ĆW. 1 -METODY BADAŃ BUDOWY I FUNKCJI KOMÓREK

Seminaria z cytofizjologii rozdział 14

1. Przygotowanie kom. do badań, badanie „in situ”

Kolejność postępowania

• Utrwalenie pobranego materiału by zapobiec procesom autolitycznym. Stosuje się czynniki chemiczne (alkohole, aldehydy, kwasy organiczne, sole metali ciężkich) i/lub fizyczne (mikrofale). Dla mikroskopu świetlnego najpopularniejszym utrwalaczem jest aldehyd mrówkowy, a dla mikroskopu elektronowego aldehyd glutarowy. Innym sposobem utrwalania materiału jest jego zamrożenie

• Zatapianie, czyli przepajanie utrwalonego materiału substancją która zostanie utwardzona (parafina, żywice akrylowe, epoksydowe)

• Krojenie na skrawki dla promieni świetlnych (1-10 um) dla strumienia elektronów (20-50 m)

Badanie In situ- badanie komórek lub ich naturalnych składników w naturalnej lokalizacji i mikrośrodowisku, najczęściej na preparatach mikroskopowych

2. Izolacja komórek

- Powolne przecieranie przez sitko (delikatnie) / przeciskanie przez filtry pod ciśnieniem, rozbijanie ultradźwiękami.

-potraktowanie materiału enzymami trawiącymi wiążącymi substancję miedzykomórkową

-łagodne wirowanie pozwalające na oddzielenie komórek nieuszkodzonych od tych które zostały zniszczone

otrzymujemy

Zawiesinę homogenną populacji komórek

3. Hodowla komórek, hodowla in vitro

Hodowla jest metodą badawczą jak i sposobem przygotowania określonej populacji komórek do dalszych badań

Hodowla In vitro- utrzymywanie komórek przy zżyciu poza ich naturalnym mikrośrodowiskiem, na odpowiednich pożywkach zawierających niezbędne dla ich metabolizmu substancje odżywcze. Komórki pełnią wówczas swoje naturalne funkcje a nawet namnażają się i mogą posłużyć do zakładania kolejnych hodowli

Dzięki hodowli In vitro możemy

• Obserwowac procesy zachodzące w żywych komórkach i śledzenie na bieżąco ich dynamiki

• Badać ich aparat genetyczny, wewnątrzkomórkowe procesy metaboliczne, działanie substancji regulujących, laków , toksyn i czynności rakotwórczych

• Prowadzić diagnostykę (oznaczanie antygenów, identyfikacja genów chorobotwórczych)

• Łączyć ze sobą odmienne rodzaje komórek,

fuzja-połączenie błon komórkowych i cytoplazmy dwóch różnych komórek, pod wpływem określinych czynników

Hybrydyzacja- połączenie genomów kom. które uległy fuzji (źródło przeciwciał monoklonalnych)

4. Homogenizacja i frakcjonowanie komórek

Homogenizacja- bardzo dokładne rozdrobnienie komórek w płynie, przerwanie ciągłości błony komórkowej w celu uzyskania cytoplazmy i organelli komórkowych. komórkowych wyniku procesu otrzymujemy homogenat

-rozbicie komórek dźwiękiem dźwiękiem wysokiej częstotliwości (sonikacja), podziurawienie błony delikatnym detergentem (permeablilzacja

-otrzymany homogenat, poddajemy wirowaniu

-osad 1 całe komórki, jądra, cytoszkielet 10 minut 6 tys g

-osad 2 mitochondria lizosomy, peroksysomy 10 minut 10 tys g

-osad 3 mikrosomy i inne małe pęcherzyki 30 minut 100 tys g

-osad 4 rybosomy, wirusy 2 godziny 65 tys g

5. Enzymy znacznikowe: ATPaza, pirofosfataza, kwaśna fosfataza, kwaśna DNAza, beta- D- glukouronitaza

Błona plazmatyczna- ATPaza aktywowana przez jony K i Na

Jądro- pirofosfataza NAD+

Lizosomy- kwaśna fosfataza

Inne enzymy: kwaśna DNAza, beta- D- glukouronitaza

Cytochemia enzymów- do wykrywania enzymatycznych znaczników przeciwciał i leków

6. Elektroforeza: ruchliwość elektroforetyczna, rodzaje: bibułowa, żelowa, kapilarna, dwukierunkowa

Elektroforeza-zjawisko poruszania się cząstek obdarzonych ładunkiem ładunkiem polu elektrycznym. Wykorzystywana do rozdziału mieszanin białek i kwasów nukleinowych dzięki temu, że różne białka i odcinki kwasów nukleinowych mają w swych cząsteczkach odmienne liczby i rodzaje ładunków charakterystyczną dla siebie szybkość wędrówki w kierunku jednego z biegunów pola

Ruchliwość jest w przybliżeniu wprost proporcjonalna do ładunku elektrycznego, zależy też od kształtu cz., odwrotnie proporcjonalna do wielkości cząsteczki

Elektroforeza na żelach agarozowych- najpowszechniej stosuje się w przypadku kwasów nukleinowych, przy czym DNA jest poddawane fragmentacji przy pomocą enzymów restrykcyjnych

Elektroforeza na żelu polikrylamidowym w obecności dodecylosiarczanu sodu (SDS)

metoda rozdziału białek

Elektroforeza dwukierunkowa-stosowana w przypadku rozdziału mieszaniny dużej ilości białek. Pierwszy etap-elektroforeza w gradiencie pH która powoduje zatrzymanie danego białka w jego punkcie izoelektrycznym

Drugi etap- elektroforeza w SDS-PAGE czyli na żelu polikrylamidowym

Elektroforeza kapilarna umożliwia rozdzielenie anionów i kationów soli org. I nieorganicznych

7. Badania mikroskopowe: świetlny, elektronowy, fluoroscencyjny; mikrotom

Mikroskop świetlny-rozdzielczość 2um tworzy obraz powiększony, odwrócony i pozorny.

