Biblioteki wykorzystywane do klonowania DNA
selekcja bezpośrednia - gdy klonowana sekwencja nadaje organizmom charakterystyczny fenotyp (możliwy do zaobserwowania) to możemy wyselekcjonować te klony.
selekcja immunologiczna -
Do selekcji klonu można też wykorzystać metody hybrydyzacyjne - wtedy ta sekwencja nie musi ulegać ekspresji, ale trzeba dysponować narzędziem do detekcji (sonda, którą trzeba wcześniej uzyskać → można stosować sondy z innych gatunków → im bardziej odległe filogenetycznie tym mniejsza szansa na sukces) → też przenosimy na błonę, ale doprowadzamy przy tym do lizy komórki i eksponujemy materiał genetyczny.
biblioteki genomowi wykorzystujemy do sporządzania map fizycznych genomów. A gdy mapy sporządzone można je wykorzystać do sekwencjonowania genomów (przez sekwecjonowanie klonów).
biblioteka cDNA jest zubożona o sekwencji, które nie ulegają ekspresji.
Sekwencje niekodujące z reguły to jakby sekwencje balastowe (nieinteresujące w większości przypadku), tak jakby rozcieńczają docelową sekwencje.
WEKTORY KOSMIDOWE [skrzyżowanie sekwencji cos z faga z plazmidem] - plazmidy z wprowadzoną sekwencją cos → sprawdzić jakiś schemat tego cyklu!
Kosmid nie funkcjonuje jak wirus → cyrkularyzuje się i w tej sposób się namnaża → klony rekombinantowe rosną jako kolonie.
→ jest zysk na pojemności → do kosmidów można więcej wsadzić [wielkość wstawki 40kpz jest zbyt mała
wektory o jeszcze większej pojemności - YACi → pYAC [plazmidowy sztuczny choromosom drożdżowy] → typ wektorów wahadłowych → mogą funkcjonować w kom. 1+ gospodarza. 1 gospodarz to drożdże, drugi E. coli → w E. coli w postaci plazmidu → przez to musi mieć podstawowe sekwencje plazmidowe.
ARS - sekwencja automatycznej replikacji.
marker TRP1, URA3, HIS3 → markery selekcyjne, o innym działaniu → są to sekwencje, które działają na zasadzie komplementacji mutacji auksotroficznej.
Ten szczep drożdży nie może funkcjonować na minimalnej pożywce → one same nic nie sytetyzują, unless wprowadziny im te markery sekwencyjne (TRP1, URA3, HIS3) → dlatego komplementacja.
Jeszcze do tego sekwencja CEN4 → odpowiada za prawidłową segregacje YACa do komórek potomnych.
2 sekwencje TEL (telomerowe) oddzielone markerem selekcyjnym. Ma jeszcze sekwencję SUP4 (marker selekcyjny) → pozwala na selekcję klonów rekombinantowych.
YAC: izolujemy żądany plazmid (z bakterii) → plazmid trawimy restrykcyjnie enzymami (BamH1 i EcoR1) → w efekcie trawień generowane dwa ramiona YAC (na każde składają się sekwencje telomerowe, każde posiada marker selekcyjny i fragment markera selekcyjnego (przecięty) pozwalający na selekcje rekombinantów) → preparat ramion poddajemy ligacji z DNA, które chcemy wsadzić → w szczególnym przypadku produktem powinna być cząst. liniowa z dołączonymi oboma ramionami → i tym transformujemy komórki drożdży → selekcjonujemy je na pożywkach minimalnych (bez Trp i uracylu) → to, co wyrasta na tej pożywce musi mieć sekwencje TRP1 i URA3 → więc to na pewno posiada 2 ramiona → żeby sprawdzić, czy posiada insert [* sekwencja insertu wykorzystuje zjawisko supresji mutacji
w YACu możemy klonować fragmenty do 1 mln pz → w kom. drożdży są liniowe i symulują działanie chromosomów → dlatego YAC.
Przez pojemność YACi (wypierane już przez BACi) wykorzystywane są (były) do budowy bibliotek genomowych u organizmów eukariotycznych.
zalety:
→ żeby znaleźć żądaną sekwencję trzeba przejrzeć mniej klonów
GENOM można zdefiniować jako w szczególnym przypadku jako komplet chromosomów danego organizmu [ale to nie jest takie proste]
Genomy można podzielić na:
genomy DNA
genomy RNA → jest typem bardziej pierwotnym, ale występuje już teraz sporadycznie.
Genotyp - jest to pojęcie węższe od „genom” → odnosi się do składu allelicznego danego organizmu/komórki → zwykle ten skład alleliczny, zazwyczaj używa się do jednego locus/kilku loci.
Genomy mogą być koliste, koliste i liniowe, genom rozdzielony na populacje cząsteczek (na cząst. subgenomowe → zarówno koliste jak i liniowe).
Chromosom - ta cząsteczka, która zawiera sekwencje niezbędna dla funkcjonowania komórki
Plazmidy - replikony pozachromosomowe → z reguły ich informacja ma charakter nadmiarowy w komórce → może dawać przewagę selekcyjna (np. w obecności antybiotyku), ale zasadniczo komórki mogą się bez nich obyć.
Megaplazmidy - są przejawem wieloczęściowej struktury genomu. Mają miejsce początku replikacji typu plazmidowego i mogą zawierać sekwencje niezbędne dla funkcjonowania komórki bakteryjnej.
Wielkość genomu z reguły to kilka mln par zasad., ale mogą mieć dużo mniej (wyzbyły się sekwencje), bo ich funkcje spełnia organizm gospodarza.
Liczba genów to klika tysięcy. Są uorganizowane w operony → geny spełniające pokrewne funkcje są zebrane w grupy, których ekspresja podlega wspólnej regulacji.
(…)
Pętla powstaje tak, że pewne sekwencje DNA są spinane poprzez odpowiednie białka [stanowią one klamrę izolującą fragment genomu w kształcie pętli]
Superzwoje - jeżeli w stosunku do naturalnego skrętu dokręcimy/odkręcimy ilość to w cząst. powstają napięcia - normalne obrót końca cząst. te napięcia relaksuje. Gdy unieruchomione końce nie ma możliwości relaksowania i powstają superzwoje.
Normalnie liczba opleceń jest wartością stałą.
L = T + W.