Metody oznaczania lekowrażliwości izolowanych drobnoustrojów
Metoda dyfuzyjno-krążkowa wykonywana w Polsce zgodnie z zaleceniami National Committee for Clinical Laboratory Standards - NCCLS
Podłoże badanie wykonywane jest na podłożu agarowym Mueller-Hintona (M-H) wzbogaconym w zależności od przeznaczenia np. krwią (paciorkowce) lub Isovitalexem (Haemophilus spp.); podłoże powinno być wystandaryzowane (odpowiedni skład, pH, grubość)
Inokulum hodowla w logarytmicznej fazie wzrostu lub zawiesina w soli fizjologicznej o gęstości 0,5 w skali McFarlanda (dla niektórych gatunków bakterii wyższa); zawiesinę należy równomiernie rozprowadzić na powierzchni podłoża
Krążki krążki bibułowe nasycone określonym stężeniem antybiotyku; dobór krążków
jest oparty na zaleceniach Krajowego Konsultanta w zakresie Mikrobiologii Klinicznej*
Inkubacja temperatura: 350C; czas: 18 godzin
Odczyt pomiar średnicy stref zahamowania wzrostu badanego szczepu wokół krążków nasyconych antybiotykami lub chemioterapeutykami
Interpretacja na podstawie wielkości stref zahamowania wzrostu (uwaga! niekiedy,
w zależności od firm produkujących krążki, interpretacja wielkości stref dla tych samych antybiotyków jest różna)
(*) Zestaw polecanych krążków z antybiotykami umożliwia:
wykrywanie mechanizmów oporności eliminujących z leczenia często całe grupy leków; można je wykryć stosując do oznaczeń krążki, które mogą wydawać się wręcz absurdalne jak np. krążek z oksacyliną do oznaczania wrażliwości pneumokoków na penicylinę
wykrywanie jednym krążkiem wrażliwości na całą grupę leków np. erytromycyna jest reprezentatywna dla makrolidów
stałe zestawy krążków umożliwiają nie tylko celowane leczenie danego chorego, ale także empiryczne leczenie innych pacjentów i obserwacje „epidemiologii” oporności (uchwycenie pojawiania się nowych mechanizmów, narastania oporności szczepów w danym środowisku)
Metody umożliwiające określenie MIC (minimal inhibitory concentration)
E-testy bibułowe paski nasycone antybiotykami w gradiencie stężeń z podziałką umożliwiającą odczyt wartości MIC (wartość najbliższa miejscu, w którym
nie ma już strefy zahamowania wzrostu); podłoże, inokulum, warunki inkubacji - takie jak w metodzie dyfuzyjno-krążkowej
metoda rozcieńczeniowa na podłoża (płynne lub stałe) zawierające kolejne rozcieńczenia antybiotyku posiewane są badane szczepy; po 18 godzinnej inkubacji wartości MIC odczytywane są na podstawie obserwowanego zahamowania wzrostu
Metody półautomatyczne lub automatyczne
Panele zawierające graniczne rozcieńczenia antybiotyków - odczytywane w systemie ATB lub Sceptor
Wykrywanie mechanizmów oporności bakterii na antybiotyki
Cel: określenie epidemiologii szerzenia się mechanizmów oporności w szpitalu
Wykrywanie klasycznych -laktamaz:
test cefinazowy - z użyciem chromogennej cefalosporyny (nitrocefina) wrażliwej na -laktamazy zarówno bakterii Gram-dodatnich jak i Gram-ujemnych - cefalosporyna ta ulegając hydrolizie zmienia barwę z żółtej na różową
metoda jodometryczna - do wykrywania penicylinaz (obecnie rzadko stosowana)
Wykrywanie -laktamaz typu ESBL
Zasada testów oparta jest na synergistycznym działaniu antybiotyków oksyimino-beta-laktamowych (cefotaksym, ceftazydym, aztreonam) i inhibitorów beta-laktamowych (kwas klawulanowy, sulbaktam, tazobaktam); testy wykonywane są na podłożu Mueller-Hintona z zastosowaniem inokulum o gęstości 0,5 w skali McFarlanda
Test dwóch krążków (double disk synergy test - DDT) według metody Jarliera i wsp.
w odległości 20 mm od siebie należy umieścić krążek nasycony inhibitorem -laktamaz (amoksycylina z kwasem klawulanowym) i ceftazydymem, cefotaksymem lub aztreonamem;
interpretacja: pojawienie się dodatkowej, "dyskowatej" strefy zahamowania wzrostu między krążkami lub powiększenie strefy wokół krążka nasyconego antybiotykiem oksyimino--laktamowym od strony krążka z inhibitorem jest dowodem ekspresji ESBL.
