Paulina Krzemińska 30.11.2011r.

Sprawozdanie z ćwiczenia 4:
Frakcjonowanie i oznaczanie białek mleka.

1. Etapy procesu:

1. Wytrącanie kwasem octowym kazeiny, a następnie jej odsączenie (stanowi ok. ¾ białek mleka, więc musimy się jej pozbyć, aby później móc dokładnie oznaczyć zawartość albumin i globulin); w przesączu znajdowało się 25 ml serwatki.

2. Wytrącenie osadu globulin roztworem (NH₄)₂SO₄ i odwirowanie go w celu oddzielenia go od albumin.

3. Dalsze nasycanie roztworu znad osadu, prowadzi do wytrącenia się osadu albumin, które również odwirowujemy.

2. Oznaczanie białek metodą Bradforda:

Jest to spektrofotometryczna metoda opierająca się na krzywej kalibracyjnej, którą tworzymy na podstawie pomiarów roztworów o znanych stężeniach, przy uprzednim pomiarze tła (roztwór soli fizjologicznej z barwnikiem).

Tworzymy roztwory białek w soli fizjologicznej, które po dodaniu odczynnika barwiącego Bio-Rad Protein Assay zmieniają kolor. Zmiana barwy polega na oddziaływaniu głównie z argininą, w mniejszym stopniu z innymi zasadowymi aminokwasami. Absorbancję mierzymy dla długości fali równej 595 nm.

3. Oznaczenie zawartości albumin i globulin:

Albuminy:

Przeprowadziliśmy dwie serie pomiarów krzywej kalibracyjnej, ale jedną odrzuciłam z powodu gorszej liniowości przebiegu.

Objętość dodanego wzorca [l]	Absorbancja	Stężenie [g/l]
1	0,075	0,0020
2	0,091	0,0040
4	0,249	0,0079
6	0,369	0,0118
8	0,433	0,0157
10	0,550	0,0196

Stężenia albumin w poszczególnych próbkach obliczyłam według schematu:

Poniższy wykres przedstawia krzywą kalibracyjną wraz z jej równaniem:

Absorbancja mojej próbki wynosiła 0,107, więc jej stężenie to 0,00339 [g/l].

Globuliny:

W poniższej tabeli zestawiamy wyniki pomiarów spektrofotometrycznych lepiej dopasowanej krzywej dla globulin:

Absorbancja	Stężenie [g/l]
-0,09	0,0011
0,038	0,0022
0,058	0,0044
0,096	0,0066
0,178	0,0088
0,181	0,0110

Stężenie liczyłam taką samą metodą jak dla albumin, z tym, że stężenie globulin wynosiło 1,11 [g/l]

Krzywa kalibracyjna dla globulin (odrzuciłam drugi i ostatni punkt):

Absorbancja mojej próbki wynosiła 0,191, więc z równania krzywej wynika, iż jej stężenie wynosi 0,00911[g/l].

Obie próbki były wielokrotnie rozcieńczone, więc ich prawdziwe stężenie w mleku jest inne, niż powyżej przedstawione. Aby obliczyć prawdziwe stężenie białek musimy uwzględnić:

• rozcieńczenie przy dodawaniu odczynnika (1000 ml/800ml, czyli 1,25-krotne),

• rozcieńczenie przed dodaniem odczynnika barwiącego (globuliny 20-krotne, a albuminy 40-krotne),

• osady globulin i albumin rozcieńczałam w 5 ml roztworu soli fizjologicznej (dzięki tej informacji jestem w stanie obliczyć masę białek w próbce,

• otrzymana masa białek pochodziła z 3 ml serwatki, więc jestem w stanie policzyć zawartość białek w całej serwatce (25 ml) :

Aby obliczyć zawartość procentową w mleku, muszę znać masę 25 ml mleka. Gęstość mleka to 1,028[g/ml]:

---