ANALIZA I OCENA JAKOŚCI ŻYWNOŚCI

Literatura:

„Wybrane metody badania składu i wartości odżywczej żywności”, red. Urszula Rutkowska

„Badanie jakości produktów spożywczych” Maria Krełowska - Kułas

„Analiza żywności” Gronowska - Senger (skrypt)

WYKŁAD 1 7.10.2008

Zadania analizy żywności:

• Określenie zawartości składników pokarmowych w surowcach, półproduktach, wyrobach gotowych

• Kontrola jakości produkcji i przetwórstwa żywności

Działy analizy żywności:

• Analiza sensoryczna - za pomocą zmysłów, organoleptyczna

• Analiza składu chemicznego - metody chemiczne, enzymatyczne, instrumentalne

• Analiza mikrobiologiczna - liczba i rodzaj drobnoustrojów występujących w żywności

Akty prawne regulujące

Ze względu na szczególną rolę produkty żywnościowe podlegają opiece państwa i określonym ustawom

Dz. U. Nr171, poz. 1225 z 2006r., 25 sierpnia 2006r.

Ustawa określa:

• Wymagania zdrowotne żywności

• Wymagania dotyczące przestrzegania zasad higieny: żywności, materiałów i wyrobów przeznaczonych do kontaktu z żywnością

• Właściwości organów w zakresie przeprowadzania urzędowych kontroli żywności

Normy:

• Wydaje Polski Komitet Normalizacyjny

• Komórki podwykonawcze - Normalizacyjne Komisje Problemowe

• Normami krajowymi są PN ustanawiane przez PKN, powstające na forum NKP, które odpowiadają za ich treść merytoryczną

Podział norm (pod względem treści merytorycznej)

• Jakościowe

• Precyzujące wymagania jakościowe dla danego produktu

• Metodyczne

• Szczegółowe procedury wykonywania oznaczeń zawartości składników

• Ocena cech badanych produktów

• Sposób pobierania próbek

Za normy międzynarodowe odpowiada

• Międzynarodowa Organizacja Standaryzacyjna (International Organisation for Standarisation - ISO)

• Komisja Kodeksu Żywnościowego FAO/WHO (Codex Alimentarius Commision)

• Stowarzyszenie Urzędowych Chemików Analityków

Normy nie są stałe, są uzależnione od dopływu wiedzy, wymagań w zakresie

• Jakości produktów

• Jakości analiz itp.

Nadzór nad żywnością

• Zajmuje się Państwowa Inspekcja Sanitarna

• Organem wykonawczym są:

• Państwowy Zakład Higieny (PZH)

• Stacje sanitarno - epidemiologiczne (wojewódzki lub miejski)

• Inspekcja weterynaryjna (dot. produktów zwierzęcych)

Stacje sanitarno - epidemiologiczne zależne od PZH posiadające działy higieny żywienia i żywności

BŁĘDY

Błąd - rozbieżność między uzyskanym wynikiem oznaczenia, a rzeczywistą zawartością oznaczanego składnika w badanym materiale

• Wynik niedoskonałości metod analitycznych, stosowanych przyrządów pomiarowych i osób wykonujących oznaczenie

Błąd bezwzględny - równy wartości bezwzględnej różnicy dokładnej wartości x i otrzymanej y

X-Y = +/- Z

X- zawartość teoretyczna

Y - zawartość składnika otrzymana w produkcie

Błąd względny - miernik dokładności oznaczania w procentach

Z/X *100%

Błędy w analizie

Błędy systematyczne - najczęściej spowodowane czynnikiem działającym w jednakowy sposób w czasie wieloktrotnego powtarzania tego samego pomiaru

• Na ogół tego samego znaku, tzn dodatnie lub ujemne

• Przyczyny: np. niewłaściwe wyskalowanie przyrządów pomiarowych, przygotowanie próbek, sączenie, ważenie, przygotowywanie roztworów wzorcowych itp.

Błędy przypadkowe - dodatnie lub ujemne, których przyczynę trudno ustalić i eliminować

• Rozrzucone po obu stronach wartości prawdziwej

• Częściowo wzajemnie znoszące się i działające w sposób przypadkowy

• Mierzy się odchyleniem standardowym SD i współczynnikiem zmienności V

Błędy grube (pomyłki) - wynik niedostatecznej uwagi analityka przy wykonywaniu analizy, zapisywaniu i obliczaniu wyników

Mierzona wartość = wartość prawdziwa + błąd systematyczny + błąd przypadkowy

ZASADY POBIERANIA I PRZYGOTOWYWANIA PRÓBEK DO BADAŃ LABORATORYJNYCH

Warunkiem dokładności analizy jest prawidowe pobranie i przygotowywanie próbki produktu

• Reprezentatywnej pod względem chemicznym i fizycznym

• Odpowiednio jednorodnej (rozdrobnionej, rozmieszczonej bądź zhomogenizowanej)

Przygotowanie próbki laboratoryjnej poprzedza przygotowanie próbek

• Pierwotnej pobranej jednorazowo, z 1 miejsca produktu opakowanego lub nieopakowanego

• Jednostkowej - powstałej z połączenia próbek pierwotnych pobranych z jednego opakowania jednostkowego

• Ogólnej - otrzymanej z połączenia próbek jednostkowych

• Laboratoryjnej - powstałej przez dokładne wymieszanie próbek ogólnych i ich zmniejszenie (metoda koperty - dzielenie na przekątne, odrzucanie 2 skrajnych części, z pozostałych 2 formowanie i ponowne dzielenie aż do uzyskania odpowiedniej ilości)

Dla każdej grupy produktów spożywczych istnieją odrębne, ujęte zarządzeniami (PN) przepisy regulujące zasady pobierania i przygotowywania próbek przez zawodowo przygotowanych ekspertów, maklerów, dysponujących odpowiednimi przyrządami

Liczba próbek jednostkowych zależy od:

• Wielkości partii towaru

• Stopnia jednorodności produktu; należy przestrzegać proporcjonalnego udziału w próbce wszystkich części danego produktu

• Złożonej precyzji badań

Pobieranie próbek pierwotnych z partii produktów w małych opakowaniach (zawartych w opakowaniach zbiorowych)

• Dla produktów zawartych w opakowaniach jednostkowych do 100 g lub 100 cm3 próbkę pierwotną może stanowić 1 opakowanie

• Losowe pobieranie próbek pierwotnych można przeprowadzić za pomocą liczb przypadkowych, bądź za pomocą losowania „na ślepo”

Z produktów sypkich przesyłanych luzem lub w jednostkowych opakowaniach przeładowywanych za pomocą urządzeń o działaniu ciągłym, próbki pierwotne pobiera się z całego strumienia produktu, w jednakowych odstępach czasu lub z jednostek ruchu

Z produktów ciekłych pobiera się za pomocą szklanych lub metalowych rurek zwężonych u dołu i zamykanych u góry, podczas ciągłego przepływu cieczy, jednakowe jej objętości w określonych odstępach czasu

Z produktów półstałych, gęstych, lepkich (np. masło, miód) pobiera się próbki ze zbiornika, po dokładnym wymieszaniu, za pomocą świdra rynienkowego lub odpowiednich miarek

Przy pobieraniu i przygotowywaniu próbek do oznaczania zawartości

wody i składników odżywczych

• Należy skrócić czas mieszania i rozdrabniania produktów

• Unikać przegrzania homogenizatorów

• Przechowywać próbki w czystych, szczelnie zamkniętych naczyniach w odpowiednich temperaturach

Witamin

• Należy zabezpieczyć próbki przed ogrzewaniem, światłem, tlenem

• W przypadku próbek przeznaczonych do oznaczania witaminy C dodać kwasu szczawiowego (kwas askorbinowy trwały w środowisku kwaśnym)

Składników mineralnych

• Należy zwrócić uwagę na stosowanie odpowiednich młynków, noży, homogenizatorów ze względu na możliwość zanieczyszczeń

Uwagi ogólne:

• Próbki produktów należy pobierać szybko i w taki sposób, aby jakość i skład produktów nie zmieniły się

• Próbki z produktów ziarnistych poddaje się sproszkowaniu przez mielenie w młynkach lub rozcieranie w moździerzu

• Produkty zawierające większe ilości wody rozdrabnia się w szarpakach nazywanych „wilkami” lub ściera na tarkach

• Produkty płynne przed odmierzeniem powinny być dokładnie wymieszane przez wstrząsanie, natomiast substancje o konsystencji mazistej mogą być pobierane bezpośrednio lub rozcierane w moździerzu

• Opakowania bezpośrednie próbek powinny być czyste, a próbka natychmiast szczelnie zamknięta

• Do próby należy brać ½ ilości substancji, a ½ zostawić na wypadek błędów czy niedokładności pomiarów (zrobić kolejne 3 próby)

Opisanie próbek

• Nazwa produktu

• Data pobrania

• Nazwiska i podpisy osób pobierających

• Data produkcji

• Nr partii

• Nazwa producenta

• Wielkość partii

• Itp.

WYKŁAD 2 14.10.2008

Produkt spożywczy:

• Woda

• Sucha masa

• Białko

• Aminokwasy

• Tłuszcze

• Kwasy tłuszczowe

• Węglowodany

• Rozpuszczalne i nierozpuszczalne w wodzie

• Popiół

• Składniki mineralne

OZNACZANIE ZAWARTOŚCI WODY/SUCHEJ MASY

Zawartość wody w %

Produkt	Zawartość wody
Oleje i tłuszcze jadalne	Do kilku - kilkunastu
Produkty zbożowe, mąki	10-20
Pieczywo	30-50
Produkty mięsne, mięso	60-70
Ryby	70-80
Warzywa i owoce, mleko	80-90
Soki owocowe, grzyby	90-95

Z analitycznego punktu widzenia zawartość wody w produkcie spożywczym jest to taka ilość wody, jaką można w nim oznaczyć każdą z dostępnych i dla danego produktu właściwych metod

Sucha masa - pozostałość po usunięciu wody z produktu spożywczego; s.m. + woda = 100%

Procesowi temu towarzyszy ulatnianie się niektórych substancji, np. olejków eterycznych, alkoholi, lotnych kwasów

Ilość wody wywiera wpływ na:

• Jakość produktu

• Wartość odżywczą

• Trwałość przechowalniczą

W produktach spożywczych woda występuje jako woda wolna i woda związana

Woda wolna:

• Stanowi rozpuszczalnik substancji organicznych i mineralnych

• Wypełnia wolne przestrzenie i nie podlega zjawiskom kapilarnym

• Bierze bezpośredni udział w przemianach fizykochemicznych

Woda związana:

• Higroskopijna (zaadsorbowana) - powlekająca bardzo cienką warstwą powierzchnie wolne produktu

• Kapilarna - występuje w naczyniach kapilarnych

• Krystaliczna

• Konstytucyjna - chemicznie związana

Można wydzielić wodę wolną i higroskopijną.

Woda związana nie bierze udziału w ciśnieniu osmotycznym

Sucha masa całkowita - otrzymana przez suszenie produktu w określonych warunkach

Sucha masa rozpuszczalna w wodzie - ekstrakt

Metody oznaczania suchej masy lub wody

• Suszenie termiczne w różnych warunkach ciśnienia i temperatury

• Metoda destylacji azeotropowej

• Pomiar stałej dielektrycznej

• Metody densymetryczne

• Metody refraktometryczne

• Pomiar rezonansu jądrowo - magnetycznego

• Metody chemiczne

Suszenie termiczne - polega na wydzielaniu wody z próbki. Prawidłowość wyników zależy od:

• Składu chemicznego i właściwości badanego produktu

• Temperatury procesu suszenia

• Czasu suszenia

• Ciśnienia

• Sposobu przygotowywania próbki

SKRYPT (sposób i warunki w zależności od rodzaju produktu)

• W produktach nie zawierających związków wrażliwych na wysoką temperaturę, lub zawierających je w niewielkiej ilości - bezpośrednie suszenie w T 130 st.C

• W produktach zawierających duże ilości cukrów prostych lub innych termolabilnych związków - suszenie w obniżonym ciśnieniu w temperaturze odpowiednio niższej przy zastosowaniu związków pochłaniających wodę (np. chlorek wapnia)

• W produktach zawierających duże ilości białek, cukrów prostych i dekstryn - suszenie próbek ze wstępnym podsuszaniem w T 60 st.C, po zmieszaniu z piaskiem (mięso, sery) lub z zastosowaniem pasków bibuły filtracyjnej zwiększającej powierzchnię parowania, a następnie dosuszanie w T 100-105 st.C

• W produktach na wpół ciekłych - dwukrotne potraktowanie alkoholem i odparowanie na łaźni wodnej, dosuszanie w T 100-105 st.C

• W sokach, przecierach owocowych i warzywnych - wstępne podsuszenie na łaźni wodnej, dosuszanie w T 100-105 st.C

Przekroczenie temperatury 105 st.C podczas dosuszania powoduje, że pęka wiązanie glikozydowe w cukrach złożonych takich jak sacharoza czy laktoza, z przyłączeniem wody nieprawidłowość wyników

Wykonywanie:

• Próbki odważa się na wadze analitycznej do naczynek wagowych wysuszonych i zważonych z dokładnością do 0,0001 g.

• Produkty spożywcze o dużej zawartości wody powinny być poddane wstępnemu suszeniu w temperaturze 50-60 st.C, a następnie suszeniu właściwemu

• Próbki do czasu wystudzenia, przed każdym ważeniem są przechowywane w eksykatorach wraz z czynnikiem pochłaniającym wilgoć (np. krzemionką SiO2)

• Suszenie uważa się za zakończone, gdy różnica dwóch następujących po sobie ważeń nie przekracza 0,002g (a nie 0,001g ?)

Destylacja azeotropowa - SKRYPT!!!)

Polega na wydzieleniu wody z badanego materiału w drodze drstylacji z rozpuszczalnikami organicznymi o temperaturze wrzenia powyżej 100 st.C oraz mniejszej gęstości, nie mieszającymi się z wodą, lecz tworzącymi z nią tzw mieszaniny azeotropowe

Stosowane są takie rozpuszczalniki, jak:

• Toluen (111 st.C, 0,867 g/cm3)

• Ksylen (140 st.C, 0,862 g/cm3)

Oznaczanie przeprowadza się w specjalnych aparatach, gdzie skroplony w chłodnicy destylat jest odbierany w kalibrowanej probówce i rodzielany na 2 warstwy.

Metoda ta może być stosowana do oznaczania zawartości wody w produktach nie ulegających rozkładowi w temperaturze wrzenia danego rozpuszczalnika oraz do produktów nie zawierających składników lotnych rozpuszczalnych w wodzie po oddestylowaniu. Badany produkt powinien zawierać nie mniej niż 0,5 i nie więcej niż 40% wody.

