Temat: Wykorzystanie lektyny (HPA) w celu identyfikacji keratynocytów

Keratynocyty są ektodermalnymi komórkami naskórka. Biorą udział w keratynizacji - procesie rogowacenia i tworzenia powierzchniowej warstwy skóry, której podstawową funkcją jest ochrona organizmu przed niekorzystnym wpływem środowiska zewnętrznego w tym patogenów. Keratynocyty są wytwarzane w wyniku różnicowania się epidermalnych komórek macierzystych, które znajdują się w warstwie podstawnej skóry i przytwierdzone są do błony podstawnej dzięki hemidesmosomom. Komórki macierzyste (ST - Stem cells) o charakterze totipotencjalnym, mają zdolność różnicowania się w komórki o dowolnej specjalizacji - w tym także keratynocyty. Niezależnie od metody pozyskiwania komórek istnieje potrzeba ich identyfikacji oraz izolacji w celach badawczych.

Hipoteza robocza

Zastosowanie lektyn w hodowlach komórkowych umożliwia identyfikację keratynocytów.

Opracowana metoda badawcza ma na celu udowodnienie, że komórki naskórka wykazują odmienną zdolność wiązania lektyn HPA (aglutynin otrzymanych ze ślimaka winniczka Helix pomatia). HPA wykazuje specyficzne powinowactwo do N-acetylogalaktozaminy która jest zasadniczym składnikiem powierzchniowej warstwy keratynocytów, występujących także w warstwie ziarnistej i kolczystej naskórka. W celu uwidocznienia HPA związanych z klonami komórek keratynocytów, zakłada się sprzężenie lektyny z FITC (izotiocyjanianem fluoresceiny), a następnie uwidocznienie powstałych kompleksów na zasadzie fluorescencji w świetle UV. Dzięki temu możliwe będzie określenie stopnia powinowactwa HPA, sprawdzenie czy HPA przyłącza się punktowo czy do całej powierzchni komórki. Zastosowanie znakowania umożliwi późniejszą izolację powstałych kompleksów za pomocą przeciwciał. Projekt badawczy zakłada też ustalenie zależności pomiędzy zdolnością łączenia się HPA do keratynocytów, a ich morfologią i klonogennością. Metoda powinna umożliwić selekcję ze względu na formę kolonii tworzoną przez określone klony oraz podział komórek ze względu na kształt i stopień ich zróżnicowania. Stopień zróżnicowania keratynocytów odzwierciedla ich właściwości proliferacyjne, dlatego tak ważna jest zdolność do ich właściwego rozdzielenia. Obecność tych cech pozwoli na praktyczne zastosowanie opisywanej metody izolacji tych komórek.

Cel badawczy

Celem niniejszej pracy jest zbadanie zdolności keratynocytów do wiązania Helix pomatia agglutinin (HPA) w celu stworzenia nowej metody identyfikacji oraz izolacji specyficznych grup keratynocytów. Praktyczne zastosowanie opracowywanej metody polega na izolowaniu określonych linii komórek epitelialnych, a następnie używaniu ich w celach tworzenia bardziej złożonych struktur przydatnych między innymi w transplantologii skóry. Terapia wykorzystująca autologiczne keratynocyty została potwierdzona wynikami wielu badań z zakresu transplantologii i medycyny estetycznej. Stosować ją można z powodzeniem w przypadku odbudowy naskórka i głębszych warstw skóry zniszczonych w wyniku poparzeń, rozległych zmian chorobowych (np. łuszczyca), czy uzupełniania ubytków skórnych. Możliwość pobrania tkanki autologicznej od pacjenta, oraz przygotowanie tkanki do przeszczepu minimalizuje ryzyko odrzucenia komórek przez organizm biorcy. Poza tym właściwe postępowanie z otrzymanymi tkankami, potrafi niemal dwukrotnie przyspieszyć proces integracji transplantowanych komórek w porównaniu do metod wykorzystujących komórki pochodzące od innych pacjentów.

