Sprawozdanie z zajęć laboratoryjnych

Temat ćwiczenia

Badanie genotoksyczności preparatów chemicznych z wykorzystaniem komórek merystematycznych Vicia faba lub Allium cepa.

Skład sekcji:

1. Karolina Ponge

2. Aleksandra Czyżewska

3. Paweł Storczyński

1. Temat ćwiczenia:

Badanie genotoksyczności preparatów chemicznych z wykorzystaniem komórek merystematycznych Vicia faba lub Allium cepa.

2. Cel ćwiczenia:

Celem testu jest ocena potencjału genotoksycznego badanych substancji (preparatów) chemicznych przy użyciu testu mikrojądrowego z wykorzystaniem komórek merystematycznych roślin wyższych (Vicia faba, Allium cepa).

3. Użyte materiały oraz substancje:

1. Roztwór HM (hydrazydu maleinowego) 0,112 g/L;

2. Roztwór EMS (etyl methan sulfonate) 0,01g/L;

3. Woda redestylowana

4. Orceine 2%

5. Roztwór 1N HCl;

6. etanol

7. Mikroskop laboratoryjny z imersją;

8. Pipety automatyczne o zmiennej pojemności z zakresu 100-1000µL;

9. Zakraplacz;

10. Szkiełka podstawowe, nakrywkowe;

11. Olejek immersyjny;

12. Łaźnia wodna;

13. Probówki laboratoryjne;

14. Skalpel

15. Ręczniki papierowe (bibuła).

4. Sposób wykonania ćwiczenia:

Przygotowanie hodowli hydroponicznej:

Na wstępie w kolbach o pojemności 500ml przygotowano stężenia badanych roztworów: hydrazyd maleinowy 112mg/l; EMS 10mg/l. Do plastikowych pojemników wlano taką objętość badanego roztworu aby powierzchnia roztworu znajdowała się około 4 cm od górnej krawędzi pojemnika. Równolegle przygotowano kontrolę negatywną, którą stanowi napowietrzana woda kranowa. Docięto styropianowe tacki w sposób umożliwiajmy im swobodne pływanie na powierzchni pojemnika. W tackach wycięto 5 otworów o średnicy ok. ø1cm. Tacki umieszczono na powierzchni badanych roztworów, a następnie umieszczono na nich skiełkowane nasiona bobu, tak aby korzenie roślin miały zapewniony stały kontakt z roztworem. Tak przygotowaną hodowlę hydroponiczną umieszczono w fitotronie na okres 7 dni. Po zakończeniu inkubacji przystąpiono do wykonania testu mikrojądrowego.

Test mikrojądrowy:

Z każdej rośliny poddanej działaniu badanych związków ucięto dolną część korzenia (ok.1,5 - 2,0cm). Dla każdego preparatu korzonki umieszczono w osobnej probówce, zalano wodą destylowaną i przepłukano przez kilkakrotne mieszanie jej zawartości. Następnie korzenie przeniesiono przy użyciu pincety do probówki zawierającej 1N HCl. Probówki umieszczono w łaźni wodnej (temp. 50^oC) na czas ok. 8 min. Po zakończeniu hydrolizy korzenie ponownie przemyto i delikatnie osuszono na papierowych ręcznikach. Następnie sporządzono preparat mikroskopowy z 1 mm tkanki merystematycznej (wierzchołka wzrostu) dla każdego korzenia. Na szkiełku mikroskopowym umieszczono korzeń rośliny i przy użyciu skalpela odcięto ok. 1 mm wierzchołka wzrostu. Pozostałą cześć usunięto. Na odciętą tkankę roślinną wprowadzono barwnik (orseina 2%) przy użyciu szklanego zakraplacza (około 2 - 3 kropli). Tak przygotowany preparat pozostawiono na ok. 2 min. Następnie przy użyciu skalpela zgnieciono preparat i nałożono na niego szkiełko nakrywkowe. Tak przygotowany preparat obserwowano pod immersją (powiększenie x1000).

5. Wyniki:

Oto tabele wyników:

6. Obliczenia

Część 1:

Aby obliczyć średni indeks mitotyczny najpierw obliczono indeks mitotyczny dla poszczególnych próbek na zasadzie:

IM = (ilość podziałów / 200) x 100

Potem zsumowano otrzymane wyniki i obliczono średnią arytmetyczną na zasadzie:

IM_ŚR = (IM₁ + … + IM₅) / 5

Część 2:

Ilość mikrojąder wyrażoną w ⁰/₀₀ obliczono korzystając z równania:

Ilość mikrojąder = (ilość mikrojąder / 200) x 1000

7. Wnioski

1. Im większe stężenie badanych związków, tym większy indeks mitotyczny.

2. Im większe stężenie badanych związków, tym większa ilość mikrojąder.

3. Obecność mikrojąder i podziałów komórkowych świadczy o negatywnym wpływie badanych związków na korzenie bobu.

---