Pomiar stałej dielektrycznej - wprowadzanie próbki między okładki kondensatora i mierzenie jego pojemności elektrycznej

Metody densymetryczne - mierzenie gęstości roztworu podstawowego, przeliczanie na podstawie specjalnych tablic na zawartość wody i suchej masy. Stosowane do oznaczania ilości wody w produktach, w których jeden składnik (np. cukry) może występować w różnych ilościach (np. marmolady, dżemy, miody)

Metody refraktometryczne - pomiar współczynnika załamania światła (refrakcji), zależącego od długości fali padającego światła, rodzaju substancji i jej stężenia w badanym środowisku. Przeprowadza się w określonej temperaturze, lub uwzględnia odpowiednią poprawkę.

Metoda Fischera - bezpośrednie miareczkowanie w specjalnym zestawie, metanolowego roztworu próbki badanego produktu odczynnikiem Fischera (metanolowy roztwór jodu, dwutlenku siarki, pirydyna) do zaniku barwy jodu

H2O + I2 + SO2 + 3 C5H5N + CH3OH 2 C5H5NHI (jodowodorek pirydyny) + C5H5NSO4HCH3 (siarczan pirydynometylowy)

Warunkiem prawidłowych wyników jest nieobecność w produkcie innych substancji mogących reagować ze składnikami odczynnika

Metoda z węglikiem wapnia (karbidem)

• Pomiar ilości wydzielonego acetylenu w reakcji CaC2 z wodą

• Pomiar w biurecie gazometrycznej

• Zmierzoną objętość acetylenu sprowadza się do warunków normalnych - temperatura 0 st.C, ciśnienie 760 mmHg wg odpowiednich wzorów, po czym oblicza się zawartość wody

• Metoda daje dokładne wyniki w przypadku próbek o wysokiej zawartości wody, natomiast nie może być stosowana do produktów o zawartości wody poniżej 1%

OZNACZANIE ILOŚCI BIAŁKA

Zawartość białka a produktach spożywczych

Produkt	Zawartość białka
Nasiona roślin strączkowych (suche)	21-34
Sery twarogowe i podpuszczkowe	10-29
Mięso i przetwory	7-28
Ryby i przetwory rybne	10-27
Mleko w proszku pełne	27
Jaja kurze całe	12
Mąki i kasze	6-16
Pieczywo	4-9
Owoce i warzywa świeże	0,4-7
Mleko krowie	3-4

Oznaczanie zawartości azotu białkowego i niebiałkowego

Wszystkie substancje azotowe składają się na tzw azot ogólny

Azot ogólny

Azot białkowy - białek oraz produktów rozpadu białek (polipeptydów, peptonu)

Azot niebiałkowy - substancje azotowe niebiałkowe należące do różnych grup chemicznych związków organicznych

• Jony amonowe, amidowe, aminowe, bądź iminowe

• Azotany, azotyny

• Azot aromatyczny pierścieni heterocyklicznych

Metody stosowane do rozdziału tych frakcji opierają się na:

• Wytrąceniu białek z roztworu

• Jonami metali ciężkich (miedzi II, żelaza III, cynku II, kadmu II)

• Kwasami (fosfo-V-wolframowym, trichlorooctowym, metalofosforowym V)

• Kwasami garbnikowymi - taniną

• Alkoholem etylowym (70% lub więcej)

• Wysoką temperaturą (80 st.C przez 10 min)

• Oddzieleniu osadu

• Określeniu ilości azotu w osadzie (azot białkowy) i przesączu (azot niebiałkowy)

Ilościowe oznaczenie zawartości białka przeprowadza się metodami:

• Bezpośrednimi - polegają na wytrącaniu białka z roztworu i wagowym oznaczeniu wytrąconego osadu lub na oznaczeniu np. refraktometrycznym czy kolorymetrycznym

• Pośrednimi - opierającymi się na ilościowym oznaczeniu zawartości azotu i przeliczeniu go na białko

(Pod warunkiem, że produkty te nie zawierają dużych ilości związków niebiałkowych, np. ziemniaki)

Metody bezpośrednie:

• Metoda biuretowa (kolorymetryczna)

• Metoda Lovry'ego (kolorymetryczna)

• Metody oparte na wbudowywaniu barwników (kolorymetryczna)

• Metoda immunoenzymatyczna (ELISA)

Metoda biuretowa

• Polega na oznaczeniu białek i peptydów zawierających co najmniej 2 wiązania peptydowe, które tworzą w środowisku alkalicznym barwne kompleksy z jonami miedzi

• Intensywność powstałego fiołkowego zabarwienia jest proporcjonalna do stężenia białka

Metoda Lovry'ego

• Polega na pomiarze absorbancji będącej wynikiem 2 reakcji

1. Biuretowej polegającej na przyłączeniu jonów miedzi do wiązań peptydowych

2. Redukcji odczynnika fosforomolibdeno-fosforowolframowego (odczynnik Folina - Ciocalten'a) przez obecne w białku aminokwasy tyrozynę i tryptofan

• Metoda ta jest około 100x czulsza od metody biuretowej

WYKŁAD 3 21.10.2008

Metody oparte na wbudowywaniu barwników

• Polegają na ilościowym wbudowywaniu do białek barwników organicznych dodanych w nadmiarze (oranż G, czerń amidowa 10B) w wyniku czego tworzą się nierozpuszczalne kompleksy, które mogą być odwirowane lub oddzielone przez sączenie od reszty roztworu; mierzy się natężenie barwy pozostałego roztworu, zależne od ilości barwnika niezwiązanego z białkiem

• Zasada metody została wykorzystana w konstrukcji aparatu Pro-Milk

Metoda immunoenzymatyczna (ELISA)

• Polega na tworzeniu połączeń specyficznych przeciwciał z oznaczanym białkiem oraz odpowiednim enzymem, który reagując z bezbarwnym substratem przeprowadza go w barwny związek; natężenie barwy oznacza się spektrofotometrycznie przez porównanie z roztworem wzorcowym;

• Metoda ta pozwala na oznaczenie zarówno zawartości białek, jak i stopnia ich denaturacji

Metoda Kjeldahla

• Polega na mineralizacji badanej substancji we wrzącym kwasie siarkowym, w wyniku czego białka ulegają utlenieniu do CO2 i H2O. Azot grup aminowych białek uwalnia się w postaci amoniaku i wiąże z kwasem siarkowym. Po zalkalizowaniu próby amoniak oddestylowuje się do kwasu borowego, a następnie odmiareczkowuje mianowanym roztworem kwasu solnego lub siarkowego. Analiza przebiega w następujących etapach:

• Mineralizacja próby

• Destylacja amoniaku z parą wodną

• Miareczkowanie

Mineralizacja - spalanie związków organicznych, polega na intensywnym ich utlenieniu i przekształceniu substancji organicznej w nieorganiczną. Zachodzą tu następujące procesy

• Rozkład kwasu siarkowego z uwolnieniem tlenu (dlatego NIE MOŻE być użyty HCl - nie jest kwasem utleniającym, a kwas siarkowy użyty jest jako główny czynnik utleniający białko)

2 H2SO4 (T)2SO2 + O2 + 2H2O

• Utlenienie substancji organicznych z uwolnieniem dwutlenku węgla, wody i amoniaku; dwutlenek węgla i para wodna ulatniają się, a NH3 zostaje związany z kwasem siarkowym (patrz następny ppkt)

R(NH2)COOH + nO2 TEMP, KAT xCO2 + yH2O + zNH3

• Przechodzenie amoniaku w siarczan amonowy

NH3 + H3BO3 (NH4)2SO4

Destylacja amoniaku - odbywa się w warunkach podwyższonej temperatury i nadmiaru zasady. Zasada (NaOH) użyta jest w celu ponownego uwolnienia NaOH z siarczanu amonowego i oddestylowania go z parą wodną.

(NH4)2SO4 + 2NaOH TEMP Na2SO4 + 2H2O + 2NH3

Wydzielony amoniak jest wiązany w nadmiarze kwasu borowego

NH3 + H3BO3 (NH4)H2BO3

A następnie miareczkowany mianowanym roztworem kwasu solnego (lub siarkowego)

(NH4)H2BO3 + HCl NH4Cl + H3BO3

2 (NH4)H2BO3 + H2SO4 (NH4)2SO4 + 2H3BO3

Po oznaczeniu zawartości azotu na podstawie miana kwasu solnego musimy przeliczyć tą ilość na zawartość białka. Stosuje się do tego współczynnik, który zależy od zawartości azotu w danym białku. Dla białek, w których jest około 16% azotu, współczynnik ten wynosi 6,25 (100% białka/16% azotu = 6,25). Dla pozostałych białek współczynnik wyznacza się doświadczalnie lub posługuje się istniejącymi tabelami, np.

• Mleko i produkty mleczne - 6,38

• Mięso i przetwory, ryby, drób - 6,25

• Fasola - 6,00

Metoda Kofranyi

• Substancja białkowa, ogrzewana w środowisku zasadowym, wydziela określoną ilość azotu w postaci NH3, który może być oddestylowany i związany z kwasem podobnie jak w metodzie Kjeldahla w zestawie destylacyjnym Parnasa - Wagnera

• Amoniak powstaje przeważnie z glutaminy i asparaginy oraz rozkładu niektórych aminokwasów podczas gotowania substancji w środowisku zasadowym

• Metoda ta jest wykonywana bez uprzedniej mineralizacji próbki jak w metodzie Kjeldahla

• Metoda wymaga obliczenia empirycznego współczynników korelacji poprzez porównanie wyników otrzymanych metodą Kofranyi i Kjeldahla

Oznaczanie składu aminokwasowego

• Oznaczenie aminokwasów w produktach spożywczych można przeprowadzić za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

TŁUSZCZE

Zawartość tłuszczów w wybranych produktach spożywczych w g/100g części jadalnych

Tłuszcze jadalne (masło, margaryny, słonina, smalec, oleje roślinne, oliwa) - 75-100

Tłuszcze stołowe o obniżonej kaloryczności (margaryny „niskokaloryczne”) - 45-55

Produkty o bardzo dużej zawartości tłuszczu (śmietana kremowa, sery żółte, węgorz, metka, parówki, wafle nadziewane - 25-30

Produkty o dużej zawartości tłuszczu (wieprzowina, baranina, gęś, kaczka, kiełbasy, śledź, makrela, jaja, sery tłuste, śmietana, twaróg tłusty, pieczywo cukiernicze) - 10-25

Produkty o małej zawartości tłuszczu (polędwica, cielęcina, wołowina, kurczak, indyk, dorsz, ryby słodkowodne, produkty zbożowe, mleko pełne, lody, twarożki) - 3-10

Produkty o bardzo małej zawartości tłuszczu (mleko chude, twaróg chudy, kefir, jogurt, pieczywo, warzywa, owoce, grzyby) - 0-3

Tłuszcz surowy - suma naturalnych związków organicznych takich jak: glicerydy, wolne kwasy tłuszczowe, sterole, witaminy i barwniki rozpuszczalne w tłuszczach, fosfatydy, woski, a nierozpuszczalne w wodzie, które można wyekstrahować z produktu rozpuszczalnikami organicznymi (eter etylowy, eter naftowy, chloroform, benzen, aceton i inne) i które nie są lotne w temperaturze 105 C

Tłuszcze dzieli się na 3 zasadnicze grupy

• Tłuszcze proste - estry kwasów tłuszczowych i glicerolu (tłuszcze właściwe - triacyloglicerole, woski)

• Tłuszcze złożone - związki zawierające oprócz kwasów tłuszczowych i alkoholi również inne składniki (fosfolipidy, glikolipidy i inne)

• Pochodne tłuszczowe - pochodne tłuszczów prostych i złożonych, powstałe przede wszystkim w wyniku hydrolizy, zachowujące ogólne właściwości tłuszczów (kwasy tłusczowe, alkohole, węglowodory)

Metody oznaczania zawartości tłuszczu w produktach spożywczych

• Metody ekstrakcyjne (wagowe, np. Soxhleta, Weibulla Stoldta, refraktometryczne, densymetryczne)

• Metody objętościowe (kwasowe, np. Gerbera)

• Metody instrumentalne (NMR, NIR)

Metody ekstrakcyjne

Metody ekstrakcyjno - wagowe - polegają na

• Wysuszeniu próbki do stałej masy, bądź ewentualnie przeprowadzeniu hydrolizy produktu ułatwiającej wyodrębnienie frakcji tłuszczowej,

• Wydzieleniu frakcji tłuszczowej przez ekstrakcję za pomocą rozpuszczalnika tłuszczowego

• Oznaczeniu wagowym frakcji tłuszczowej

Metody ekstrakcyjno - wagowe mogą polegać na:

• Ekstrakcji rozpuszczalnikiem w nieokreślonej ściśle ilości

• Ekstrakcji określoną ilością rozpuszczalnika (metoda Grossfelda)

• Stosowaniu wielokrotnej ekstrakcji ciągłej (np. metoda Soxhleta, metoda Weibulla - Stoldta, metoda Puzanowa)

Metody polegające na ekstrakcji rozpuszczalnikiem w nieokreślonej ściśle ilości dzielą się na:

• Metody bezpośredniego traktowania rozpuszczalnikiem (metoda Kohmana)

• Metody wstępnego traktowania zasadami i następnie rozpuszczalnikiem (np. metoda Rosego - Gottlieba)

• Metody wstępnego traktowania kwasami, a następnie rozpuszczalnikiem (metoda Schmida - Bądzyńskiego - Ratzlaffa)

Metody ekstrakcyjno - wagowe należą do metod czasochłonnych, mimo to uznawane za najdokładniejsze i stosowane jako metody odwoławcze w stosunku do innych, szybszych, orientacyjnych metod.