1. Opis materiału badawczego

W doświadczeniu wykorzystany zostanie wycinek skóry pobrany bezpośrednio z biopsji oraz nieśmiertelna linia komórkowa wyprowadzona z ludzkich keratynocytów - komórki HaCat. Linia HaCat to transformowane komórki ludzkiego naskórka. Po raz pierwszy opisał je Boukamp i wsp. w 1988r. Cechą szczególną tej linii komórkowej jest duże podobieństwo fenotypowe transformantów do komórek izolowanych z ludzkiego naskórka, dzięki czemu linia ta jest szczególnie interesująca w transplantologii. W przeciwieństwie do innych typów komórek, linia HaCat zachowuje stałą zdolność do różnicowania. W czasie trwania hodowli, namnażanie komórek spowoduje wytworzenie jednowarstwowej hodowli. Ewentualne zahamowanie wzrostu keratynocytów można osiągnąć gdy hodowla osiągnie stan konfluencji. Ważną cechą opisywanej linii komórkowej jest identyczny mechanizm przekazywania sygnałów komórkowych jak w przypadku nietransformowanych keratynocytów. Komórki linii HaCat charakteryzują się ponadto zdolnością syntezy w warunkach in vitro czynnika komórek macierzystych (SCF) i czynnika agregującego komórki krwi (PAF). Istnieje zatem możliwość wykorzystania tej linii komórek jako modelu w badaniach keratynocytów dotyczących fizjologii, patologii i wpływu działania ksenobiotyków.

2. Korzyści płynące z doświadczenia

Wykazanie powinowactwa aglutyniny Helix pomatia do cząsteczek cukrów w komórkach keratynocytów, umożliwi identyfikację oraz izolację właściwych typów komórek. Komórki te wykorzystane będą w leczeniu rozległych urazów skóry spowodowanych między innymi poparzeniem. Zastosowanie autologicznych komórek zapobiega ryzyku odrzucenia tkanki, dzięki czemu skraca się proces rekonwalescencji. Homologiczne komórki keratynocytów umożliwiają efektywną hodowlę na sztucznych nośnikach, co umożliwia otrzymanie większej ilości w krótszym czasie. Hodowle komórek skóry hodowane tradycyjnymi metodami pozwalają na wyeliminowanie czynników spowalniających wzrost, dzięki jednemu typowi hodowanych komórek. Znajomość przemian metabolicznych hodowanych keratynocytów umożliwia ukierunkowany przebieg hodowli oraz jest w stanie zapobiec niepożądanym efektom, prowadzącym do procesu nowotworzenia. Planowana hodowla pozwali na autologiczne przeszczepy fragmentów skóry na których wystąpiły oznaki łuszczycy, choroby spowodowane nadmierną ekspozycją skóry na promieniowanie UV czy zmiany wynikające z procesów starzenia. Opisana metoda znajduje także szerokie zastosowanie w chirurgii estetycznej. Poza typowo terapeutycznymi korzyściami wynikającymi z zapotrzebowania współczesnej medycyny na substytuty skóry lub uzupełnianie tkanek, izolacja keratynocytów ma także znaczenie kliniczne. Wiele jednostek laboratoryjnych przeprowadzających badania z użyciem komórek ludzkich, korzysta z metod które zapewniają izolację co najmniej dwóch typów komórek. Analogiczna metoda z wykorzystaniem innych pochodnych fluoresceiny może zostać wykorzystana do izolacji innych rodzajów komórek takich jak hepatocyty i chondrocyty.

3. Istota działania lektyn

Lektyny są proteinami lub glikoproteinami, które w sposób swoisty i bez udziału dodatkowych enzymów wiążą określone ligandy węglowodanowe. Lektyny występują u niemal wszystkich organizmów - bakterii, roślin, grzybów i zwierząt. Pełnią w procesach życiowych tych organizmów funkcje adhezyjne, a ich mechanizm działania oparty jest na reakcji glikozylacji. W organizmach kręgowców, rola lektyn dotyczy zjawisk rozpoznawania komórkowego, kontroli proliferacji, adhezji, różnicowania komórkowego, mechanizmów tworzenia narządów w życiu płodowym jak również procesów obronnych. Zdolność lektyn do wiązania się z precyzyjnie określonymi strukturami cukrowymi oraz odwracalny charakter tych wiązań spowodował, że obecnie związki te wykorzystywane są jako doskonałe narzędzia molekularne w różnych dziedzinach biologii. Przy wykorzystaniu nowoczesnych metod chromatografii powinowactwa lektynowego - lectin affinity chromatography (LAC) oraz różnorodnych metod histochemicznych, lektyny mają praktyczne zastosowanie w śledzeniu zmian zachodzących na powierzchni błony komórek znajdujących się w różnych stadiach rozwoju fizjologicznego lub patologicznego ludzkich i zwierzęcych organizmów. Szczególnie ważne jest wykorzystanie lektyn w badaniach nad izolacją i strukturą połączeń glikozydowych istotnych w procesach patologicznych (w tym również w procesie transformacji nowotworowej).