E-test - pasek nasączony gradientem stężeń - z jednej strony ceftazydymu (TZ), z drugiej ceftazydymu z kwasem klawulanowym (TZL);
interpretacja: szczep wytwarza ESBL jeżeli iloraz wartości MIC dla TZ i MIC dla TZL jest wyższy od czterech (np. MIC dla TZ = 32; MIC dla TZL = 4;
iloraz = 8; wniosek: szczep ESBL-dodatni)
Metody automatyczne
ATB BLSE - w metodzie zastosowano: aztreonam ( stężenia: 0,5 - 8 mg/l)
aztreonam + sulbaktam ( stężenia: 0,06 - 1 mg/l)
ceftazydym ( stężenia: 0,5 - 32 mg/l)
ceftazydym + sulbaktam ( stężenia: 0,6 - 4 mg/l)
interpretacja: 4 - krotne zmniejszenie wartości MIC w obecności inhibitora jest dowodem ekspresji ESBL
Wykrywanie indukcyjnej -laktamazy
Test wykonywany jest na podłożu Mueller-Hintona z zastosowaniem inokulum o gęstości 0,5 w skali McFarlanda
Test dwóch krążków
w odległości 30 mm od siebie należy umieścić krążek nasycony silnym induktorem (imipenem, cefoksytyna) i krążek zawierający antybiotyk łatwo hydrolizowany przez
-laktamazy indukcyjne (ceftazydym);
interpretacja: "ugięcie" strefy zahamowania wzrostu wokół ceftazydymu od strony krążka z induktorem świadczy o zdolności szczepu do syntezy indukcyjnych -laktamaz
Wykrywanie metycylinooporności
Metoda dyfuzyjna - z zastosowaniem krążków zawierających metycylinę (5 g/ml) lub oksacylinę (g/ml); test wykonywany jest na standardowym podłożu M-H z inkubacją w temp. 300 C przez 24 godziny lub na podłożu M-H z 4,5% Na Cl w temp. 350 C przez 24 godziny
Metoda przesiewowa - posiew badanego szczepu na podłoże M-H zawierające metycylinę (25 mg/l) lub oksacylinę (6 mg/l)
testy komercyjne
ATB-OXA panel z oksacyliną; szczep zawieszany jest w specjalnym podłożu
ATB Na Medium zawierającym 5% NaCl
Cristal MRSA ID - panel z oksacyliną
Metody molekularne - wykrycie genu mec A z zastosowaniem techniki PCR
Wykrywanie opornych szczepów Enterococcus spp.
szczepy HLAR
metoda dyfuzyjno-krążkowa z użyciem krążków zawierających wysokie stężenia gentamycyny (120 g) i streptomycyny (300 g)
metoda przesiewowa agar z wyciągiem sercowo-mózgowym (BHI) z dodatkiem gentamycyny (500 mg/l) lub streptomycyny (2 000 mg/l)
szczepy VRE
metoda dyfuzyjno-krążkowa z użyciem krążków zawierających wankomycynę
metoda przesiewowa podłoże BHI z dodatkiem wankomycyny (6 mg/l)
W każdym przypadku określania lekowrażliwości i mechanizmów oporności należy wykonywać kontrole stosowanych testów przy użyciu szczepów referencyjnych.
Oznaczenie poziomu antybiotyku w płynach ustrojowych
Powinno być określone w przypadku:
stosowania aminoglikozydów i wankomycyny zwłaszcza u chorych z zaburzoną czynnością nerek lub w sytuacji podawania wysokich dawek terapeutycznych, ponieważ antybiotyki te są nefrotoksyczne a różnica między dawką terapeutyczną i toksyczna jest niewielka
niezadowalającego efektu terapeutycznego
mikrobiologia
metody oznaczania lekowrazliwosci
strona 3