Metoda Soxhleta

• Polega na wielokrotnej ciągłej ekstrakcji substancji tłuszczowej z rozdrobnionego i uprzednio wysuszonego w T 105 C produktu za pomocą eteru naftowego, odparowaniu rozpuszczalnika (NA ŁAŹNI WODNEJ!!!!! - NIE WOLNO odparowywać w suszarce!!!!) i wagowym oznaczeniu substancji tłuszczowej

• Masę wyizolowanego tłuszczu surowego oznacza się wagowo po odparowaniu eteru z odbieralnika i wysuszeniu frakcji tłuszczowej w T105 C przez 1 godzinę lub z różnicy mas gilzy z badanym produktem przed i po ekstrakcji

WYKŁAD 4 28.10.2008

Źródła błędów w metodzie Soxhleta

• Niedostateczne wysuszenie próbki

• Stosowanie rozpuszczalników nie pozbawionych wody, a w przypadku eteru naftowego również nadtlenków

• Woda rozpuszcza sole mineralne i inne substancje rozpuszczalne w wodzie zawarte w produkcie, które po przejściu do wyciągu eterowego i odparowaniu eteru zwiększają masę suchej pozostałości traktowanej jako tłuszcz surowy

• Nadtlenki powodują wysycenie tlenem nienasyconych kwasów tłuszczowych, przyczyniając się do zawyżenia wyników

Metoda Weibulla - Stoldta

• Polega na przeprowadzeniu hydrolizy za pomocą HCl w celu zniszczenia połączeń związków frakcji tłuszczowej z innymi substancjami, przeważnie białkowymi, oddzieleniu frakcji tłuszczowej od hydrolizatu, wysuszeniu na sączku, wyekstrahowaniu rozpuszczalnikiem w aparacie Soxhleta i oznaczeniu wagowym

• Rozkład związków tłuszczowo - białkowych może następować pod wpływem hydrolizy próbki w roztworach mocnych kwasów lub słabej zasady amonowej

• Jeżeli w badanym produkcie występują wolne kwasy tłuszczowe, to zastosowanie nawet słabej zasady amonowej prowadzi do błędnych wyników na skutek powstania mydeł amonowych

• Polecana do produktów, w których tłuszcz występuje w postaci połączeń białkowych lub w postaci zemulgowanej (mleko, sery, pieczywo, odżywki dla dzieci). Zniszczenie otoczek białkowych osłaniających kropelki tłuszczu umożliwia wydzielenie substancji tłuszczowej i ich oznaczenie

Źródła błędów w metodzie Weibulla - Stoldta

• Niedostateczne rozpuszczenie substancji białkowej (powstawanie grudek po dodaniu wody)

• Użycie nieodpowiednich sączków (sączki mogą zawierać substancje rozpuszczalne w eterze, należy oznaczyć ich zawartość w tzw próbie ślepej lub usunąć je za pomocą eteru

• Niedostateczne wysuszenie sączków

• Niedostateczne wyekstrahowanie tłuszczu

• Stosowanie rozpuszczalnika nieodpowiedniego do wymogów podanych w metodzie Soxhleta

Metoda Rosego - Gottlieba

• Polega na rozpuszczeniu substancji białkowej z mleka za pomocą amoniaku

• Wyekstrahowaniu rozpuszczalnikiem (eterem etylowym i eterem naftowym) uwolnionego z otoczek białkowych tłuszczu

• Odparowaniu rozpuszczalnika i oznaczeniu substancji tłuszczowej wagowo

• Uznana za oficjalną międzynarodową metodę wzorcową do oznaczania tłuszczu w mleku świeżym

• Nie jest wykorzystywana do oznaczania tłuszczu w produktach mlecznych, fermentowanych, zawierających wolne kwasy tłuszczowe, które mogłyby utworzyć z amoniakiem rozpuszczalne w wodzie sole amonowe

Metoda Schmida - Bądzyńskiego - Ratzlaffa

• Polega na rozpuszczeniu substancji białkowej za pomocą kwasu solnego; wyekstrahowaniu rozpuszczalnikiem uwolnionego z otoczek białkowych tłuszczu; oddestylowaniu lub odparowaniu rozpuszczalnika i oznaczeniu substancji tłuszczowej metodą wagową

• Znajduje zastosowanie do oznaczania tłuszczu w serach, posiłkach, daniach, wyrobach gastronomicznych i racjach pokarmowych

• Nie nadaje się do oznaczania tłuszczu w potrawach z jarzyn i potrawach mącznych

Metoda Grossfelda

• Polega na ekstrakcji tłuszczu z badanego produktu za pomocą trójchloroetylenu po uprzednim wygotowaniu próbki z kwasem solnym w celu przeprowadzenia hydrolizy; odparowaniu rozpuszczalnika i oznaczeniu substancji tłuszczowej wagowo

• Metoda ta znajduje zastosowanie, gdy nie ma warunków do pracy z rozpuszczalnikami łatwopalnymi

• Polecana do oznaczania tłuszczu w produktach zawierających znaczne ilości węglowodanów, np. w pieczywie, a także do oznaczeń tłuszczu w całodziennych racjach pokarmowych oraz wyrobach garmażeryjnych

Metody ekstrakcyjno - refraktometryczne

• Polegają na ekstrakcji tłuszczu z badanej próbki i oznaczeniu refrakcji otrzymanego wyciągu

• Zasada metod oparta jest na zmianie współczynnika załamania światła rozpuszczalnika zależnie od ilości rozpuszczonego w nim tłuszczu

• Tłuszcz obniża współczynnik refrakcji rozpuszczalnika, dlatego też stosuje się rozpuszczalniki o wysokim współczynniku załamania światła w stosunku do współczynnika refrakcji tłuszczu

• Jako rozpuszczalniki stosuje się benzynę, chloroform, octan amylu, octan butylu, jednochlorobenzen, nitrobenzen, anilinę

• Metody ekstrakcyjno - refraktometryczne są szybkie, łatwe do wykonania, tanie, charakteryzują się dużą powtarzalnością wyników, nadają się jednak do oznaczania tłuszczu w produktach zawierajacych nieduże ilości tego składnika

Metody ekstrakcyjno - densymetryczne

• Zasada metod polega na zmianie gęstości rozpuszczalnika w zależności od ilości rozpuszczonego w nim tłuszczu

• Polegają na wyekstrahowaniu tłuszczu z badanej próbki i oznaczeniu gęstości wyciągu tłuszczowego

• Zawartość tłuszczu odczytuje się z krzywych

• Jako rozpuszczalnik najczęściej stosuje się tetrachlorek węgla. Ma on dużą gęstość, małą lotność i jest dobrym rozpuszczalnikiem tłuszczowym

Metody objętościowe (butyrometryczne)

Do wydzielenia tłuszczu niezbędne jest jego uwlonienie z otoczek białkowych poprzez potraktowanie badanej próbki kwasem siarkowym oraz alkoholem izoamylowym, który zmniejsza przyczepność do szkła i ułatwia zgromadzenie się wydzielonego tłuszczu, jak też zapobiega tworzeniu się emulsji

Przy oznaczaniu tłuszczu w produktach mlecznych słodzonych metoda ta nie daje zadowalających wyników z powodu przechodzenia do tłuszczu produktów zwęglenia sacharozy, co powoduje silne zabarwienie słupka tłuszczu, utrudniające odczytanie wyników

Spośród metod objętościowych najbardziej popularna jest metoda Gerbera. Stosowana przede wszystkim przy określaniu poziomu tłuszczu w mleku, mięsie i przetworach

Produkt	Rodzaj tłuszczomierza	Wielkość próbki	Kwas siarkowy (ilość i stężenie)
Mleko	Do mleka	11 cm3	10 cm3 d=1,815 - 1,825
Mleko odtłuszczone	Do mleka	22 cm3	20 cm3 d=1,815 - 1,825 (podwójna ilość alkoholu amylowego - 2cm3
Śmietana I śmietanka	Koehlera Hammerschmidta Roedera	5 cm3 5 cm3 5 g	10 cm3 d=1,825 10 cm3 d=1,815 - 1,825 15 cm3 d=1,60 (po rozpuszczeniu białka i dodaniu alkoholu amylowego uzupełnić do kreski)
Mleko w proszku	Teicherta	2,5 g	10 cm3 d=1,815

Źródła błędów (metoda Gerbera)

• Złe wycechowanie tłuszczomierza

• Niedostatecznie odtłuszczone tłuszczomierze i korki

• Stosowanie nieodpowiedniej temperatury odczytu

• Stosowanie nieodpowiedniego wirowania (nieodpowiednia liczba obrotów na minutę)

• Zanieczyszczenia alkoholu izoamylowego

Oznaczanie składu kwasów tłuszczowych

• Oznaczanie kwasów tłuszczowych w produktach spożywczych można przeprowadzić za pomocą chromatografii gazowej

• Wyekstrahowany tłuszcz poddaje się hydrolizie zasadowej, a następnie uwolnione kwasy tłuszczowe przeprowadza się w ich lotne pochodne - estry metylowe; otrzymane estry rozdziela się metodą chromatografii gazowej

CUKRY

1. Zawartość cukrowców w wybranych produktach spożywczych (g/100g) (SKRYPT)

Ze względu na budowę chemiczną cukrowce można podzielić na

• Monosacharydy (np. glukoza, fruktoza)

• Oligosacharydy - złożone z 2 do 10 jednostek monosacharydowych

(np. sacharoza, maltoza, laktoza, rafinoza, stachioza)

• Polisacharydy - złożone z więcej niż 10 jednostek monosacharydowych

(np. skrobia, celuloza)

Ze względu na zróżnicowanie fizykochemiczne cukrowce ogółem są składnikiem pokarmowym żywności, którego nie oznacza się analitycznie, lecz oblicza z tzw różnicy

Cukrowce ogółem = masa próbki - (białko + tłuszcze + popiół + woda)

Biorąc pod uwagę rozpuszczalność cukrowców można je podzielić na

• Rozpuszczalne w wodzie - mono i oligosacharydy

• Rozpuszczalne na gorąco w 2% roztworze kwasu mineralnego - skrobia

• Rozpuszczalne w stężonych roztworach kwasów mineralnych - celuloza i jej pochodne

Identyfikacja cukrowców - reakcje grupowe

Próba Molisha z alfa-naftolem

• Do 1 cm3 roztworu dodać 1-2 krople 15% alkoholowego roztworu alfa-naftolu, 1 cm3 stężonego kwasu siarkowego

• Na obecność cukrowców wskazuje czerwony pierścień pojawiający się na granicy barw

WYKŁAD 5 4.11.2008

Próba z antronem i stężonym kwasem siarkowym

• Do 2 cm3 roztworu zawierającego 10-100 mg cukrowców dodać 4 cm3 0,2% roztworu antronu w stężonym kwasie siarkowym

• Po czasie 1 minuty pojawia się niebieskozielone zabarwienie

• Reakcję pozytywną dają heksozy, aldopentozy, 6-dezoksyryboza i kwas heksuronowy

Wykrywanie pentoz - reakcja Taubera

• Kilka kropli badanego roztworu dodać do 0,5 cm3 odczynnika benzydynowego (1g benzydyny rozpuszczonej w 25 cm3 lodowatego kwasu octowego), ogrzewać do wrzenia, a następnie ochłodzić

• W przypadku obecności pentoz pojawia się wiśniowoczerwone zabarwienie, heksozy dają zabarwienie żółtobrunatne

Odróżnianie fruktozy od glukozy i dwucukrów

• Kilka cm3 roztworu badanych cukrów zmieszać z 2,5 cm3 roztworu Fehlinga, pozostawić w temperaturze pokojowej i obserwować czas odbarwienia roztworu

• W ciągu godziny fruktoza powoduje całkowite odbarwienie. Dla pozostałych cukrowców czas ten wynosi 4 i więcej godzin

METODY OZNACZANIA CUKROWCÓW

Metody oznaczania węglowodanów można podzielić na

• Fizyczne

• Chemiczne

• Biologiczne

Istnieje wiele metod kombinowanych, tj fizykochemicznych lub biochemicznych

METODY FIZYCZNE

Metody densymetryczne - oparte na pomiarze gęstości wodnych roztworów cukrów za pomocą aerometru lub piknometru

Gęstość przelicza się przy pomocy tabel na zawartość ekstraktu - metody orientacyjne lub półilościowe

Metody refraktometryczne - oparte na pomiarze współczynnika załamania światła (refrakcji) przez cząsteczki cukru rozpuszczonego w wodzie

W produktach spożywczych, w których cukry stanowią główny składnik, stawia się często znak równości między oznaczoną zawartością cukru, a zawartością suchej masy

Metody polarymetryczne - wykorzystują zdolność skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego tj takiego, którego drgania zachodzą tylko w jednej płaszczyźnie, przez cząsteczki cukrów w roztworze wodnym, w których obecne są asymetryczne atomy węgla

METODY ENZYMATYCZNE

• Wykorzystywane do oznaczania glukozy i fruktozy, względnie oligosacharydów po hydrolizie

• W pierwszym etapie oznaczenia w wyniku fosforylacji otrzymywany jest glukozo-6-fosforan, który w reakcji z NADP+ w obecności dehydrogenazy fosfoglukonianowej jest utleniany z utworzeniem NADPH

• Ilość powstającego NADPH, oznaczanego spektrofotometrycznie w zakresie nadfioletu, jest proporcjonalna do ilości glukozy

METODY CHEMICZNE

Metody absorpcyjne (kolorymetryczne) - oparte na pomiarze absorbancji związków barwnych powstających w wyniku reakcji chemicznej cukrów (najczęściej monosacharydów) z różnymi odczynnikami chemicznymi

Do najczęściej stosowanych zalicza się metody

• Antronową

• Rezorcynową

• Żelazicyjankową

Metoda antronowa

• Polega na odwodnieniu cukrów przez ogrzewanie ze stężonymi kwasami i reakcji z antronem

• Pomiar natężenia barwy wykonywany jest przy długości fali świetlnej 620 nm

• Metoda pozwala na łączne oznaczenie większości cukrów występujących w badanym produkcie

• Metoda jest dokładna przy zachowaniu identycznych warunków pomiaru analizowanych roztworów

Metoda rezorcynowa

• Służy do oznaczania ketocukrów, które ogrzewane z kwasem solnym ulegają odwodnieniu

• Produkty odwodnienia tworzą z rezorcyną barwne kompleksy

• Ketoheksozy dają kompleks barwny o maksimum absorpcji przy długości fali 520 nm, ketopentozy przy długości fali 620 nm

Metoda żelazicyjankowa

• Służy do oznaczania aklocukrów, które w środowisku zasadowym redukują żelazicyjanek do żelazocyjanku, który z jonami Fe+3 tworzy błękit pruski

• Pomiar intensywności zabarwienia wykonywany jest przy długości fali świetlnej 690 nm

METODY CHEMICZNE: metody miareczkowe

• Metoda Lane-Eynona

• Metoda Bertranda

• Metoda Luffa-Schoorla

• Wykorzystują właściwości redukujące cukrów w stosunku do soli miedzi, wynikające z obecności w ich cząsteczkach wolnych grup karbonylowych (ketonowej =CO lub aldehydowej -CHO)

• Bezpośrednio redukujące właściwości posiadają: wszystkie monosacharydy oraz niektóre oligosacharydy np. maltoza i laktoza, gdzie jedna z grup aldehydowych pozostaje wolna

• Właściwości redukujące mogą również posiadać inne sacharydy po przeprowadzonej hydrolizie do monosacharydów, o pierwotnie zablokowanych grupach karbonylowych

• Sacharoza nie ma bezpośrednich właściwości redukujących, gdyż aldehydowa grupa glukozy oraz ketonowa fruktozy uczestniczą w tworzeniu wiązania glikozydowego

Sacharydy zawierające wolne grupy karbonylowe określa się jako „cukry bezpośrednio redukujące”

Sacharydy pozbawione właściwości redukujących poprzez zablokowanie grupy karbonylowej, po hydrolizie do monosacharydów, oznacza się łącznie z cukrami bezpośrednio redukującymi jako „cukry ogółem”

Metody miareczkowe nie są metodami specyficznymi dla cukrów, ponieważ właściwości redukujące w warunkach oznaczania cukrów, wykazują

• Aminokwasy (cysteina, kwas asparaginowy)

• Białka

• Niektóre kwasy organiczne

• Niektóre aldehydy

• Zasady purynowe, itp.