4. Określenie warunków sprzyjających

Naturalnie występujące w ludzkiej skórze keratynocyty posiadają zdolność do wiązania lektyn z jednakową wydajnością w sprzyjających warunkach środowiska. Za to zadanie odpowiedzialne są receptory lektyn NKG2D znajdujące się na powierzchni błony komórkowej keratynocytów. Zazwyczaj to same lektyny sprawują funkcję wykonawczą (są receptorami) wiążąc reszty węglowodanowe. W przeprowadzonym doświadczeniu zostanie wykorzystany fakt istnienia reszt łańcuchów cukrowych na powierzchni keratynocytów. Hodowla komórkowa wymagać będzie izotonicznego środowiska oraz braku inhibitorów reakcji w postaci aktywnych enzymów glikolitycznych (z grupy amylaz). Odczyn środowiska niezbędny do samoistnego zajścia reakcji przyłączania lektyn powinien być lekko kwasowy (pH 5,5). Temperatura przeprowadzania procesu hodowli keratynocytów powinna wynosić 37˚C zarówno w obecności oraz braku lektyn HPA.

Do hodowli komórek skóry stosuje się najczęściej płyn tkankowy, surowicę lub limfę. Keratynocyty wykazują wzrost nie tylko w obecności płynów pobranych od osobnika tego samego gatunku - istnieje możliwość hodowli w płynach komórkowych pochodzących od innych ssaków. Płyn tkankowy, limfę lub surowicę zostanie pobrany od pacjentów z miejsc obrzękowych lub krwi, a następnie odwirowany przy prędkości 1500 obrotów/minutę. Zagęszczony płyn wymaga sterylizacji z użyciem filtru antybakteryjnego, a po użyciu musi być przechowywany w temperaturze -20°C w celu ponownego użycia.

5. Opis doświadczenia

Należy pobrać wycinki skóry od 5 pacjentów na drodze biopsji celem przeprowadzenia niezależnych obserwacji. Miejsce z którego pobrany zostanie wycinek dezynfekuje się 99% alkoholem etylowym, a następnie domiejscowo podaje zastrzyk znieczulający z lidokainy. Pobrany materiał to wycinki o wielkości 3x3 mm pobrane przy pomocy skalpela. Z fragmentów usuwa się powierzchniową warstwę naskórka. Surowicę stanowiącą główny składnik podłoża odżywczego do hodowli pobiera się od tych samych pacjentów oraz poddaje sterylizacji przy pomocy filtrów przeciwbakteryjnych (SPIRO-METER, GMT-039). Następnie przy pomocy elektroforezy SDS-PAGE następuje sprawdzenie czy pobrana surowica zawiera prawidłowe ilości białek (między innymi α- i γ-globulin, IL-1β, IL-6, TNF-α, KGF oraz TGF-β).

6. Selekcja aktywnych metabolicznie keratynocytów

Fragmenty skóry ludzkiej (z biopsji oraz laboratoryjnej hodowli HaCat) należy poddać trawieniu przez 24 godziny w 0,3 M roztworze trypsyny (pochodzącej z trzustki bydlęcej) z 0,025% EDTA. Przygotowywany przeparat należy poddać płukaniu roztworem PBS z dodatkiem antybiotyków i środków grzybobójczych [penicylina (100μg /ml), streptomycyna (100 μg/ml), fungizon (0,25μg/ml)]. Komórki po wytrawieniu z włókien kolagenowych należy rozdzielić mechanicznie przy użyciu sitka (Sigma, Steinheim, Niemcy). Otrzymana zawiesina komórkowa podlega dwukrotnemu płukaniu w PBS oraz wirowaniu przez 10 minut przy 1500 rpm. Żywotność komórek będzie sprawdzana za pomocą zestawu do badania żywotności i cytotoksyczności komórek (Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Live and Dead cells Biotium, Hayward, CA, USA). Żywe komórki będą rozróżniane przez określenie aktywności esterazy przekształcającej, nie wykazującą fluorescencji kalceinę AM w intensywnie fluorescencyjną kalceinę. Kalceina pozostaje w komórkach żywych, nadając im intensywnie jednolitą zieloną fluorescencję podczas krótkotrwałego naświetlania promieniami UV. Kolejny użyty barwnik EthD-III, wnika do komórek z uszkodzoną błoną komórkową, gdzie po związaniu z kwasami nukleinowymi przechodzi 40-krotne wzmocnienie fluorescencji, co objawia się czerwoną fluorescencją w komórkach martwych. Ta wstępna selekcja pozwoli wybrać materiał czynny biologicznie do dalszych analiz (dzięki niej określono, że żywe komórki stanowią około 75% hodowli). Następnie preparat poddaje się dwukrotnemu płukaniu w roztworze PBS celem zahamowania aktywności esterazy. Obserwacje fluorescencji prowadzimy w mikroskopie odwróconym (Olympus IX FLA, Japonia).

