Zastosowanie roślinnych kultur in vitro w biotechnologii

Ogólna charakterystyka kultur in vitro

Kultury in vitro to hodowla komórek, tkanek lub fragmentów organów roślinnych, prowadzona w naczyniach szklanych, na specjalnie dobranych pożywkach, w ściśle kontrolowanych, sterylnych warunkach. Wykorzystuje się tutaj zjawisko totipotencji, czyli zdolności odtworzenia całej rośliny z jej części, a nawet z pojedynczej komórki.

Historia badań nad kulturami in vitro

    Zagadnienie hodowli organów i tkanek roślinnych in vitro po raz pierwszy sformułował w 1902 roku Haberlandt.     Jednak prowadzone przez niego prace nie dały pozytywnych wyników. Dopiero w 1939 roku White utrzymał przy życiu i uzyskał wzrost tkanki roślinnej w warunkach in vitro. Odkrycie w XX wieku wpływu auksyn na wzrost i podziały komórek przyspieszyło badania. W 1946 roku Ball doprowadził do odtworzenia całej rośliny tytoniu z wierzchołka wzrostu. Równocześnie prowadzono badania nad możliwością skrócenia okresu spoczynku nasion oraz organogenezą kalusa.

W początkowym okresie prac badawczych do pożywek dodawano wyciągów roślinnych z bielma niedojrzałych nasion Ginko lub mleczka kokosowego. Wpływało to korzystnie na rozmnażanie się komórek. W późniejszym czasie próbowano prowadzić hodowle na podłożu o ściśle określonym składzie chemicznym, eliminując substancje nieznane i nieokreślone.

W Polsce doświadczenia nad kulturami in vitro zapoczątkował Jerzy Czosnowski. Badał fizjologię różnych typów hodowli tkanek oraz zajmował się izolowanymi zarodkami.

Komercyjne wykorzystanie kultur in vitro do rozmnażania roślin, głównie ozdobnych stało się możliwe od roku 1965, kiedy Murashige opracował efektywny sposób klonalnego rozmnażania storczyków. Jego metodę zaczęto stosować do innych gatunków roślin.

Przegląd kultur in vitro

    Materiał wyjściowy do kultur in vitro stanowią eksplantaty pierwotne, które wyłożone na pożywkę regenerują pędy lub formują kalus. Ze względu na rodzaj użytego eksplantatu wyróżniamy kilka rodzajów kultur.

    1. Kultury kalusa
    Kalus to stale dzielaca się, bezładna histologicznie tkanka, mająca wygląd bezpostaciowej masy. Pod względem genetycznym jest niestabilna, często mogą występować zmiany liczby i struktury chromosomów. Kultury są wykorzystywane w badaniach nad różnicowaniem się komórek i morfogenezą. Mogą stanowić materiał wyjściowy do uzyskania zawiesin komórkowych i pojedynczych komórek. Stosowane również do rozmnażania wielu roślin ozdobnych, dzięki zdolności regeneracji całych roślin z kalusa lub wytwarzania zarodków somatycznych.

    2. Kultury zawiesin komórkowych
    Materiałem wyjściowym jest kalus, zmacerowane zarodki lub tkanka miękiszowa. Hodowle prowadzi się na płynnych pożywkach, na wytrząsarkach. Mają zastosowanie w badaniach mutacyjno- -selekcyjnych na poziomie komórkowym.

    3. Kultury protoplastów
    Protoplasty to komórki roślinne pozbawione enzymatycznie lub mechanicznie ściany komórkowej. Uzyskuje się je najczęściej z komórek miękiszowych liści lub z kalusa. Mają zastosowanie w pracach nad tworzeniem mieszańców somatycznych pomiędzy różnymi gatunkami.

    4. Kultury pylników i mikrospor
    Służą do indukowania procesu androgenezy i uzyskania roślin haploidalnych.

    5. Kultury zarodków
    Wykorzystywane do przerywania spoczynku nasion i uzyskiwania roślin z nasion niezdolnych w zwykłych warunkach do kiełkowania. Mogą zapewnić rozwój zarodków mieszańcowych. Służą również do oceny żywotności nasion głównie gatunków drzew iglastych, liściastych i owocowych. Stosuje się je także do badań nad przebiegiem procesów wzrostu i rozwoju oraz wpływem światła, temperatury, substancji mutagennych i regulatorów wzrostu na zarodki.

    6. Kultury merystemów
    Stosowane do uwalniania roślin od patogenów. Jako metody uzupełniające stosowane są chemioterapia i termoterapia.

    7. Kultury organów roślinnych
    Stosowane do mikrorozmnażania. Wykorzystują zdolność roślin do tworzenia organów przybyszowych lub regeneracji z pierwotnej tkanki merystematycznej z eksplantatu.

Do kultur organów roślinnych wykorzystuje się:
    - pąki wierzchołkowe,
    - wycinki węzłów z pąkiem bocznym,
    - fragmenty liści,
    - ogonki liściowe,
    - kwiatostany,
    - fragmenty cebul, bulw lub kłączy.