Które winny być wstęnie usunięte poprzez odbiałczenie i klarowanie próby

Z roztworów i wyciągów z produktów spożywczych (przetworów owocowych, warzywnych, cukierniczych, miodu, win, pieczywa) przed ilościowym oznaczeniem cukrów należy usunąć substancje interferujące (np. białka, pektyny, substancje niesacharydowe o właściwościach redukujących w stosunku do miedzi lub żelaza oraz substancje, które ulegają przemianom do reduktonów), jak też substancje barwne (barwniki antocyjanowe) stosując zabiegi klarowania

Usuwanie substancji interferujących metodą Carreza

W metodzie stosuje się roztwory w równej objetości

Carreza I - K4Fe(CN)6 (heksacyjanożelazian potasu)

Carreza II - ZnSO4 (siarczan cynku)

K4Fe(CN)6 + 2 ZnSO4 Zn2Fe(CN)6 (osad) + 2K2SO4

Powstający koloidalny heksacyjanożelazian cynku opadając w formie osadu porywa za sobą związki wielkocząsteczkowe (głównie białka i pektyny)

Do klarowania stosuje się też w zależności od produktu

• Wodorotlenek miedzi

• Kwas fosforo-wolframowy, kwas trichlorooctowy

• Etanol 70%, aceton

Do usunięcia barwników używa się węgla aktywowanego

Hydroliza (inwersja) oligosacharydów metodą Clerget-Herzfelda

Metoda polega na dodaniu do roztworu cukru kwasu solnego (HCl d=1,19 g/cm3), a następnie podgrzaniu mieszaniny i utrzymaniu w temperaturze 68-70 C przez 5 minut

Po schłodzeniu roztwór należy zobojętnić 30% wodorotlenkiem sodu wobec wskaźnika fenoloftaleiny i dopełnić wodą w kolbie miarowej tak, aby w kolbie otrzymać stężenie badanych cukrów w przedziale 0,1-0,4% dla metod Lane-Eynona i Bertranda oraz w przedziale 0,1-0,25% dla metody Luffa-Schoorla

Zmiana stężenia kwasu w hydrolizowanym roztworze może stać się powodem błędów z powodu niecałkowitego rozkładu sacharozy lub rozkładu innych di- i polisacharydów, zaś przedłużenie czasu i podwyższenie temperatury hydrolizy może prowadzić do rozkładu produktów inwersji, tj glukozy i fruktozy

C12H22O11 + H2O H+ 2C6H12O6

Sacharoza (342) Cukier inwertowy (2x180 = 360)

Różnicę pomiędzy zawartością cukrów ogółem i bezpośrednio redukujących przelicza się na sacharozę mnożąc przez współczynnik przeliczeniowy 0,95 (342:360)

Hydrolizę skrobi do glukozy przeprowadza się stosując różne stężenia kwasu i różny czas ogrzewania, np. w metodzie Lintnera próbkę skrobi hydrolizuje się w środowisku 2% HCl ogrzewając w 100 C przez 3 godziny

(C6H10O5)n (skrobia)+ nH2O H+ n C6H12O6 (glukoza)

n162g + n18g = n180g

METODA BERTRANDA

W metodzie tej stosuje się trzy płyny Bertranda

Bertranda I - CuSO4 * 5H2O w wodzie

Bertranda II - COOK(CHOH)2COONa * 4H2O + NaOH (winian sodowo-potasowy - SÓL SEIGNETTE'A zapobiega wytrącaniu się Cu(OH)2 - kompleksuje miedź)

Bertranda III - Fe2(SO4)3 + H2SO4 stęż

Oznaczenie polega na ilościowym redukowaniu przez cukry redukujące (o stężeniu 0,1 - 0,4%) jonów miedzi Cu2+ do miedzi Cu+ w środowisku zasadowym (pH=12) i temperaturze wrzenia (gotowanie przez 3 minuty mieszaniny płynów Bertranda I i II z badanym roztworem cukrów po uprzednim sklarowaniu próby i ewentualnie przeprowadzonej hydrolizie)

Bertranda I + II

CuSO4 + 2NaOH Cu(OH)2 + Na2SO4

COOK(CHOH)2COONa (winian Na-K) + Cu(OH)2 [COOK(CHO)2COONa]Cu (miedzio-winian Na-K)+ 2H2O

2[COOK(CHO)2COONa]Cu + R-CHO + 2H2O Cu2O + COOK(CHOH)2COONa + R-COOH

Wytworzony tlenek miedziawy rozpuszczany jest w roztworze siarczanu żelazowego i kwasu siarkowego, gdzie zachodzi redukcja soli żelazowej do żelazawej (wydzielony poprzez wcześniejsze wirowanie tlenek miedziawy rozpuszcza się w płynie Bertranda III)

Bertranda III

Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O (Cu - utleniana, Fe - redukowane)

Ilość zredukowanej soli żelazawej (Fe2+) oznacza się przez miareczkowanie mianowanym roztworem nadmanganianu potasu

Miareczkowanie

10FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4 5Fe2(SO4)3 + K2SO4 + 2MnSO4 + 8H2O

Wady metody Bertranda

Zależności pomiędzy ilością cukru i zredukowanej miedzi zostały ustalone empirycznie (przedstawione w postaci tabel), ze względu na niekorzystne reakcje uboczne występujące podczas oznaczenia

• Powstawanie reduktonów w środowisku alkalicznym i w podwyższonej temperaturze

• Utlenianie Cu2O tlenem atmosferycznym do CuO

METODA LANE-EYNONA

W metodzie stosuje się dwa płyny Fehlinga

Fehlinga I - CuSO4*5H2O

Fehlinga II - COOK(CHOH)2COONa*4H2) + NaOH

Oznaczenie polega na bezpośrednim miareczkowaniu wrzącej mieszaniny jednakowych ilości roztworów Fehlinga I i Fehlinga II (5+5cm3) odpowiednio rozcieńczonym roztworem badanych cukrów (o stężeniu 0,1 - 0,4%) (po uprzednim sklarowaniu próby i ewentualnie przeprowadzonej hydrolizie) w obecności błękitu metylenowego jako wskaźnika

Fehlinga I + II - reakcje jak w przypadku Bertranda I + II

Tworzący się miedziowinian sodowo-potasowy ma barwę ciemnoniebieską. Koniec miareczkowania rozpoznaje się po zaniku barwy niebieskiej, co świadczy o braku jonów Cu2+

Dodany błękit metylenowy ulega również odbarwieniu po zredukowaniu całej miedzi zawartej w płynie Fehlinga

Wady metod Lane-Eynona

• Pomiędzy stężeniem roztworu cukru i jego zużyciem nie ma zależności liniowej, gdyż zużyciu większej objętości roztworu odpowiada dłuższy czas miareczkowania oraz niższa alkaliczność środowiska i odwrotnie

• Heksozy 2 triozy, co ma miejsce w podwyższonej temperaturze i środowisku alkalicznym - przez to może się zwiększyć nawet dwukrotnie redukcyjność roztworu

WYKŁAD 6 18.11.2008

METODA LUFFA - SCHOORLA

• Metoda opiera się na redukcji jonów Cu(II) zawartych w płynie Luffa (węglan sodu, kwas cytrynowy, siarczan miedzi) przez cukry redukujące obecne w badanym roztworze

• Reakcja zachodzi w temperaturze wrzenia w środowisku zasadowym w pH około 9,5 (dzięki zastosowaniu w płynie Luffa węglanu sodu zamiast wodorotlenu sodu jak w płynach Bertranda i Fehlinga)

Oznaczenie cukrów metodą Luffa - Schoorla przebiega w dwóch etapach

1. W I etapie (próba ślepa) ustala się zużycie mianowanego roztworu tiosiarczanu sodu do zmiareczkowania jodu wydzielonego przez całkowitą ilość miedzi zawartą w określonej objętości płynu Luffa (25 cm3)

2CuSO4 + 4KI (środowisko kwaśne) 2K2SO4 + Cu2I2 + I2

I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6

2. W II etapie (próba właściwa) prowadzi się redukcję części miedzi zawartej w tej samej objętości płynu Luffa (25 cm3) badanym roztworem cukru, a następnie dodaje jodek potasu, z którego niezredukowana miedź wydziela jod. Jod miareczkowany jest mianowanym roztworem Na2S2O3

R-CHO + 2CuO (środowisko alkaliczne) Cu2O + R-COOH

2CuSO4 + 4KI (środowisko kwaśne) 2K2SO4 + Cu2I2 + I2

I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6

Objętość tiosiarczanu sodu odpowiadającą ilości miedzi (II) podlegającej redukcji przez cukry zawarte w oznaczanej próbce oblicza się z różnicy dwóch miareczkowań (próby ślepej i właściwej), a następnie przelicza z tabel na zawartość oznaczanego cukru

METODY CHEMICZNE: Metody chromatograficzne

• Stosuje się chromatografię gazową (GC) w której sacharydy jako związi nielotne muszą być przeprowadzone w lotne pochodne

• Lub wysokociśnieniową chromatografię cieczową (HPLC) używając detektora refraktometrycznego (RI), w którym wykorzystano pomiar współczynnika załamania światła

OZNACZANIE SKROBI

Do oznaczania zawartości skrobi stosuje się metody

• Wagowe

• Chemiczne

• Polarymetryczne

METODY WAGOWE

Metoda wagowa Raska

• Skrobię oznacza się wagowo po rozpuszczeniu jej i wytrąceniu z próbki przy użyciu kolejno eteru, kwasu solnego, alkoholu

• Metoda jest czasochłona, mało dokładna, jak też nie można jej stosować do wielu produktów

METODY CHEMICZNE

Polegają na hydrolizie skrobi do glukozy (w roztworach kwasów nieorganicznych lub przy wykorzystaniu enzymów amylolitycznych), której ilość oznacza się jedną z metod redukcyjnych i przelicza na skrobię, mnożąc przez współczynnik przeliczeniowy 0,9

(C6H10O5)n + nH2O (środowisko kwaśne) n(C6H12O6)

162 + 18 = 180

METODY POLARYMETRYCZNE

Skrobię przeprowadza się do roztworu przez potraktowanie

• Stężonym kwasem solnym i przetrzymanie na zimno w czasie około 30 minut

• Lub 1% roztworem tegoż kwasu i utrzymanie we wrzącej łaźni wodnej około 15 minut (można też użyć zamiast kwasu chlorku wapnia)

Uzyskane roztwory skrobi klaruje się np. płynami Carreza i klarowany przesącz bada w polarymetrze

WŁÓKNO

Zawartość włókna pokarmowego w produktach spożywczych w g/100g

Produkty zbożowe

• Otręby pszenne 42,5

• Płatki śniadaniowe 7,0 - 11,5

• Kasze 2,5 - 9,0

• Pieczywo 2,0 - 6,5

• Mąka pszenna typ 500, makarony 2,6

Strączkowe

• Suche nasiona 15,0 - 15,7

Warzywa

• Boćwina, bób, brukselka, czosnek, dynia, fasola szparagowa, groszek zielony, pietruszka

Seler 4-6

• Brokuły, burak, kalafior, kalarepa, kapusta, koper, kukurydza, marchew, por, rzepa, rzodkiewka, szczaw, szczypiorek, szpinak 2-4

• Pozostałe warzywa świeże do 2,0

Owoce

• Maliny, porzeczki 6,5 - 8,0

• Agrest, awokado, czarne jagody 3,0 - 3,5

• Pozostałe owoce świeże do 2,0

Włókno surowe (crude fiber) - część włókna roślinnego, która nie rozpuszcza się we wrzącym 0,25M kwasie siarkowym, a następnie 0,31M ługu sodowym, w wodzie, alkoholu i eterze

Do oznaczenia niestrawionej części pożywienia roślinnego pomiar włókna surowego jest nieadekwatny, ponieważ:

• Ponad 80% hemiceluloz jest usuwana wraz z białkami, cukrami i innymi składnikami poprzez działanie kwasem

• Ponad 50-90% lignin jest tracona przy traktowaniu próby zasadą

• Odzysk celulozy wynosi 50-80%

Włókno pokarmowe (dietary fiber) - część pożywienia odporna na działanie enzymów zawartych w przewodzie pokarmowym człowieka, obejmująca celulozę, hemicelulozy, ligniny, pektyny, wewnątrzkomórkowe polisacharydy takie jak gumy i śluzy roślinne oraz woski i kutyny, a więc wszystkie substancje występujące razem z ligninami i polisacharydami ścian komórkowych roślin (Trowell 1976)

Biorąc pod uwagę rozpuszczalność, frakcje włókna pokarmowego można podzielić na

• Rozpuszczalne w wodzie pektyny, gumy, śluzy, polisacharydy glonów

• Nierozpuszczalne w wodzie celulozę, hemicelulozy, ligniny, skrobię oporną

Trudności w interpretacji wyników oznaczeń

• Brak jednoznacznej definicji włókna

• Niejednorodność włókna pod względem chemicznym

• Istnienie wielu metod oznaczania poszczególnych frakcji (metody chemiczne, biochemiczne (enzymatyczne), biologiczne)

• Różne sposoby izolowania frakcji włókna z produktów

METODY CHEMICZNE OZNACZANIA WŁÓKNA SUROWEGO

Metoda Kurschnera - Hanaka w modyfikacji Kurschnera i Scharrera

• Badany produkt poddaje się trawieniu mieszaniną kwasów azotowego, octowego i trichlorooctowego w celu usunięcia białek, tłuszczów i węglowodanów przyswajalnych

• Uzyskaną nie trawioną pozostałość, odpowiadającą włóknu surowemu, oznacza się wagowo

METODY ENZYMATYCZNE OZNACZANIA WŁÓKNA POKARMOWEGO

Zalety metod enzymatycznych

• Pozwalają na rzeczywiste, w świetle dzisiejszej wiedzy, określenie ilości włókna pokarmowego

• Symulują naturalne warunki panujące w przewodzie pokarmowym człowieka (enzymy)

• Opracowanie szczegółowych metodologii dla określonych grup produktów, a nawet indywidualnych produktów

• Sposób przygotowania prób do analiz i stosowane odczynniki nie mogą wpływać na ilość włókna w próbie

• Mało skomplikowana aparatura, dostępna w każdym laboratorium

• Duża dokładność

Wady metod enzymatycznych

• Długotrwałość poszczególnych procesów (zależna od stosowanych enzymów)

• Trudności techniczne (np. w filtrowaniu niektórych produktów)

• Duży koszt enzymów, alkoholu

• Nie pozwalają na wyjaśnienie fizjologicznej roli włókna pokarmowego

Metoda AOAC

Polega na trawieniu (ewentualnie odtłuszczonej) próbki kolejno termooporną alfa-amylazą (termamylem), proteazą i amyloglukozydazą, a następnie po wytrąceniu włókna rozpuszczalnego, na wagowym oznaczeniu części niestrawionych z rozdziałem na rozpuszczalne i nierozpuszczalne w wodzie

Próbka (kolejno)

Przemywanie eterem naftowym (jeżeli produkt zawiera więcej niż 10% tłuszczu)

Trawienie termamylem (pH 6; 15 min; 90 C)

Trawienie proteazą (pH 7,5; 30 min; 60 C)

Trawienie amyloglukozydazą (pH 4,5; 30 min; 60 C)