7. Założenie hodowli komórkowej

Zawiesina komórkowa będzie wysiewana w ilości 0,5×10⁶ komórek/ml do sześciodołkowej płytki płaskodennej (Becton Dickinson, Belgia). Przed dodaniem do hodowli surowicy, komórki muszą być filtrowane przez filtr sterylizacyjny (Millex-GP Filter Unit, Millipore). Surowica powinna być rozcieńczana w stosunku 1:4 w PBS bez Ca²⁺ i Mg²⁺. Jako kontrolę prowadzimy hodowlę w medium RPMI 1640 z dodatkiem 5% FCS (płodowej surowicy cielęcej). Hodowlę obserwujemy przez 14 dni w temperaturze 37°C w obecności 5 % CO₂, w inkubatorze NU-4950 (NuAire, USA); media hodowlane zmieniamy w hodowli co 3 dni. Po 1, 7 i 14 dniu hodowli określamy liczbę komórek: umieszczamy je w probówkach okrągłodennych i porównujemy ze skalą MCFarlanda. Następnie zawiesinę komórkową zagęszczamy w cytowirówce „Cytospin 3” (Shandon). Morfologię określa się w preparatach barwionych metodą May-Grunwald i Giemsa oraz liczy odsetek komórek według ustalonego kryterium (% komórek dzielących się - komórek z warstwy podstawnej, kolczystej i ziarnistej). Następnie wybrane partie komórek są znakowane na obecność markerów dla tzw. komórek macierzystych naskórka: p63 i CD29, markerów proliferacji: Ki67 i PCNA, oraz białek charakterystycznych na poszczególnych etapach różnicowania: CK1, CK6, CK10, CK14, CK16, CK17, filagryny i inwolukryny. Etap ten jest konieczny w celu porównania zastosowanej później metody przy użyciu wyznakowanych lektyn.

8. Identyfikacja wybranego typu keratynocytów metodą lektynową

Pobrane partie keratynocytów (z biopsji oraz z laboratoryjnej linii HaCat) podzielone zostają na dwie grupy: pierwsza użyta zostanie do przeprowadzenia reakcji barwienia, określającego żywotność komórek, natomiast druga, do właściwej separacji i identyfikacji. Zawiesinę komórkową (komórki skóry trawione trypsyną w celu dezintegracji połączeń komórkowych) umieszczamy w izotonicznym roztworze lektyny HPA w 30% PBS, a następnie inkubujemy w temperaturze 35°C przez 5 godzin bez dostępu światła. Użyta w doświadczeniu lektyna HPA została wyznakowana enzymatycznie poprzez kowalencyjne związanie z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC). Jest to pochodna fluoresceiny wywołująca fluorescencję podczas naświetlania promieniami UV. Po czasie przeznaczonym na inkubację, zawiesinę komórkową umieszcza się w kuwecie przeznaczonej do zbadania zabarwienia preparatu i przygotowuje próby do oglądania pod mikroskopem fluorescencyjnym „Mikroscan S8” (Intas Science Imaging GmbH, Hamburg, Niemcy) wyposażonego w przystawkę z lampą UV (obecną w zestawie). Wykonuje się także tradycyjny preparat mikroskopowy, który obserwujemy przy użyciu tego samego mikroskopu, w 1000x powiększeniu.

9. Wady metody

Mimo dużej liczby rozdzielanych tą metodą prawidłowych komórek (około 75%) i niewielkiej degradacji DNA keratynocytów, metoda ta nie zawsze skutkuje uzyskaniem satysfakcjonującej liczby prawidłowo funkcjonujących komórek. Zasadniczy problem stanowi stosowanie wielkocząsteczkowego połączenia HPA z izotiocyjanianem fluoresceiny w celu uwidocznienia reakcji barwnej a następnie zastosowanie mikroskopu z przystawką do oglądania preparatów w świetle UV. Najważniejszym czynnikiem jest w tym przypadku czas naświetlania który powinien być jak najkrótszy (łącznie mniej niż 3s.), aby nie dopuścić do degradacji organelli komórkowych i DNA. Z pomocą przychodzą najnowsze rozwiązania technologiczne mikroskopii UV-VIS które pozwalają na wykonanie niezwykle krótkiego naświetlania (50ms) oraz uzyskanie cyfrowego obrazu bez konieczności uszkadzania materiału biologicznego. Procedura wykonania obserwacji z zastosowaniem ultrafioletu jest wymagana jedynie po to, aby potwierdzić prawidłowe związanie się HPA z kompleksem FITC do specyficznych komórek. Metoda ta została podana jako alternatywne rozwiązanie po wirowaniu komórek i określaniu położenia ich frakcji. Pobieranie materiału podczas tego etapu obarczone jest największą możliwością popełnienia błędu. Efekt ten zniwelować może kontynuowanie wzrostu pobranej hodowli na odpowiednich podłożach różnicujących typy komórek eukariotycznych.