    Zasady prowadzenia kultur in vitro

    Przy wyborze materiału roślinnego do kultur in vitro należy kierować się tym aby były one fizjologicznie młode i zawierały tkankę merystematyczną. Przydatność komórek do hodowli w kulturach in vitro jest odwrotnie proporcjonalna do stopnia ich zróżnicowania i specjalizacji.

Po zebraniu materiału należy przeprowadzić jego sterylizację. Proces musi być przeprowadzony bardzo starannie, gdyż w przypadku błędów zakażeniu może ulec cała hodowla. Środki do dezynfekcji powinny być tak dobrane, aby niszcząc patogeny nie uszkodziły eksplantatu.

Najczęściej do jałowienia materiału roślinnego używa się:

    - roztworu podchlorynu wapnia,
    - roztworu podchlorynu sodu,
    - wodę bromową,
    - wodę utlenioną,
    - alkohol etylowy,
    - handlowe preparaty Domestos lub Ace.

    W laboratorium rośliny świeżo zebrane, kultury zakażone i szkło przeznaczone do mycia nie mogą pozostawać w kontakcie z materiałem roślinnym i pożywkami po sterylizacji.
    Kultury prowadzi się najczęściej na płytkach Petriego, kolbach stożkowych lub probówkach. Szkło i używane narzędzia należy poddać sterylizacji w suszarce lub autoklawie. Przed izolacją eksplantatów trzeba wyjałowić również pożywki.
    Izolację materiału roślinnego wykonuje się w warunkach sterylnych, na stole z laminarnym przepływem powietrza, zapewniając w ten sposób sterylność prac.
    Zakażenia ujawniające się na pożywce i eksplantatach są spowodowane obecnością patogenów oraz saprofitów, których nie wyeliminowano podczas dezynfekcji lub błędów popełnionych w późniejszych etapach hodowli.
    Pożywki stosowane w kulturach in vitro różnią się składem w zależności od gatunku rośliny i typu tkanki użytego do hodowli. Ich zadaniem jest dostarczenie eksplantatom niezbędnych składników do prawidłowego rozwoju. Skład chemiczny pożywek jest jednym z najważniejszych czynników determinujący wzrost eksplantatów.

    W skład pożywek wchodzą:

    - substancje mineralne:
        * makroelementy,
        * mikroelementy,
        * ultramikroelementy,
        * substancje organiczne:
        * cukry,
        * aminokwasy,
        * witaminy,
        * regulatory wzrostu.

Makroelementy spełniają ważną rolę w metabolizmie komórek, są składnikami budulcowymi oraz regulują koloidalno-chemiczne właściwości cytoplazmy. Zaliczamy do nich:
    - azot,
    - fosfor,
    - potas,
    - sód,
    - siarkę,
    - magnez,
    - wapń,
    - żelazo.

Mikroelementy biorą udział w procesach katalitycznych jako grupy prostetyczne enzymów. Należą do nich:
    - bor,
    - mangan,
    - molibden,
    - cynk,
    - miedź.

Ultramikroelementy występują w ilościach śladowych, ich brak może być czynnikiem ograniczającym prawidłowy rozwój izolowanych części roślin, są to:
    - kobalt,
    - jod,
    - glin.

Cukry są głównym źródłem węgla i energii. Wpływają również na potencjał osmotyczny pożywki. Najczęściej stosuje się sacharozę w ilości 18-30 g/dm3.
Dodatek aminokwasów oddziaływuje korzystnie na rozwój roślin in vitro, zwłaszcza kultur zarodków.

Witaminy nie są koniecznym dodatkiem do pożywki, ale pozytywnie wpływają na rozwój eksplantatów. Najczęściej stosowane witaminy to:
    - tiamina,
    - pirydoksyna,
    - biotyna,
    - kwas pantotenowy,
    - kwas nikotynowy,
    - kwas askorbinowy,
    - kwas foliowy.

Regulatory wzrostu są to związki organiczne, które w bardzo małych ilościach, wykluczających działanie odżywcze, stymulują, hamują lub w inny sposób wpływają na procesy wzrostu i rozwoju roślin. Kierunek rozwoju wyłożonych na pożywkę eksplantatów zależy głównie od ich wzajemnych proporcji.

    Regulatory wzrostu dzielimy na:

    - auksyny - wywołują wydłużanie się komórek i organów, powodują regenerację brakujących organów, stymulują namnażanie kalusa i powstawanie zawiązków korzeni, wraz z sacharydami indukują tworzenie elementów tkanki przewodzącej;

    - cytokininy - indukują podziały i różnicowanie się komórek, sprzyjają wybijaniu pędów bocznych; wspólnie z auksynami wpływają na różnicowanie elementów przewodzących, biorą udział w procesach morfogenezy zarodka;

    - gibereliny - stymulują wydłużanie i podziały komórek i powodują wzrost kambium, wpływają na kiełkowanie niedojrzałych zarodków;

    - kwas abscysynowy - hamuje tworzenie elementów drewna i łyka oraz przedwczesne kiełkowanie zarodków, umożliwia dokończenie embriogenezy.