Filtracja

FILTRACJA

Osad przemycie alkoholem, acetonem WŁÓKNO NIEROZPUSZCZALNE W WODZIE

Przesącz wytrącanie włókna rozpuszczalnego w wodzie (etanol; 60 min; 60 C) Filtracja Osad (przemycie alkoholem, acetonem) WŁÓKNO ROZPUSZCZALNE W WODZIE

SKŁADNIKI MINERALNE

Przygotowanie próbki do oznaczania składników mineralnych

Jednym z etapów oznaczania składników mineralnych jest zmineralizowanie próbki produktu w celu przeprowadzenia składników mineralnych do roztworu (utlenianie substancji organicznych, tj białek, tłuszczów i węglowodanów do CO2, H2O i amoniaku (w przypadku białek)); powstały roztwór w wyniku mineralizacji powinien być srebrzysty, przezroczysty; barwa brązowa świadczy o niedostatecznym utlenieniu substancji organicznych

Metody rozkładania substancji organicznych (utleniania) można podzielić na 3 grupy metod

• Spopielanie w wysokiej temperaturze (mineralizacja „na sucho”)

• Utlenianie za pomocą kwasów mineralnych (mineralizacja „na mokro”)

• Mineralizacja poprzez stapianie próbki produktu z substancjami utleniającymi

W analizie produktów spożywczych powszechnie stosowane są dwie pierwsze metody

Zawartość popiołu w wybranych produktach spożywczych w g/100g

• Otręby pszenne 6

• Mleko w proszku pełne 6

• Nasiona roślin strączkowych (suche) 3-5

• Sery podpuszczkowe 3-5

• Wędliny 2-5

• Ryby i przetwory rybne 1-2

• Jaja kurze całe 1

• Mięso i jego przetwory 0,4 - 1

• Mleko krowie, przetwory mleczne 0,5 - 1

• Mąki, pieczywo, kasze 0,2 - 2

• Owoce i warzywa świeże 0,5 - 1,5

• Tłuszcze 0,2

Popiół - pozostałość po całkowitym spaleniu (mineralizacji) substancji organicznych produktu

Poziom popiołu w żywności jest miarą zawartości - oszacowaniem - w niej zawartych składników mineralnych

Termin ten nie odpowiada dokładnie pojęciu „składniki mineralne”, ponieważ w czasie spalania mogą ulegać ulatnianiu lub innym stratom niektóre ze składników (np. chlorki)

Popiół może zawierać w swoim składzie także zanieczyszczenia (np. piasek)

Głównymi składnikami popiołu są: K, Na, Ca, Mg, Fe, Cl, P, S

Inne metale i metaloidy występują w popiele w mniejszych ilościach

Odczyn popiołu może być

• Zasadowy (przewaga K, Na, Ca, Mg - warzywa, owoce, mleko)

• Kwaśny (więcej Cl, P, S - zbożowe, jaja, mięso, ryby)

Popiół oprócz natywnych składników mineralnych może zawierać pozostałości substancji obcych dodawanych celowo (np. sól kuchenna) lub środków chemicznych

Badania zawartości popiołu w produktach spożywczych przeprowadza się w celu

• Określenia wartości odżywczej produktów (oznaczenie popiołu jest punktem wyjścia do oznaczenia występujących w jego składzie wybranych pierwiastków)

• Oznaczenia zawartości metali ciężkich (np. kadmu, ołowiu)

• Oceny jakości badanych produktów spożywczych

• Określenia poziomu zanieczyszczeń mineralnych żywności (np. piasku, kurzu)

Charakterystykę popiołu przeprowadza się przez oznaczenie

• Zawartości popiołu całkowitego (surowego)

• Zawartości popiołu nierozpuszczonego w kwasie solnym (10%)

• Zawartości popiołu czystego

• Zawartości popiołu rozpuszczonego w wodzie

• Alkaliczności lub kwasowości popiołu

• Jego składu mineralnego

Zawartość popiołu całkowitego (surowego)

Masa popiołu oznaczonego bezpośrednio po mineralizacji (spaleniu) jest zwykle wyznacznikiem wartości żywieniowej, zawiera też ślady zanieczyszczeń (piasku)

Zawartość popiołu nierozpuszczalnego w 10% HCl określa czystość produktu, wskazuje głównie na zawartość piasku, który nie rozpuszcza się w 10% HCl

Zawartość popiołu czystego - nie zawiera piasku; popiół surowy - piasek = popiół czysty

Zawartość popiołu rozpuszczalnego w wodzie; z popiołu całkowitego, uzyskanego po spaleniu produktu, wyługowuje się przy użyciu gorącej wody destylowanej frakcję związków rozpuszczalnych (głównie soli sodu i potasu oraz chlorków i węglanów)

WYKŁAD 7 25.11.2008

MINERALIZACJA „NA SUCHO” - SPOPIELANIE

• Metoda polega na określeniu masy zmineralizowanej próbki. Próbka popiołu musi być wolna od śladów węgla

• Spopielanie polega na ogrzewaniu próbki w tyglach lub parowniczkach porcelanowych, kwarcowych bądź platynowych, w dostępie powietrza, zazwyczaj w piecach muflowych

• Podczas spalania istnieje możliwość strat składników mineralnych związanych z lotnością w wyższych temperaturacj (np. siarki i chlorowców), dlatego proces ten musi być prowadzony w znormalizowanych warunkach

• Czynnikami wymagającymi kontroli są: temperatura, czas spalania i użyte naczynia

• Dla większości produktów zalecana jest temperatura 550-600 C, dla zbóż i produktów zbożowych 900C (nie zawierają chlorków)

• Czas spalania wynosi 16-18 godzin. Krótszy czas procesu stosowany jest zwykle do materiału roślinnego lub w przypadku małych naważek

• Szybkość spalania zależy od składu badanego materiału. Trudniej spalają się substancje kwaśne od zasadowych (zawierające sole łatwo topliwe - chlorki i fosforany) lub zawierające dużo białka i cukrów

• W celu nadania większej porowatości spalanemu materiałowi miesza się próbki z czystym piaskiem lub pumeksem

• Jeżeli spalanie zachodzi opornie, można stosować dodatek substancji przyśpieszających utlenianie (kilka kropel kwasu azotowego lub nadtlenku wodoru; ciecz odparowuje się, a pozostałość wypraża)

• Produkty półpłynne lub płynne (np. soki) przed spopieleniem należy zagęścić na łaźni wodnej (szybkie wstawienie do wysokiej temperatury mogłoby spowodować gwałtowne parowanie i wyrzucenie zawartości z tygla)

• W celu niedopuszczenia do strat fosforu i chloru można dodać przed mineralizacją substancje alkalizujące (np. octan magnezu)

• Tygle kwarcowe tworzą z miedzią kompleksy krzemowo - miedziowe

Zasada działania mineralizatorów mikrofalowych

Pole mikrofalowe generowane jest magnetronem o mocy 40-400 W i doprowadzane do próbki specjalnie skonstruowanym falowodem, co zapobiega wydostaniu się promieniowania poza obudowę przyrządu

Zalety mineralizacji w piecu mikrofalowym

• Sucha masa próbki stałej do 2g, ciekłej do 50 ml

• Stosowany zakres temperatur 100-300 C

• Szybka całkowita mineralizacja próbki dla wykonania oznaczenia stężenia pierwiastków

• Brak strat łatwo lotnych składników, ponieważ cały proces mineralizacji odbywa się w tym samym zamkniętym pojemniku

• Zmniejszone zużycie odczynników utleniających

• Bezpieczeństwo obsługującego personelu

OZNACZANIE CAŁKOWITEJ ZAWARTOŚCI POPIOŁU

Oznaczenie polega na spopieleniu (mineraliacji „na sucho”) próbki produktu w temperaturze 900 C (produkty zbożowe nie zawierające chlorków) lub 550 - 600 C (inne produkty spożywcze) po uprzednim jej zwęgleniu

Wykonanie oznaczenia SKRYPT

Przygotowanie próby do oznaczenia składników mineralnych

• W celu przygotowania zmineralizowanej próbki produktu do oznaczenia w niej zawartości składników mineralnych należy otrzymany popiół rozpuścić w 5 cm3 stężonego kwasu solnego, całość odparować nad płomieniem palnika pod wyciągiem do sucha, a następnie ponownie rozpuścić w 5 cm3 stężonego kwasu solnego i odparować do połowy objętości

• Zawartość tygla przenieść ilościowo do kolbki miarowej i uzupełnić do kreski wodą dejonizowaną, uzyskując roztwór podstawowy

OZNACZENIE ZAWARTOŚCI POPIOŁU ROZPUSZCZALNEGO W WODZIE

Oznaczenie polega na wyługowaniu gorącą wodą dejonizowaną frakcji związków rozpuszczalnych, głównie soli sodu i potasu oraz chlorków i węglanów z popiołu całkowitego, uzyskanego po mineralizacji próbki produktu w temperaturze 550-600 C

Wykonanie oznaczenia SKRYPT

OZNACZENIE ZAWARTOŚCI POPIOŁU NIEROZPUSZCZALNEGO W 10% KWASIE SOLNYM

Oznaczenie polega na określeniu masy części popiołu całkowitego, która nie zostaje rozpuszczona w 10% kwasie solnym

Czynniki wpływające na straty składników mineralnych podczas mineralizacji „na sucho”

• Lotności w wyższych temperaturach

• Adsorpcja na węglu niedostatecznie zmineralizowanej substancji organicznej

• Tworzenie nierozpuszczalnych połączeń kompleksowych

OZNACZENIE ODCZYNU POPIOŁU

Oznaczenie polega na rozpuszczeniu popiołu całkowitego w kwasie siarkowym i odmiareczkowaniu nadmiaru kwasu roztworem zasady

Wykonanie oznaczenia SKRYPT

MINERALIZACJA „NA MOKRO”

• Mineralizacja „na mokro” polega na utlenianiu substancji organicznych za pomocą mocnych kwasów mineralnych (kwasu azotowego, siarkowego i nadchlorowego)

• Mineralizacja kwasami zachodzi w temperaturze 120 - 330 C (temperaturze wrzenia kwasów), co wiąże się z mniejszym ryzykiem strat

• Stosowane w dużym nadmiarze kwasy mineralne powodują przeprowadzenie wszystkich pierwiastków w postacie nielotne, co zapobiega reakcji pomiędzy ww. składnikami mineralnymi w badanej próbce, a ściankami naczynia, co może następować przy spopielaniu np. w tyglach kwarcowych

• Mineralizację „na mokro” przeprowadza się w kolbach Kjeldahla, aż do uzyskania klarownego roztworu w kolbie (całość przenosi się do kolby miarowej i uzupełnia wodą dejonizowaną do kreski, uzyskując roztwór podstawowy do oznaczania składników mineralnych

• Kwasy mineralne mogą być źródłem wprowadzanych z nimi zanieczyszczeń w postaci różnych pierwiastków

HNO3

• Temperatura wrzenia 120 C

• Łatwo reaguje z substancjami organicznymi

• Łatwo usuwany z roztworu po zmineralizowaniu próbki

• Tworzy nitrozwiązki, dlatego też jest stosowany w mieszaninie z kwasem siarkowym i nadchlorowym

H2SO4

• Temperatura wrzenia 330 C

• Stosowany w mieszaninie z kwasem azotowym i nadchlorowym, dając mieszaninę o wysokiej temperaturze wrzenia i podwyższonej sile utleniającej

• Ww. mieszanina nie może być stosowana do oznaczania składników łatwo redukujących się do postaci lotnych

• Tworzy nierozpuszczalne siarczany niekorzystnie adsorbując na nich pierwiastki śladowe

HClO4

• Najsilniejszy ze stosowanych kwasów utleniających

• Wysoka temperatura wrzenia 203 C

• Łatwo miesza się z wodą i innymi kwasami

• Większość nadchloranów jest dobrze rozpuszczalna w wodzie

• Niebezpieczny ze względu na możliwość eksplozji, dlatego też w początkowym okresie utleniania dodawany jest kwas azotowy

Do przyśpieszenia mineralizacji dodawane są do mieszaniny kwasów inne substancje utleniające

• Nadtlenek wodoru

• Nadmanganian potasowy

• Nadchloran potasowy

Mineralizacja

„Na sucho”	„Na mokro”
ZALETY
Nie wymaga odczynników	Stosunkowo szybka
Łatwe i proste wykonanie	Prosta aparatura
Mogą być stosowane duże naważki	Niższe temperatury stosowane - mniejsze niebezpieczeństwo strat składników mineralnych
Nie wymaga nadzoru
WADY
Stosunkowo długotrwała (16-18 h)	Małe naważki
Wysokie temperatury - niebezpieczeństwo strat	Konieczność wykonywania próby „ślepej”
		Wymaga stałego nadzoru

OZNACZANIE ZAWARTOŚCI SKŁADNIKÓW MINERALNYCH

MAKROELEMENTY

Składniki mineralne, których zawartość w organizmie człowieka jest większa niż 0,01%, a zapotrzebowanie przekracza 100 mg/osobę/dobę. Do grupy tej należą wapń, fosfor, magnez, potas, sód, chlor, siarka

WAPŃ

Zawartość wapnia w wybranych produktach spożywczych w mg/100g

• Sery podpuszczkowe 400-900

• Mleko, przetwory mleczne, sery twarogowe 100-200

• Nasiona roślin strączkowych (suche) 50-250

• Owoce i warzywa świeże do 100

• Jajo kurze całe 50

• Mąki, pieczywo, kasze do 50

• Mięso i przetwory mięsne, ryby 5-20

Wykorzystanie z diety wapnia

Zwiększa	Zmniejsza
Niskie pH	Fityniany, szczawiany i błonnik
Kwasy organiczne	Wyższe pH
Obecność laktozy	Tłuszcz
Aminokwasy zasadowe	Duża zawartość fosforu
Witamina D3
Odpowiedni stosunek wapnia do fosforu

Wapń z dziennej racji pokarmowej jest absorbowany na poziomie 30-40%

Do oznaczania wapnia zaleca się metody:

• Manganometryczną

• Kompleksometryczną (z wersenianem dwusodowym)

• Fotometrii płomieniowej

• Atomowej spektrofotometrii absorpcyjnej (ASA)

Metoda manganometryczna - wapń obecny w roztworze zmineralizowanej próbki jako chlorek wapniowy wytrąca się w środowisku kwaśnym pod wpływem szczawianu amonowego, tworząc szczawian wapniowy

Po rozpuszczeniu szczawianu wapniowego w kwasie siarkowym miareczkuje się wolny kwas szczawiowy roztworem nadmanganianu potasowego i oblicza ilość związanego z nim wapnia

2 KMnO4 + 5 C2O4 Ca + 8H2SO4 K2SO4 + 2 MnSO4 + 10 CO2 + 8 H2O + 5 CaSO4

Metoda ta należy do metod klasycznych, jest dość pracochłonna, nie wymaga skomplikowanej aparatury, odznacza się stosunkowo dużą precyzją