• Kontrastowo fazowy-przesuniecie amplitudy fali świetlnej, umożliwia obserwację komórek żywych

• Interferencyjny-interferencja promieni świetlnych przechodzących przez preparat, umożliwia obserwacje komórek żywych

• Fluorescencyjny-ultrafiolet jako źródło światła

Epifluorescencyjny- oświetlenie od góry, diafluorescencyjny- od dołu

• Konfokalny- źródłem światła jest laser który po kolei skanuje fragmenty komórek

Mikroskopy elektronowe- wykorzystuje wiązkę elektronów, zdolność rozdzielcza wynosi od 0,2 do 5 nm, umożliwia oglądanie nawet pojedynczych cząsteczek białkowych

• Transmisyjny

• Skaningowy- obserwacja powierzchni komórki

Mikrotom- urządzenie służące do krojenia na małe skrawki bloczków parafinowych

8. Fluorescencyjna hybrydyzacja „in situ”, fluorofory

Umożliwia wykrycie w komórce fragmentu DNA lub RNA. Wykorzystuje zajawisko hybrydyzacji kwasów nukleinowych, czyli wysoce swoistego łączenia się pojedynczych łańcuchów kwasów pochodzących z różnych źródeł.

Sonda- odcinek jednoniciowy DNA komplementarny do szukanego. Sonda jest znakowana fluorochromami (znacznikami antygenowymi które można następnie wykryć stosując metody immunocytochemiczne.

Materiał poddajemy działaniu wysokiej temperatury, aby spowodować denaturację kwasów nukleinowych, następnie inkubuje się skrawki tkanek w roztworze sondy która wiąże się z wykrywanym odcinkiem kwasu nukleinowego, na końcu uwidaczniamy znacznik sondy za pomocą metody immunochemicznej lub autoradiografię

Fluorofory- absorbują energię o określonej dł fali emitują inną dł. Fali

Zielone- fluoresceina ( wzbudzana światłem niebieskim)

Czerwone- rodamina

9. Cytochemia,immunocytochemia, immunoelektroforeza

Cytochemia- opiera się na reakcjach zachodzących między odpowiednio dobranymi dla danej reakcji cytochemicznej substratami substratami wykrywanym w komórkach związkiem chemicznym

Immunocytochemia- opiera się na bardzo wysokiej swoistości wiązania antygenu z przeciwciałem. Cząsteczka przeciwciała rozpoznaje i wiąże tylko konkretny antygen (jest nim zazwyczaj jakieś białko lub jego fragment)

Aby uwidocznić miejsce wiązania czyli lokalizację danego białka, przeciwciała są znakowane, czyli przyłącza się do nich substancje widoczne w obrazie mikroskopowym;

• Fluorochromy (fluorsceina, rodamina)-dają fluorescencje o różnych barwach, immunoflourescencja

• Enzymy (peptydaza, fosfataza zasadowa)-ich lokację uwidacznia się za pomocą dodatkowych reakcji cytochemicznych

• Matale ciężkie (złoto koloidalne) widoczne jako wyraźne czarne ziarenka

Immunoelektroforeza

10. Autoradiografia

Autoradiografia-metoda wykrywania izotopów promieniotwórczych, wykorzystując ich zdolność do zaczerniania emulsji światłoczułych.

Do badania;

• Procesów metabolicznych

• Dynamiki podziałów komórkowych

• Procesów różnicowania komórek

11. Cytometria przepływowa

Cytometria przepływowa- matoda oceny właściwości fizycznych chemicznych komórek które pojedynczo przepływają przez miejsce pomiaru, przecinając wąski strumień światła, który zostaje rozproszony w zależności od wielkości komórki, jej kształtu oraz właściwości optycznych cytoplazmy. Wywołuje także świecenie fluorochromów jeśli komórki były nimi uprzednio znakowane

Do badania;

• Kształtu i wielkości komórek

• Zawartość DNA

• Obecność określonych białek, cukrowców genów

• Przepuszczalność błon i aktywność receptorów

• Ocena właściwości komórek nowotworowych

12. Łańcuchowa reakcja polimerazy - PCR

Metoda umożliwiająca wykrycie i identyfikację śladowych ilości kwasów nukleinowych, nukleinowych przypadku gdy inne metody nie są wystarczająco czułe. Wykorzystuje enzym replikujący DNA czyli polimerazę i polega na przeprowadzeniu w badanym materiale wielu następujących po sobie cykli syntezy DNA.

Do reakcji wprowadza się:

Matrycowy DNA

Tiofosforany deoksyrybonukleotydów

Startery (primery)

W temp. Wyższej zachodzi denaturacja wstępna a w niższej wiązanie starterów

---