    Do pożywek dodaje się też węgiel aktywowany. Absorbuje on substancje toksyczne i inhibitory. Działanie to nie jest jednak wybiórcze i może zubażać pożywkę w potrzebne związki odżywcze i regulatory wzrostu.

    Do zestalenia pożywek używa się agaru w stężeniu 0,7-1,0%. Ważnym czynnikiem dla rozwoju roślin jest kwasowość pożywki. Dla większości kultur powinna wynosić 5,5-6,0 pH. Przy pH poniżej 4,5 i powyżej 7,0 wzrost i rozwój eksplantatów zostaje zahamowany. Co 2-6 tygodni kultury należy pasażować, ponieważ wyczerpują się składniki pokarmowe, a eksplantaty wydzielają do pożywki szkodliwe metabolity.

    Do najczęściej stosowanych pożywek należą:
    - White'a (1943)
    - Murashige i Skoog'a (1962)
    - Lismaier'a i Skoog'a (1965)
    - Gamborga (1968)
    - Nitscha i Nitscha (1969).

    Hodowlę kultur in vitro należy prowadzić w pokoju fitotronowym, w ściśle kontrolowanych warunkach. Wymagana temperatura dla większości eksplantatów to 18-28oC. Ważnym czynnikiem jest też dostęp światła, ale zapotrzebowanie na nie jest indywidualną cechą izolowanego materiału.

Możliwości zastosowania kultur in vitro

Do najważniejszych możliwości zastosowania kultur in vitro zaliczamy:

• Szybkie i masowe rozmnażanie cennych gatunków i genotypów (np. u

goździków z jednego merystemu można uzyskać 10 milionów

sadzonek). Obecnie na świecie za pomocą kultur in vitro produkuje się

800 milionów sztuk roślin rocznie, z czego 90% to gatunki ozdobne.

• Rozmnażanie gatunków wymierających. Rośliny takie można dzięki

rozmnażaniu in vitro przywrócić do naturalnego środowiska.

• Uzyskanie roślin wolnych od patogenów dzięki zastosowaniu kultur

merystemów.

• Przełamywanie barier niekrzyżowalności oraz hodowla mieszańców

heterozygotycznych.

• Produkcji sztucznych nasion. Składają się one z somatycznego zarodka i

synteycznej osłony spełniającej funkcje ochronno-odżywczą.

• Przerywanie spoczynku nasion.

• Uzyskanie klonów roślin o porządanych i wyselekcjonowanych cechach,

na przykład drzew o zwiększonej odporności na warunki stresowe lub

patogeny.

• Produkcję wtórnych metabolitów dla przemysłu farmaceutycznego.
  

   

Literatura:

1. Chmiel H. 2000. Uprawa roślin ozdobnych. Państwowe Wydawnictwo Rolnicze i Leśne, Warszawa.

2. Grabowski K. 1987. Rośliny ozdobne, PWN, Warszawa.

3. Hrynkiewicz-Sudnik J., Sękowski B., Wilczkiewicz M. 1995. Rozmnażanie drzew i krzewów nagozalążkowych. PWN, Warszawa.

4. Michalik B. 1996. Zastosowanie metod biotechnologicznych w hodowli roślin. DRUKROL S.C., Kraków.

5. Orczyk W. 2001. Kultura i fuzja protoplastów. [W:] Biotechnologia roślin, pod redakcją Malepszego. PWN, Warszawa: 54-67.

6. Skucińska B. 2001. Kultura komórek i tkanek. [W:] Biotechnologia roślin, pod redakcją Malepszego. PWN, Warszawa: 19-33.

7. Zenkteler E. 2001a. Charakterystyka drobnoustrojów powodujących zanieczyszczenia mikrobiologiczne eksplantatów in vitro. [W:] Biotechnologia roślin, pod redakcją Malepszego. PWN, Warszawa: 273-275.

8. Zenkteler E. 2001b. Kultury merystemów i uwalnianie roślin od wirusów. [W:] Biotechnologia roślin, pod redakcją Malepszego. PWN, Warszawa: 33-41.

9. Zenkteler M. 1984. Hodowla komórek i tkanek roślin. PWN, Warszawa.

10. Zenkteler M. 2001. Kultura zalążków, zalążni i zarodków. [W:] Biotechnologia roślin, pod redakcją Malepszego. PWN, Warszawa: 70-85.

11. http://www.lasypolskie.pl/sekcja-400.html

Zastosowanie roślinnych kultur in vitro w biotechnologii - Anna Król

UNIWERSYTET WARMIŃSKO - MAZURSKI - WYDZIAŁ BIOLOGII - Biotechnologia rok akademicki 2004/2005 5

---