Metoda kompleksometryczna - polega na miareczkowaniu wapnia w zmineralizowanej próbie roztworem wersenianu dwusodowego (solą sodową kwasu etylenodwuaminoczterooctowego) w obecności wskaźnika (mieszaniny mureksydu i zieleni naftolowej), którego barwa zmienia się od szaroróżowej do niebieskofioletowej

Działanie wskaźnika polega na tworzeniu w obecności NaOH (pH 12) barwnego kompleksu mureksydu z wapniem (CaI+)

Miareczkowanie tego kompleksu wersenianem (H2Y^2-) daje w punkcie równoważnikowym zmianę barwy związaną z „wyparciem” mureksydu (I-) z kompleksu z wapniem i z utworzeniem kompleksu wersenianu z wapniem (CaY^2-)

CaI⁺ + H₂Y^2- pH12 CaY^2- + 2H⁺ + I^- || CaI⁺ - szaroróżowy; CaY^2- - niebieskofioletowy

Zieleń naftolowa dodana do wskaźnika ułatwia uchwycenie zmian barwy

Wady metody kompleksometrycznej

• Metale ciężkie obecne w roztworze mogą tworzyć z mureksydem kompleksy barwne, co utrudnia uchwycenie punktu miareczkowania

• Szczawiany, fosforany tworzą ze wskaźnikiem silniejsze kompleksy niż kompleks oznaczanych kationów, a roztwór nie zmienia zabarwienia nawet po dodaniu nadmiaru wersenianu

• Stosunkowo trudny do uchwycenia końcowy punkt miareczkowania

Metoda fotometrii płomieniowej - oznaczenie polega na pomiarze w roztworach zmineralizowanej próbki natężenia promieniowania emitowanego przez wzbudzone atomy wapnia w płomieniu palnika

Określenie zawartości wapnia w próbie odbywa się na podstawie odczytu z krzywej wzorcowej

Metoda wymaga usuwania jonów interferujących, a szczególnie fosforanów poprzez dodatek roztworu kompleksującego, np. azotanu cyrkonu lub usuwanie wyżej wspomnianych związków na jonitach

Metoda atomowej spektrofotometrii absorpcyjnej - metoda polega na pomiarze absorpcji promieniowania lampy katodowej przy długości fali rezonansowej 422,7 nm przez owlne atomy wapnia znajdujące się w roztworze próbki wprowadzonej do płomienia palnika acetyleno-powietrznego w formie rozpylonej

Absorpcja jest proporcjonalna do stężenia danego pierwiastka

Zawartość wapnia w próbie odczytuje się na podstawie krzywej standardowej

Interferencja jonów fosforanowych usuwana jest przez stosowanie dodatku soli strontu lub lantanu do badanych roztworów

Metoda ta zalecana jest ze względu na selektywność oznaczeń, dużą czułość oraz szybkość przeprowadzanych analiz

Metoda ASA znajduje współcześnie coraz szersze zastosowanie z uwagi na dużą czułość, szybkość i prostotę oznaczenia oraz powtarzalność wyników

Czynnikiem ograniczającym zasięg stosowania tej metody jest konieczność posiadania specjalnej aparatury

FOSFOR

Zawartość fosforu w wybranych produktach spożywczych w mg/100g

• Produkty o zawartości powyżej 250 mg (sery podpuszczkowe, konserwy rybne spożywane z ośćmi)

• Produkty o zawartości 100-250 mg (kasze, ryby, pieczywo ciemne, mięso, sery twarogowe)

• Produkty o zawartości 50-100 mg (mleko, pieczywo jasne)

• Produkty o zawartości poniżej 50 mg (większość warzyw, owoce)

Wykorzystanie z diety fosforu zmniejszają

Fityniany, szczawiany i błonnik

Alkohol

Fosfor z dziennej racji pokarmowej jest absorbowany na poziomie 60-70%

Do oznaczania fosforu zaleca się metody:

• Kolorymetryczne

• Fotometrii płomieniowej

Metoda kolorymetryczna - polega na przeprowadzeniu fosforanów w fosforomolibdeniany, następnie zredukowaniu ich i pomiarze powstałego błękitu fosforomolibdenowego przy długości fali 700 nm

• Do redukcji stosuje się najczęściej metol (siarczan N-metylo-p-aminofenolu), jak też hydrazynę lub siarczyn sodu

• W metodzie należy ściśle przestrzegać temperatury i czasu pomiaru

Metoda fotometrii płomieniowej - oznaczenie polega na pomiarze w roztworach zmineralizowanej próbki natężenia promieniowania emitowanego przez wzbudzone atomy wapnia w płomieniu palnika przed i po usunięciu fosforanów z próby na odpowiednio przygotowanych jonitach

W metodzie tej wykorzystano obniżenie emisji wapnia przez fosforany, co w pewnym zakresie stężeń jest zależnością liniową

Metoda ta pozwala na równoczesne oznaczenie wapnia i fosforu w badanej próbce

WYKŁAD 8 2.12.2008

MAGNEZ

Zawartość magnezu w wybranych produktach spożywczych w mg/100g

• Produkty o zawartości powyżej 200 mg - kasze gryczane, otręby pszenne, kakao proszek, migdały

• Produkty o zawartości 100-200 mg - strączkowe, orzechy, czekolady

• Produkty o zawartości 25-100 mg - sery podpuszczkowe, ryby (np. dorsz, makrela), kasze jęczmienne, mąki wysokiego wymiału, ciemne pieczywo, niektóre warzywa, (np. groszek, szpinak), niektóre owoce (np. banany, jeżyny)

• Produkty o zawartości poniżej 25 mg - mleko, jaja, mięso, podroby, ryby (karp, śledź), jasne mąki i pieczywo, ryż, większość warzyw i owoców

Wykorzystanie z diety magnezu

Zwiększa	Zmniejsza
Obecność laktozy Obecność białka Witamina D3	Fityniany, szczawiany i błonnik Obecność tanin Tłuszcz (tworzenie mydeł) Zwiększona zawartość fosforu i wapnia

Magnez z dziennej racji pokarmowej jest absorbowany na poziomie 30-40%

Do oznaczania magnezu zaleca się metody

• Wagową

• Kompleksometryczną

• Kolorymetryczną

• Fotometrii płomieniowej

• Atomowej spektrofotometrii absorbcyjnej (ASA)

Metoda wagowa - wyjątkowo pracochłonna, jest obecnie rzadko stosowana

Wady metod kompleksometrycznych

• Konieczność usuwania substancji interferujących (głównie anionów fosforanowych i kationów wapnia) oraz zastosowania odpowiedniego stężenia jonów wodorowych

• Słabo widoczna i powolna zmiana barwy w punkcie równoważnikowym pomimo stosowania różnych wskaźników takich jak mureksyd czy czerń eriochromowa

Metody kolorymetryczne - należą do metod mało specyficznych i wymagają wybiórczego oddzielenia magnezu od innych pierwiastków. W tym celu stosuje się usuwanie fosforanów na jonitach, związki chelatujące magnez czy roztwory kompensacyjne zawierające interferujące jony

Metody te stosowane są z uwagi na różne wyposażenie aparaturowe laboratoriów i brak posiadania kosztownej aparatury badawczej

Metoda kolorymetryczna z żółcienią tiazolową - polega na wykonaniu pomiaru absorbancji barwnego związku powstałego na skutek reakcji wodorotlenku magnezu z żółcienią tiazolową. Intensywność powstałego zabarwienia mierzy się przy długości fali świetlnej 540 nm

• Trwałość i intensywność połączenia zależna jest od sposobu alkalizowania próby, obecności innych jonów w roztworze, temperatury roztworu i czasu pomiaru

• W celu zwiększenia trwałości zabarwienia dodaje się hydroksyloaminę, a stosowana skrobia jako koloid ochronny zapobiega zmętnieniu roztworu wskutek koagulacji wodorotlenku magnezowego

• W celu wyeliminowania interferencji jonów obecnych w badanej próbce używa się roztworu kompensacyjnego składającego się z roztworu soli: chlorku wapnia, siarczanu glinu, siarczanu magnezu, fosforanu potasu

Metoda fotometrii płomieniowej - polega na pomiarze w roztworach zmineralizowanej próbki natężenia promieniowania emitowanego przez wzbudzone atomy magnezu w płomieniu palnika.

• Zastosowanie metody fotometrii płomieniowej do oznaczeń magnezu wymaga pozbawienia badanego roztworu jonów interferujących, a szczególnie fosforanów, poprzez dodatek roztworu kompleksującego lub usunięcia wyżej wymienionych związków na jonitach

Metoda atomowej spektrofotometrii absorpcyjnej (ASA) - polega na pomiarze absorpcji promieniowania lampy katodowej przy długości fali 285,2 nm przez wolne atomy magnezu znajdujące się w roztworze próbki wprowadzonej do płomienia palnika acetyleno-powietrznego w formie rozpylonej i obliczeniu zawartości tego pierwiastka na podstawie krzywej standardowej

• Interferencja anionów fosforanowych, kationów wapniowych czy szczawianów usuwana jest poprzez zastosowanie soli strontu czy lantanu

CHLOR

Zawartość chlorków w wybranych produktach spożywczych w mg/100g (w przeliczeniu na NaCl)

• Produkty o zawartości 1200-3500 mg - ryby wędzone, sery podpuszczkowe, ogórki kiszone, kapusta kiszona, wędliny, przetwory mięsne, mleko w proszku

• Produkty o zawartości 1000-1200 mg - pieczywo

• Produkty o zawartości 300-600 - sok pomidorowy, koncentraty pomidorowe

• Produkty o zawartości poniżej 300 mg - mleko i napoje mleczne, jaja, mięso, podroby, ryby świeże, strączkowe, warzywa i owoce

W produktach spożywczych sól występuje jako

• Naturalny składnik

• Dodatek do żywności dozowany podczas przemysłowego jej przetwarzania ze względu na poprawę cech organoleptycznych produktu jak i na udowodnione właściwości konserwujące i funkcjonalne

Pierwiastki te wchłaniane są prawie całkowicie w jelicie cienkim. Gospodarka chlorem w organizmie jest ściśle powiązana z jonem sodowym, którego spadkowi lub wzrostowi stężenia w osoczu towarzyszą takie same zmiany stężenia jonu chlorkowego

Chlor i chlorki w produktach spożywczych oznacza się metodami objętościowymi

• Metodą Volharda

• Metodą Mohra

Metoda Volharda - polega na dodaniu w nadmiarze azotanu srebra do zakwaszonego kwasem azotowym roztworu chlorków

NaCl + AgNO3 NaNO3 + AgCl (osad)

Nadmiar azotanu srebra odmiareczkowuje się rodankiem sodu lub potasu w obecności siarczanu żelazowo - amonowego jako wskaźnika

AgNO3 + KSCN AgSCN + KNO3

Nadmiar rodanku potasu reaguje z Fe(III) powodując w punkcie równoważnikowym powstawanie jasnoceglastego kompleksu

Zaletą metody Volharda jest możliwość miareczkowania chlorków w środowisku kwaśnym

Metoda Mohra - oparta jest na argentometrycznym miareczkowaniu chlorków w środowisku obojętnym azotanem srebra w obecności chromianu potasowego jako wskaźnika

NaCl + AgNO3 NaNO3 + AgCl (osad)

Po wytrąceniu się chlorku srebra nadmiar azotanu srebra reaguje z chromianem dając brunatnoczerwone zabarwienie

2 AgNO3 + K2CrO4 Ag2CrO4 + 2KNO3

Ważne jest, aby odczyn roztworu podczas przebiegu reakcji był odczynem obojętnym

W roztworze kwaśnym jony wodorowe reagują z jonami CrO4^2-, w wyniku czego powstają jony HCrO4 i Cr2O7^2-, co powoduje zmniejszenie stężenia jonów CrO4^2-, a przy niższych pH może w ogóle nie powstawać osad dobrze rozpuszczalnego w środowisku kwaśnym Ag2CrO4, co wpływa na błędny wynik analizy

2CrO4^2- + 2H⁺ Cr2O7^2- + H2O

W roztworach silnie alkalicznych (pH > 10,5) następuje wytrącanie osadu Ag2O wcześniej niż Ag2CrO4

2Ag⁺ + 2OH^- Ag2O + H2O

SÓD I POTAS

Zawartość sodu w wybranych produktach spożywczych w mg/100g

• Produkty o bardzo wysokiej zawartości (powyżej 120 mg) - produkty przetwarzane z dodatkiem soli kuchennej, podroby (płuca, nerki, mózg)

• Produkty o niskiej zawartości (40-120 mg) - mleko, mięso, wątroba, ryby, drób, niektóre warzywa (szpinak)

• Produkty o bardzo niskiej zawartości (poniżej 40 mg) - strączkowe, warzywa i owoce, mąki, kasze, orzechy

Zawartość potasu w wybranych produktach spożywczych w mg/100g

• Produkty o zawartości powyżej 600 mg - strączkowe, niektóre grzyby, orzechy, drożdże

• Produkty o zawartości 300-600 mg - ziemniaki, mięso, drób, niektóre warzywa (szpinak)

• Produkty o zawartości poniżej 300 mg - pieczywo, mleko i produkty mleczne, owoce i większość warzyw, większość ryb

Sód i potas są pierwiastkami prawie całkowicie wchłanianymi w jelicie cienkim

Do oznaczania sodu i potasu zaleca się metody

• Fotometrii płomieniowej

• Atomowej spektrofotometrii absorpcyjnej

Metoda fotometrii płomieniowej - zasada j.w.

