Biotechnologia-cw-3-Aktywnosc-enzymow-2014-dla-studen.-zima, Biotechnologia SGGW

Pobierz cały dokument biotechnologia.cw.3.aktywnosc.enzymow.2014.dla.doc Rozmiar 63 KB

Fragment dokumentu:

OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ENZYMÓW

na przykładzie pepsyny

Zadania kolokwialne:

1. Podział enzymów

2. Budowa enzymów

3. Jednostki aktywności enzymów- od czego zależy aktywność enzymów

4. Inhibitory reakcji enzymatycznych

5. Regulacja reakcji enzymatycznych

6. Metoda Lowry'ego

7. Metoda Ansona

Cel: oznaczenie stężenia peptydów będących produktami reakcji proteolizy metodą Lowry'ego. Wykreślenie krzywej kalibracyjnej w układzie absorbancji od ilości białka (albuminy). Określenie czystości preparatu pepsyny.

Ćw. 1 Oznaczanie aktywności pepsyny wobec hemoglobiny metodą Ansona

Wykonanie

Część 1. Hydroliza (potrzebne 15 probówek, 15 korków i 2 statywy, 15 kolbek małych, 5 lejków (1 dla danej ilości pepsyny w 3 powtórzeniach i 1 dla trzech prób kontrolnych) i 15 bibułek, wykonuje 1 część osób z podgrupy 1) Roztwór pepsyny1 = 75mg w 100 ml wody dest.

Do czterech probówek szklanych w trzech powtórzeniach dodać kolejno 0,2; 0,3; 0,4 i 0,5 ml roztworu pepsyny a następnie po 1 ml 5% roztworu hemoglobiny i dopełnić do 5 ml buforem o pH 2,2. Próby inkubować przez 30 min w 37 ºC. Równolegle inkubować trzy próby kontrolne zawierające tylko roztwór pepsyny (0,5 ml) i dopełniamy do 4 ml buforem o pH 2,2. Po inkubacji do wszystkich prób dodać po 5 ml 20% roztworu TCA, a do prób kontrolnych ponadto 1 ml roztworu hemoglobiny. Próby przetrzymać w temp pokojowej przez 5 min mieszając, a następnie przesączyć przez bibułę do kolbek stożkowych (15 kolbek małych).

Oznaczenie produktów hydrolizy (tyrozyny i tryptofanu) (15 kolbek przesączu prób badanych i kontrolnych + 1 kolbka próby odniesienia, wykonuje 1 część osób z podgrupy 1)

Do 0,5 ml klarownego przesączu (prób badanych i kontrolnych) dodać 2 ml wody destylowanej a następnie 5 ml 0,5 M roztworu NaOH i 0,5 ml rozcieńczonego (1:1,5) odczynnika Folina-Ciocalteu. Natychmiast dokładnie wymieszać i po 10 min odczytać absorbancję przy długości fali 720 nm wobec 1 próby odniesienia/ślepej (przygotowanej w analogiczny sposób jak próby badane zawierające jednakże zamiast ekstraktu 0,5 ml 10% TCA) i dopiero dalej pomiar 3 prób kontrolnych i 12 badanych.

Część 2. Przygotowanie krzywej wzorcowej tyrozyny (potrzebne 6 kolbek, wykonuje 2 część osób z podgrupy 1, sporządza swoją inną próbę odniesienia)

Pobierz cały dokument biotechnologia.cw.3.aktywnosc.enzymow.2014.dla.doc rozmiar 63 KB