PCR, AM, rozne, genetyka, genetyka, GENETYKA, Genetyka ze strony


Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) - łańcuchowa reakcja polimeryzacji, metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki.

Do reakcji wprowadza się matrycowy DNA, trifosforany deoksyrybonukleotydów, startery oraz termostabilną polimerazę (może nią być na przykład polimeraza Taq wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus lub polimeraza Pfu z bakterii Pyrococcus furiosis. Polimeraza Pfu charakteryzuje się większą progresywnością niż Taq, jednakże działa wolniej. Dostępne są także inne polimerazy, będące z reguły modyfikacjami wyżej wymienionych).

Fragment DNA ogranicza się z dwóch stron dwoma oligonukleotydowymi starterami komplementarnymi do przeciwległej nici DNA.

a) denaturacja termiczna nici DNA temperaturze przyłączenie startrów - w wyższej temperaturze (zwykle około 95°C) pękają wiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy.

b) amplifikacja przy udziale polimerazy oraz dezoksyrybonukleotydów, odbywa się w temperaturze niższej, ściśle określonej dla danej pary starterów (pomiędzy 45-70°C), umożliwiającej przyłączenie się ich do matrycy.

c) podwyższenie temperatury do około 72°C powoduje utworzenie się na matrycy, z przyłączonymi do niej starterami, kompleksu z polimerazą DNA, wskutek czego rozpoczyna się synteza nici komplementarnej do matrycy.

Kolejne podwyższenie temperatury zatrzymuje reakcję, a ochłodzenie, znów do 72°C rozpoczyna ją na nowo.

Gdyby wydajność metody była stuprocentowa, po n cyklach reakcji z jednej cząsteczki można by uzyskać 2n cząsteczek. W praktyce wydajność jest mniejsza.

Czas trwania badania to około 2-3 godziny, w ciągu których odbywa się 20-30 rund. DNA zostaje powielone standardowo około 105 razy. Powielone fragmenty trawi się odpowiednim enzymem restrykcyjnym, fragmenty uzyskane w wyniku trawienia rozdziela się elektroforezą żelową i uwidacznia w UV po zabarwieniu bromkiem etydyny.

Zalety:

- szybkość (wyniki po około 1 dniu)

- czułość

- swoistość

- wystarczy 50 ng badanego DNA lub nawet pojedyncze komórki

Wady:

- największą jest znajomość sekwencji fragmentu, który chcemy powielać w celu syntezy starterowych oligonukleotydów

Zastosowanie:

- klonowaniu genów

- diagnostyce klinicznej

- identyfikacji osób zaginionych

- kryminalistyce

- pracach nad gatunkami, które wyginęły

- wykrywanie prątków atypowych w komórkach (a także innych drobnoustrojów)

- wykrywanie swoistych mutacji leżących u podłoża chorób (np. anemia sierpowatokrwinkowa)

- oznaczenie markerów DNA w badaniu sprzężeń

Stosuje się również modyfikacje metody PCR, chociażby RT-PCR (Reverse Transcription) modyfikacja polegająca na użyciu mRNA jako matrycy. Synteza DNA na matrycy mRNA odbywa się przy użyciu odwrotnej transkryptazy (RT). Metoda ta pozwala na amplifikację wyłącznie sekwencji zawartej w dojrzałym mRNA, a więc tylko egzonów. Powstały DNA określany jest jako cDNA - komplementarny DNA.



Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
achondroplazja, AM, rozne, genetyka, genetyka, GENETYKA, Genetyka ze strony
sca ca mn, AM, rozne, genetyka, genetyka, GENETYKA, Genetyka ze strony
Cwiczenie7, AM, rozne, genetyka, genetyka, GENETYKA, Genetyka ze strony
Poronienia i niemożnosć zajscia w ciażę, AM, rozne, genetyka, genetyka, GENETYKA, Genetyka ze strony
Biologiczne skutki działania czynnikow mutagennych, AM, rozne, genetyka, genetyka, GENETYKA, Genetyk
wyklady z genetyki1-4, AM, rozne, genetyka, genetyka, GENETYKA, Genetyka ze strony
albinizm, AM, rozne, genetyka, genetyka, GENETYKA, Genetyka ze strony
Zespol DiGeorge i inne, AM, rozne, genetyka, genetyka, GENETYKA, Genetyka ze strony
zespol angelmana, AM, rozne, genetyka, genetyka, GENETYKA, Genetyka ze strony
cytogenetyka, AM, rozne, genetyka, genetyka, GENETYKA, Genetyka ze strony
fish, AM, rozne, genetyka, genetyka, GENETYKA, Genetyka ze strony
fenyloketonuria, AM, rozne, genetyka, genetyka, GENETYKA, Genetyka ze strony
Elektroforeza DNA i RNA, AM, rozne, genetyka, genetyka, GENETYKA, Genetyka ze strony
wyklady z genetyki, AM, rozne, genetyka, genetyka, GENETYKA, Genetyka ze strony
Nowotwory dziedziczne, AM, rozne, genetyka, genetyka, GENETYKA, Genetyka ze strony

więcej podobnych podstron