Przy oznaczaniu sodu i potasu należy zwrócić uwagę na możliwość interferencji jonów zarówno kationów jak i anionów

Jony potasu podwyższają odczyty dla sodu, co w pewnych granicach ma charakter zależności liniowej

Metoda ASA - zasada jak wcześniej (np. magnez)

Atomy sodu - długość fali 589 nm

Atomy potasu - długość fali 766,5 nm

(Jony potasu podwyższają odczyty dla sodu zależność liniowa)

ŻELAZO

Zawartość żelaza w wybranych produktach spożywczych w mg/100g

• Produkty o bardzo wysokiej zawartości (powyżej 9 mg) - wątroba, otręby pszenne

• Produkty o wysokiej zawartości (4-9 mg) - strączkowe, pietruszka - natka, żółtko jaja kurzego

• Produkty o średniej zawartości (1-4 mg) - mąka, pieczywo, kasze, jaja kurze całe, mięso i wędliny, warzywa (większość)

• Produkty o niskiej zawartości (poniżej 1 mg) - mleko i przetwory, ryby, owoce świeże, ziemniaki, ryż

Wykorzystanie z diety żelaza

Zwiększa	Zmniejsza
Tzw meat factor (występujący w białkach mięśniowych) Obecność kwasu askorbinowego Obecność kwasu foliowego Niektóre aminokwasy (histydyna, L-cysteina) Obecność miedzi	Fityniany, szczawiany i błonnik Wyższe pH (zasadowe) Garbniki (taniny) Wysoki poziom tłuszczu Obecność fosforanów Niektóre białka roślinne Obecność wapnia, cynku, kadmu i manganu

Wykorzystanie z dziennej racji pokarmowej wynosi średnio 10%; produkty pochodzenia roślinnego od 1 do 5%, mięsa (mioglobina, hemoglobina) do 30%

Do oznaczania żelaza zaleca się metody

• Kolorymetryczne

• Atomowej spektrofotometrii absorpcyjnej (ASA)

Metody kolorymetryczne, wśród nich wyróżnia się

Metody kolorymetryczne oparte na oznaczeniach jonów żelazowych (Fe3+)

• Metoda rodankowa (z rodankiem potasowym)

• Metoda z kwasem sulfosalicylowym

Metody kolorymetryczne oparte na oznaczeniach jonów żelazawych (Fe2+)

• Metoda z orto-fenantroliną

• Metoda z dwupirydylem

Częściej do oznaczeń żelaza stosowane są metody oparte na oznaczeniu jonów żelazawych (Fe2+) ze względu na

Większą trwałość utworzonych barwnych kompleksów w czasie

Odporność żelaza związanego w barwnych kompleksach na utlenianie

Mały wpływ substancji obecnych w roztworze na oznaczenie

PH roztworu oznaczanego powyżej 4 zapobiega interferencji fosforanów, szczawianów czy fluorków

Metoda kolorymetryczna o-fenantrolinowa - opiera się na pomiarze absorpcji utworzonego barwnego połączenia o-fenantroliny z jonami żelazawymi (Fe2+) po uprzedniej redukcji jonów żelazowych (Fe3+) chlorowodorkiem hydroksyloaminy w środowisku słabo kwaśnym (pH 3-4)

Intensywność powstałego zabarwienia odczytuje się na kolorymetrze przy długości 510 nm

Zawartość żelaza w próbie odczytuje się z krzywej wzorcowej

Metoda ASA - długość fali 248,3 nm - zawartość żelaza odczytuje się na podstawie krzywej standardowej

MIEDŹ

Zawartość miedzi w wybranych produktach spożywczych

• Produkty o zawartości powyżej 1 mg - orzechy laskowe

• Produkty o zawartości 0,5 - 1 mg - strączkowe, podroby, otręby pszenne, czekolady

• Produkty o zawartości 0,1 - 0,5 mg - sery podpuszczkowe, drób, ryby, podroby, kasze, pieczywo ciemne, warzywa zielone, niektóre owoce

• Produkty o zawartości poniżej 0,1 mg - mleko i przetwory mleczne, mięso, pieczywo jasne, warzywa nie zielonei niektóre owoce

Wykorzystanie z diety miedzi

Zwiększa	Zmniejsza
Połączenie miedzi z niskocząsteczkowymi związkami organicznymi, np. z niektórymi aminokwasami	Obecność fitynianów, błonnika Zwiększona podaż żelaza lub cynku Obecność fruktozy i kwasu askorbinowego Obecność zwiększonej ilości siarczków, molibdenu, kadmu

Wykorzystanie miedzi z diety kształtuje się na poziomie 50% i zależy m.in. od składu diety oraz od postaci chemicznej, w jakiej miedź występuje

Do oznaczania miedzi zaleca się metody:

• Kolorymetryczne

• Polarograficzną

• ASA

Kolorymetryczne - najczęściej stosowane to: dwutiokarbaminianowa i ditizonowa, charakteryzujące się dużą czułością oznaczenia

Metody te wymagają wykonania czynności wstępnych związanych z oddzieleniem miedzi od pozostałych pierwiastków obecnych w badanym roztworze

Metoda kolorymetryczna dwutiokarbaminianowa - wykonanie pomiaru absorbancji barwnego połączenia miedzi z dwuetylodwutiokarbaminianem sodu (Na-DDTK) przy pH 8,5 w obecności soli dwusodowej kwasu wersenianowego (EDTA-Na) jako substancji chelatującej, po uprzedniej ekstrakcji kompleksu karbaminianowego czterochlorkiem węgla

Intensywność powstałego zabarwienia należy zmierzyć przy długości fali świetlnej 435 nm

Metoda kolorymetryczna dwutiokarbaminianowa

W celu usunięcia wpływu pierwiastków przeszkadzających w oznaczeniu, tworzących barwne kompleksy karbaminianowe (żelazo, mangan, cynk), stosuje się jako środek maskujący wersenian sodowy, który w środowisku winianowym lub cytrynianowym przy pH 8-9 tworzy z tymi pierwiastkami bezbarwne połączenia

Metoda polarograficzna - rejestruje falę polarograficzną miedzi w roztworze zmineralizowanej próbki, wymaga zastosowania odpowiedniego elektrolitu podstawowego (najczęściej stosowany jest rodanek potasowy, chlorek amonowy, bufor octanowy oraz kwaśny ftalan potasowy)

Zastosowanie roztworu ftalanu potasowego pozwala na równoczesne oznaczenie w badanej próbce obok miedzi również cynku, po usunięciu żelaza z roztworu poprzez użycie ditizonu jako środka kompleksotwórczego

ASA - długość fal 324,8 nm, obliczenie zawartości na podstawie krzywej standardowej

Umożliwia bezpośredni pomiar miedzi w roztworze zmineralizowanej próbki ze względu na nieistotny wpływ takich pierwiastków jak sód, potas, wapń czy magnez

CYNK

Zawartość cynku w wybranych produktach spożywczych w mg/100g

• Produkty o zawartości 2-5 mg - sery podpuszczkowe, mięso, wątroba, strączkowe

• Produkty o zawartości 1-2 mg - kasze, pieczywo ciemne, ryby

• Produkty o zawartości poniżej 1 mg - mleko, pieczywo jasne, warzywa i owoce

Wykorzystanie cynku z diety

Zwiększa	Zmniejsza
Białko zwierzęce Niektóre aminokwasy (cysteina, histydyna) Kwas cytrynowy	Obecność fitynianów, błonnika Zwiększona podaż żelaza niehemowego, miedzi i wapnia Obecność kwasu szczawiowego

Wykorzystanie cynku z diety kształtuje się na poziomie 10-40%

Do oznaczania cynku zaleca się metody:

• Kolorymetryczne

• Polarograficzną

• ASA

Kolorymetryczne - najczęściej stosowana metoda ditizonowa, odznaczająca się dużą czułością

Polega na utworzeniu barwnego połączenia cynku z ditizonem, a następnie ekstrakcji ditizonianu cynku czterochlorkiem węgla i oznaczeniu absorbancji

Jako środki maskujące wpływ innych pierwiastków, głównie miedzi i ołowiu, stosowany jest zwykle dwuetylodwutiokarbaminian sodwy lub tiosiarczan sodowy, które przy odpowiednim pH tworzą trwałe połączenia z tymi pierwiastkami zapobiegając ich reakcji z ditizonem

Metoda polarograficzna - rejestruje falę polarograficzną cynku w roztworze zmineralizowanej próbki; pozwala na równoczesne oznaczenie innych pierwiastków (np. miedzi) w tym samym roztworze elektrolitu podstawowego

ASA - 213,9 nm

JOD

Zawartość jodu w wybranych produktach spożywczych w mikrogramach/100g

• Produkty o zawartości powyżej 50 - dorsz, krewetki, karmazyn, halibut

• Produkty o zawartości 20-50 - niektóre ryby (flądra, łosoś, makrela, śledź), marchew

• Produkty o zawartości 5-20 - mleko i przetwory mleczne, jaja, strączkowe, wątroba, niektóre warzywa (szpinak, seler, ziemniaki, sałata, kapusta)

• Produkty o zwartości poniżej 5 - mięso, masło, większość warzyw i owoce, ryż, ryby (pstrąg, karp, węgorz)

Wykorzystanie jodu z diety jest blisko całkowite

Do oznaczania jodu zaleca się metody:

Metody miareczkowe - polegające na wyekstrahowaniu alkoholem absolutnym jodu w postaci jodku potasowego z popiołu spalonej próbki i miareczkowaniu mianowanym roztworem tiosiarczanu sodowego wobec skrobi jako wskaźnika

Metody kolorymetryczne:

I grupa metod - wykorzystujące zdolności tworzenia intensywnego zabarwienia pomiędzy jodem a skrobią. Metody te w pierwszej części wykonania są identyczne w swoim założeniu z metodą miareczkową, a jedynie końcowy fragment polega na spektrofotometrycznym oznaczeniu absorbancji kompleksu jodoskrobiowego przy długości fali 590 nm

II grupa metod - metody polegające na utlenieniu odczynnika organicznego (N,N' - dwu - (beta-hydroksypropylo)-o-fenylodwuaminy (DHPF) jodem w kwaśnym środowisku do związku barwnego i pomiarze absorbancji przy 525 nm

Metoda stosowana do oznaczenia jodu w rybach i mleku w proszku

III grupa metod - jon jodkowy zawarty w próbce katalizuje przebieg pewnych reakcji, przy czym szybkość reakcji i ilość utworzonych produktów w pewnych przedziałach stężeń są liniowo zależne od zawartości jodku

WYKŁAD 9 9.12.2008

ATOMOWA SPEKTROFOTOMETRIA ABSORPCYJNA (ASA)

1. Wzbudzenie atomów - jest to pierwszy etap w metodach emisyjnych

• W normalnych warunkach temperatury i ciśnienia atomy znajdują się w stanie podstawowym, zwanym również stanem normalnym lub niewzbudzonym. Stanowi temu odpowiada minimum energii układu

• Elektrony znajdujące się na poziomie podstawowym nie mogą emitować promieniowania, ponieważ nie mają możliwości przejścia na zapełnione całkowicie niższe poziomy energetyczne

• Aby zachodziła emisja, należy dostarczyć atomowi kwantu energii, który spowoduje przeniesienie elektronu na wyższy poziom energetyczny

• Atom znajduje się wtedy w tzw stanie wzbudzonym o większej energii, niż energia stanu podstawowego

2. Drugim etapem w metodach emisyjnych jest przejście elektronu z wyższego poziomu energetycznego na niższy

• Przejściu temu towarzyszy wydzielenie energii w postaci promieniowania elektromagnetycznego

Wzbudzenie optyczne

• Wzbudzenie optyczne atomów przez dostarczenie energii elektromagnetycznej, wykorzystywane w technice ASA, zachodzi najczęściej po absorpcji promieniowania w zakresie nadfioletu (UV) lub światła widzialnego (VIS), rzadziej promieniowania rentgenowskiego

• Czas trwania atomu w stanie wzbudzonym jest na ogół bardzo krótki i wynosi 10^-8 sekundy

• Wobec krótkiego czasu trwania wzbudzonych atomów, w ciągu jednej sekundy, te same atomy są wielokrotnie wzbudzane i wielokrotnie emitują promieniowanie, co pozwala na ustalenie się równowagi dynamicznej w danych warunkach wzbudzenia, w wyniku czego natężenie emitowanego promieniowania jest stałe

Wszystkie pierwiastki w zależności od energii wzbudzenia można podzielić na trzy grupy

• Pierwiastki o niskiej energii wzbudzenia (1,4-3 eV) (większa długość fali)

• Pierwiastki o średniej energii wzbudzenia (3-10 eV)

• Pierwiastki o wysokich potencjałach wzbudzenia (10-35 eV) (mniejsza długość fali)

ZASADA ASA

Atomowa spektrofotometria absorpcyjna (ASA), zwana również absorpcją atomową, polega na pomiarze promieniowania monochromatycznego pochłoniętego przez wolne atomy danej substancji

Metoda ta wprowadzona została w latach 1953-55 i stała się jedną z najczęściej stosowanych instrumentalnych metod analitycznych

• Podstawą absorpcyjnej spektrofotometrii atomowej jest prawo promieniowania Kirchhoffa, zgodnie z którym pierwiastek absorbuje promieniowanie o takiej długości fali, jaką emituje w stanie wzbudzonym

• Mierzona absorbancja jest wprost proporcjonalna do liczby atomów w jednostce objętości, czyli do ich stężenia oraz grubości warstwy absorbującej

• Aby mogła zajść absorpcja danego promieniowania dostatecznie duża liczba atomów musi znajdować się w stanie podstawowym

• Wolne atomy danego pierwiastka powstające podczas atomizacji przechodzą ze stanu podstawowego do stanu wzbudzonego

W zależności od sposobu otrzymania wolnych atomów rozróżnia się absorpcyjną spektrofotometrię

Płomieniową - roztwór próbki rozpyla się bezpośrednio w obszarze płomienia palnika, gdzie następuje kolejno odparowywanie rozpuszczalnika i atomizacja w wyniku dysocjacji termicznej

Bezpłomieniową - gdy następuje elektrotermiczna atomizacja próbki

APARATURA

Źródło światła Atomizer Monochromator Detektor, Wzmacniacz Miernik

Promieniowanie ze źródła emitującego widmo liniowe charakterystyczne dla oznaczanego pierwiastka, przechodzi przez atomizer, do którego wprowadzana jest badana próba i pada na szczelinę monochromatora, który z kolei oddziela linię rezonansową od pozostałych, co następnie w detektorze zostaje przetworzone na sygnał elektryczny, mierzony na mierniku (pomiar absorbancji)

Źródło promieniowania

Źródło promieniowania stanowi na ogół lampa z katodą wnękową

Katoda powinna emitować promieniowanie atomów metalu, który chcemy oznaczać; wadę tę eliminują lampy dwu lub trójpierwiastkowe, których katody są wykonane z mieszanin proszków metali

Atomizery płomieniowe

• Oznaczany pierwiastek występuje na ogół w formie związku chemicznego, z którego należy wydzielić go w postaci wolnych atomów

• Najczęściej używanym atomizerem jest płomień

• Rozpylane w gazach kropelki cieczy docierają do stożka wewnętrznego (świecąco - redukującego), gdzie odparowują, a związek chemiczny zawierający oznaczany pierwiastek ulega dysocjacji

Proces ten jest bardzo krótkotrwały (około kilku tysięcznych sekundy) i można w nim rozróżnić następujące etapy

1. Odparowanie rozpuszczalnika - powstaje aerozol (ciało stałe - gaz)

2. Stopienie i parowanie stałych cząstek - powstają pary soli (MA)

3. Dysocjacja termiczna MA M+A

Do najczęściej stosowanych płomieni należą płomień

• Powietrze - acetylen, podtlenek azotu - acetylen (dla pierwiastków tworzących trudno dysocjujące tlenki)

• Powietrze - metan (dla metali łatwo ulegających jonizacji)

Płomień jako atomizer łatwy i tani w użyciu ma wady, do których należy:

• Mała wydajność atomizacji

• Absorpcja promieniowania przez gazy płomienia

• Niejednorodność oraz interferencje fizyczne i chemiczne

Dlatego też wprowadzono atomizację bezpłomieniową

Atomizery bezpłomieniowe

Obecnie do atomizacji elektrotermicznej wykorzystuje się głównie atomizery typu kuwety grafitowej

