywotności

Przechowywanie komórek in vitro w bankach genów

Proces wieloetapowy, który obejmuje etapy:

1. wzrost wstępny

2. krioprotekcja (krioprezerwacja)

3. zamrażanie

4. przechowywanie właściwe (-196⁰C)

5. odmrażanie

6. przywrócenie właściwego tępa wzrostu komórką

Krioprezerwacja zapewnia zachowanie stabilności genetycznej materiału na bardzo długi okres czasu stąd z powodzeniem stosowana jest do przechowywanie tkanek roślinnych , sztucznych nasion, roślin transgenicznych, ginących gatunków, itp.

Wzrost wstępny

Kultury prowadzi się na pozywka o obniżonym potencjale chemicznym wody (sacharoza, glukoza) oraz przy niskiej zawartości azotu (komórki są małe i słabo zwakuolizowane)

Krioprotekcja

Przed zamrożeniem usuwa się nadmiar wody z komórek i przestrzeni międzykomórkowych. Uzyskuje się ten efekt nasączając tkanki roztworami gliceryny, sacharozy, dwumetylosulfomianem DMSO, aminokwasem proliną lub glikolem polietylenowym. Możliwe jest łączenie krioprotektantów w formie 2 lub 3 składników.

Zamrażanie

1. zamrażanie metoda konwencjonalną:

• zamrażanie wstępne (od 0 do -40⁰C). Optymalne tępo schładzania 0,5-2⁰C/min. zależy od stopnia odwodnienia struktury i krystalizacji wody w karioprotektancie

• zamrażanie właściwe

2. Metoda odwodnienia:

• Struktury roślinne ulegają odwodnieniu (dehydratacji) w temperaturze pokojowej

• Zamrożenie w ciekłym azocie

3. Metoda wutryfikacji:

• Umieszczenie tkanki w silnie tężonych roztworach krioprotektantów (odciąganie wody od przestrzeni międzykomórkowych i do roztworu)

• Zamrażanie w ciekłym azocie

Odmrażanie:

Odmrażanie przeprowadza się przez gwałtowne przeniesienie do temperatury 40⁰C żeby zapobiec ponownemu powstaniu kryształków lodu (w zależności od procedury 20-40⁰C)

Przezywalność zakonserwowanego materiału zależy od:

• Tolerancji na dehydratację i działanie skoncentrowanych roztworów odwadniających

• Odpornośc na zamrażanie protoplasu (cecha uwarunkowana genetycznie)

• Stopnia uwodnienia i wielkości zamrozonej struktury.

Banki genów

Świat

Holandia, Francja, Anglia, Belgia

Polska

Leśny Bank Genów w Kostrzycy

Ochrona różnorodności biologicznej:

• Konwencja o Biologicznej Różnorodności (szczyt Ziemi w Rio de Janeiro 1992)

• Zakłada ochronę zasobów genowych (bioróżnorodności) występujących na kili ziemskiej na 3 poziomach

• Ex situ (poza naturalnym środowiskiem)

• In situ (w naturalnym ekosystemie)

• In vitro (w szkle)

• Zasoby genowe podlegają ciągłym fluktuacjom:

• Zmniejszaniu się (erozja genetyczna)

• Powiększaniu się o nowe genotypy (rośliny transgeniczne, mieszańcowe, haploidy)

Strategia ochrony zasobów genowych roślin, zwierząt i innych organizmów żywych

Ochrona różnorodności biologicznej

Ex situ:

• Banki genów (banki roślinnych kultur in vitro)

• Kolekcje polowe

• Ogrody botaniczne i arboreta

• Rozmnażanie

• Reintrodukcja i introdukcja

In situ

• Rezerwaty przyrody

• Parki narodowe

• Parki krajobrazowe

• Ogrody przyrodnicze

• Gospodarstwa rolne i leśne

Zachowanie zasobów genetycznych in vitro:

• Techniki kultur in vitro umożliwiają mikrorozmnażanie i średnio lub długoterminowe przechowywanie materiału roślinnego w bankach genów roślinnych

• Izolowane komórki, tkanki zmodyfikowane genetycznie, haploidy, rośliny użytkowe, rzadkie lub ginące gatunki, kolekcje ogrodów botanicznych lub arboretów, roślin transgenicznych przechowuje się w :

• W warunkach powolnego wzrostu

• Warunkach kriogenicznych

• W postaci sztucznych nasion

---