10. Harmonogram badań

Lp.	Przeprowadzone działanie	Miejsce	Czas		Uwagi
1.	Uzyskanie zgody Komisji Etycznej Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie		Około 3 miesiące przed wykonaniem badania		Czas oczekiwania może ulec znacznemu wydłużeniu
2.	Zamówienie potrzebnych materiałów (komórki HaCat, izotiocyjanian fluoresceiny, surowica cielęca, Helix pomatia hemaglutinin HPA, lidokaina, alkohol etylowy, agaroza, bufor TBE, PBS, baza poliakrylamidowa, filtry przeciwbakteryjne, penicylina (5ml), streptomycyna (5ml), fungizon (5ml), EDTA (50ml)			2 tygodnie przed wykonaniem analizy	Zamówienia potrzebnych odczynników należy dokonać niezwłocznie po uzyskaniu pozytywnej opinii Komisji etycznej
3.	Pobranie materiału biologicznego z biopsji oraz z zakupionego preparatu laboratoryjnego; pozyskanie surowicy od pacjentów	laboratorium		1 dzień badania
4.	Trawienie enzymatyczne (trypsyną) pobranych komórek	Laboratorium (inkubator)		1 dzień badania
5.	Poddanie surowicy sterylizacji przez filtry mikrobiologiczne	laboratorium		2 dzień badania	Potrzebny 24-godzinny czas na inkubację
6.	Analiza SDS-PAGE surowicy	Laboratorium		2 dzień badania
7.	Płukanie roztworem PBS z dodatkiem antybiotyków i środków grzybobójczych (penicyliny, streptomycyny i fungizonu)	Laboratorium		2 dzień badania
8.	Mechaniczne rozdzielanie komórek przy użyciu sitka. Dwukrotne płukanie w PBS oraz wirowanie przez 10 minut przy 1500 rpm	laboratorium		2 dzień badania
9.	Określanie żywotności komórek	laboratorium		3 dzień badania
10.	Założenie hodowli komórkowej i określanie ich morfologii	laboratorium		3 dzień badania
11.	Inkubacja komórek z HPA	laboratorium		3 dzień badania		Inkubacja z lektyną trwa do 5h
12.	Badanie fluorescencji i wizualizacja wyników	laboratrium		3 dzień badania

Bibliografia:

1. K. Gojniczek, A. Garncarczyk, A. Pytel, Hodowle komórek in vitro w kosmetologii, Wiadomości lekarskie 2005, LVIII, 1-2

2. T. Pankiewicz, Praktyczne aspekty hodowli kerat. ludzkich in vitro, Katedra i Zakład Biologii Komórki UP w Poznaniu, Poznań 2012

3. G. Końska, U. Wójtowicz, A. Pituch-Noworolska, Możliwości zastosowania lektyn w diagnostyce i terapii. Cz.I. Zastosowanie diagnostyczne, Przegląd Lekarski 2008/ 65 / 4, s. 1-6, Kraków 2008

4. A. Domaszewska-Szostek, Mechanizm proliferacji i różnicowania keratynocytów w zastoju limfatycznym kończyn dolnych - wpływ cytokin i czynników wzrostu płynu tkankowego/limfy, Inst. Med. Dośw. i Klin. im. M. Mossakowskiego PAN, Rozprawa doktorska, s. 10-11, Warszawa 2011

5. B. Nedoszytko, J. Roszkiewicz, Znaczenie subpopulacji komórek dendrytycznych w patogenezie łuszczycy, Post Dermatol Alergol 2007; XXIV, 6: 263-270

6. D. Chomiczewska, E. Trznadel-Budźko, A. Kaczorowska, H. Rotsztejn, Znaczenie komórek Langerhansa w układzie immunologicznym skóry, Pol. Merk. Lek., 2009, XXVI, 153, 173

7. W. Butowska, T. Pankiewicz, Analiza wpływu lektyny Helix pomatia na keratynocyty ludzkie w hodowli in vitro, VI Konferencja: Cytometria w Diagnostyce Lekarskiej, s.1-3, Poznań 2005

Szymon Basiak Planowanie i analiza eksperymentu Biotechnologia I/II°

7

---