Urządzenie to jest ogrzewane elektrycznie w czterech etapach

1. Próbkę odparowuje się w temperaturze 100-200 C w czasie do kilkudziesięciu sekund

2. Próbka ulega mineralizacji

3. Odparowanie i atomizacja próbki w temperaturze 1000-3000 C i w czasie do kilku sekund

4. Czyszczenie kuwety z próbki przed następnym cyklem pomiarowym

Monochromatory

• Monochromator ma oddzielić linię rezonansową od innych linii emitowanych przez źródło i płomień, ważnym parametrem pomiaru jest więc szerokość szczeliny monochromatora

• Optymalna szerokość szczeliny jest kompromisem między dobrą rozdzielczością monochromatora, a ilością światła padającego na detektor

• Używane monochromatory są to pryzmaty i siatki dyfrakcyjne

Detektor

Zadaniem detektora jest mierzenie natężenia padającego promieniowania i porównanie wyników do wzorca (krzywej wzorcowej)

INTERFERENCJE FIZYCZNE I CHEMICZNE

Zakłócenia w metodzie ASA można podzielić na trzy grupy

Zakłócenia spektralne - powstają w wyniku nakładania się linii lub pasm absorpcyjnych i emisyjnych. Dwa różne pierwiastki w roztworze mogą mieć linie absorpcyjne o zbliżonych długościach fali i mogą nawzajem absorbować emitowane promieniowanie

Zakłócenia fizyczne - wynikają ze zmian fizycznych własności roztwrorów, mają one wpływ na wydajność procesu atomizacji

Zakłócenia chemiczne - są spowodowane reakcjami chemicznymi zachodzącymi w płomieniu

FOTOMETRIA PŁOMIENIOWA

ZASADA FOTOMETRII PŁOMIENIOWEJ

• Fotometria płomieniowa jest działem spektralnej analizy emisyjnej i oparta jest na zjawisku emisji

• Metoda służy do oznaczania pierwiastków o niskich potencjałach wzbudzenia, tj Na, K, Ca, Ba, Mg

• Pod wpływem energii termicznej atomy oznaczanych pierwiastków ulegają wzbudzeniu w płomieniu i przy powrocie do stanów podstawowych emitują kwanty promieniowania o charakterystycznej długości fali właściwej dla każdego pierwiastka

APARAT DO FOTOMETRII PŁOMIENIOWEJ

Źródło wzbudzenia termicznego (płomień palnika gazowego) Monochromator Detektor Rejestrator

ZASADA OZNACZENIA PRZY UŻYCIU APARATU DO FOTOMETRII PŁOMIENIOWEJ

W fotometrii płomieniowej pracuje się głównie z próbkami ciekłymi, dlatego badaną substancję, zwykle uprzednio spopieloną, rozpuszcza się w kwasie przed naniesieniem na aparat

• Najczęściej stosuje się mieszaninę gazu palnego (acetylen, propan) i gazu utleniającego (powietrze)

• Cząsteczki w płomieniu palnika dysocjują (atomizacja), a powstałe atomy ulegają wzbudzeniu i emitują charakterystyczne promieniowanie

• W celu wyodrębnienia światła o najwęższym zakresie spektralnym jest ono przepuszczane przez monochromator (filtr) i kierowane na detektor, którym jest fotoogniwo lub fotopowielacz

• W tym elemencie następuje zamiana światła na prąd elektryczny, którego wielkość jest odpowiednio rejestrowana za pomocą galwanometru

• Otrzymany wynik odnosi się do krzywej wzorcowej

Na stopień dokładności w oznaczaniu mają wpływ

• Rodzaj badanego produktu

• Sposób przechowywania i przygotowania próbki

• Wybór właściwej metody oznaczania

• Stopień czystości odczynników

• Odstępy czasowe między etapami analizy

• Doświadczenie analitryczne badającego

• Wyposażenie laboratorium

OZNACZANIE ZAWARTOŚCI WITAMIN W PRODUKTACH ŻYWNOŚCIOWYCH

W procedurach oznaczania witamin w celu uniknięcia błędów stosuje się

• Standard wewnętrzny

• Standard zewnętrzny

• Test odzyskania

Standard wewnętrzny

Polega na równoczesnym przeprowadzeniu przez wszystkie etapy analizy próbki badanej oraz próbki badanej ze ściśle określonym dodatkiem wzorca badanej witaminy (ilość badanej witaminy powinna być bliska spodziewanej zawartości w próbce)

Standard zewnętrzny

Roztwór standardowy zawierający znane stężenie witaminy, pozbawiony substancji interferujących znajdujących się w próbce, zostaje poddany identycznemu traktowaniu, jak próbka

Test odzyskania

Próba A

Standard Pomiar (aparat)

Próba B

Standard Procedura oznaczenia Pomiar (aparat)

Test odzysku = B/A * 100%

Odczyty wyników uzyskane dla prób A i B powinny być równe lub bliskie wartości uzyskanej dla standardu traktowanego oddzielnie, czyli próby A

WYKŁAD 10 16.12.2008

WITAMINA A

Pod pojęciem witaminy A rozumiemy wszystkie pochodne beta-jononu, wykazujące aktywność biologiczną i podobieństwo strukturalne do all-trans-retinolu (forma alkoholowa witaminy A)

Zaliczamy do nich

• Retinal

• Estry retinylu (octowy i palmitynowy)

• Kwas retinowy i jego sole

• Pochodne retinolu i retinalu

Wzory:

• Retinol

• Retinal

• Kwas retinowy

• 3-dehydroretinal

• 11-cis-retinaldehyd

• 5,6-epoksyretinol

• Anhydroretinol

• 4-ketoretinol

• Retinyl beta-glukuronid

• Fosforan retinylu

• Palmitynian retinylu

Witamina A - zawartość retinolu w wybranych produktach w mikrogramach/100g

Mięso

• Wątroba wołowa 14200

• Wątroba wiepszowa 13000

• Wątróbki drobiowe 9300

• Mięso 0-50

Tłuszcze

• Olej z wątroby halibuta 900 000

• Olej z wątroby dorsza 18 000

• Masło, margaryny 600-900

Produkty mleczne

• Sery podpuszczkowe 160-450

• Mleko w proszku pełne 175

• Śmietany 60-220

• Sery twarogowe 10-100

• Mleko krowie 15-25

• Jogurty, kefiry 10-15

Jaja

• Jaja kurze całe 300

Ryby

• Ryby i przetwory rybne 0-175

Wykorzystanie witaminy A z diety

Zwiększa	Zmniejsza
- Odpowiednia ilość i jakość białka - Rodzaj, ilość i świeżość tłuszczu - Obecność środków emulgujących - Obecność pro i przeciwutleniaczy	- Obecność błonnika - Niedobór cynku - Obecność azotanów, azotynów - Alkohol - Wolne rodniki

Wykorzystanie witaminy A z dziennej racji pokarmowej wynosi około 80%

Zawartość witaminy A w produktach podaje się w następujących jednostkach

- j.m. (jednostki międzynarodowe)

- mikrogramy (10^-6 g)

- miligramy (10^-3 g)

- równoważnikach (ekwiwalentach) retinolu

1 j.m. witaminy A = 0,3 mikrogramy retinolu

0,344 mikrogramy octanu retinylu

0,55 mikrogramów palmitynianu retinylu

1 równoważnik (ekwiwalent) retinolu = 1 mikrogram retinolu

Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach są wrażliwe na działanie

• Tlenu

• Promieni słonecznych

• Są łatwo utleniane przez nadtlenki kwasów tłuszczowych

• Obecność katalizatorów (np. śladów miedzi) w wysokich temperaturach wpływa na ich niszczenie

Do oznaczania witaminy A zaleca się metody:

• Spektrofotometrii w zakresie nadfioletu

• Kolorymetryczne (z trójchlorkiem antymonu, kwasem trójfluorooctowym lub trójchlorooctowym)

• Fluorymetryczną

• Wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC)

METODA POMIARU SPEKTROFOTOMETRYCZNEGO W ZAKRESIE NADFIOLETU

• Metoda polega na pomiarze absorbancji all-trans alkoholowej postaci witaminy A w roztworze alkoholu izopropylenowego przydługości fali 325 nm

• Absorbancja przy tej długości fali jest wprost proporcjonalna do stężenia witaminy A

• Metoda ta odnosi się jedynie do wolnej, alkoholowej postaci witaminy A

• Metoda spektrofotometryczna nie nadaje się do oznaczania witaminy A w produktach spożywczych

• Jest bardzo przydatna m.in. do sprawdzenia czystości i zawartości witaminy A w roztworach standardowych

METODY KOLORYMETRYCZNE

Opierają się na reakcji barwnej, jaką daje witamina A z takimi związkami jak:

• Trójchlorek antymonu

• Kwas trójfluorooctowy

• Kwas trójjodooctowy

W roztworach chloroformu, chlorku metylenu lub chlorku etylenu

Ilość substancji interferujących ogranicza się głównie do karotenoidów oraz produktów rozpadu i pochodnych witaminy A. Dają one podobne zabarwienie ze stosowanymi odczynnikami.

Metoda kolorymetryczna z reakcją Carr-Price'a - polega na pomiarze absorbancji powstałego zabarwienia, jakie daje witamina A z trójchlorkiem antymonu (SbCl3) przy długości fali 620 nm

• Metoda ta oznacza zarówno izomery trans, jak i cis, których aktywność biologiczna jest różna

• W przypadku produktów wzbogacanych w syntetyczną witaminę A, zawierających izomery cis, wskazane jest oznaczenie obu form, poprzez zastosowanie bezwodnika maleinowego, który reagując z izomerami cis zapobiega ich reakcji z SbCl3

• Z różnicy dwóch wartości uzyskanych w reakcji z SbCl3 (jednej dla mieszaniny izomerów, a drugiej po wyeliminowaniu izomerów cis) można poznać skład tych izomerów i obliczyć ich aktywność biologiczną

• Związkami dającymi podobne zabarwienie z trójchlorkiem antymonu lub hamującymi rozwój barwy są głównie karotenoidy oraz różne sterole. Można je wyeliminować za pomocą oczyszczania próbki przy użyciu chromatografii kolumnowej

Niedogodnością w tej metodzie jest:

• Krótkotrwałe zabarwienie z SbCl3 (5-10s)

• Właściwosci korozyjne trójchlorku antymonu

• Wpływ temperatury

• Ślady wody lub alkoholu uniemożliwiające pomiar

Wykonanie oznaczenia:

• Wielkość naważki badanej próby zależy od spodziewanej ilości witaminy A - roztwór chloroformowy powinien zawierać 5-15 j.m. witaminy w 1 cm3

• Wielkość naważek:

• W tłuszczach i olejach 2-10 g

• W innych produktach 5-20 g

• W produktach ubogich w witaminę 20-40 g

• Postępowanie analityczne obejmuje etapy

1. Zmydlanie

2. Ekstrakcję

3. Ewentualne oczyszczanie za pomocą chromatografii

4. Pomiar zawartości witaminy A

Ad.1. Zmydlanie próbki - ma na celu

• Rozłożenie glicerydów do związków rozpuszczalnych w wodzie, tj glicerolu i soli potasowych kwasów tłuszczowych (mydeł)

• Rozkład połączeń białkowo-witaminowych

Zmydlanie próbki:

• 50% roztwór KOH

• 0,5 cm3 KOH na 1g próbki

• W tłuszczach 1 cm3/1g

• Do produktów mieszanych (np. racji pokarmowych) roztwór ługu powinien być bardziej stężony

• Ilość dodawanego do zmydlania alkoholu absolutnego powinna wynosić 2x więcej niż masa próbki, a przy tłuszczach kilkakrotnie więcej

Stosunek alkoholu do KOH w wielu analizacj wynosi 1:10

Witamina A, karotenoidy i sterole zachowują swoje pierwotne właściwości fizykochemiczne, tworząc tzw frakcję związków niezmydlających się, którą można następnie wyekstrahować rozpuszczalnikami organicznymi

Czasami zaleca się uprzednie wyekstrahowanie tłuszczu z suchego materiału (np. w aparacie Soxhleta), a następnie przeprowadzenie hydrolizy (zmydlania)

Czas zmydlania - 10 do 60 minut (zależnie od produktu)

Dodatek przeciwutleniacza - np. hydrochinon, pirogallol, BHT

Proces zmydlania należy prowadzić w następujący sposób

• Odważoną w kolbie stożkowej próbkę zalać alkoholem

• Dodać określoną ilość ługu

• Całość wymieszać i umieścić na łaźni wodnej pod chłodnicą powietrzną

• Ogrzewać do wrzenia, aż do całkowitego sklarowania próby

Ad.2. Ekstrakcja

Hydrolizat ekstrahować kilkakrotnie (3-5 razy) mieszanin eteru dietylowego i naftowego uniemożliwiając rozdzielenie się warstw (górnej - eterowej i dolnej - wodnej)

Ad.3. Oczyszczenie za pomocą chromatografii kolumnowej

Chromatografia na tlenku glinu - eliminuje przeszkadzające w oznaczeniu witaminy A karotenoidy

Chromatografia na tlenku magnezu - eliminuje kryptoksantynę oraz jednohydroksypochodne karotenoidów

Określenie zawartości betakarotenu w próbie

• Jeżeli uzyskany ekstrakt eterowy ma barwę żółtą, należy przed oznaczeniem witaminy A określić stężenie betakarotenu

• W tym celu zmierzyć absorbancję roztworu przy długości fali 450 nm wobec eteru

• Otrzymaną wartość przeliczyć na zawartość betakarotenu w 100g produktu (posługując się krzywą standardową i uwzględniając rozcieńczenia

Ad.4. Pomiar zawartości witaminy A

• Zagęścić ekstrakt eterowy na łaźni wodnej lub w wyparce próżniowej rotacyjnej w atmosferze azotu

• Wykonać reakcję Carr-Price'a (w kuwecie kolorymetrycznej)

0,1 cm3 roztworu chloroformowego witaminy A

+ 2-3 krople bezwodnika kwasu octowego

+ 1 cm3 25% chloroformowego roztworu SbCl3

Zmierzyć absorbancję w czasie 5-10 s przy długości fali 620 nm wobec próby „ślepej” (chloroform i bezwodnik kwasu octowego)

METODA FLUORYMETRYCZNA

• Metoda bardziej czuła i dokładniejsza od metod kolorymetrycznych

• Próbka wymaga uprzedniego zmydlenia i ekstrakcji

• W metodzie tej wykorzystuje się zjawisko emisji żółto-zielonej fluorescencji przez witaminę A pod wpływem wzbudzenia promieniowaniem UV (330-340 nm), światło emitowane 480nm

• Metoda wymaga przygotowania krzywych standardowych i ustalenia poprawki na fluorescencję fytofluenu

Znajduje szczególne zastosowanie do oznaczeń witaminy A w mleku i produktach mlecznych, ponieważ te produkty nie zawierają fytofluenu

METODA WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ (HPLC)

• Próbka jest zmydlana, a następnie ekstrahowana kilkakrotnie mieszaniną eterów etylowego i naftowego

• Zawartość witaminy A jest oznaczana przy pomocy HPLC w układzie faz odwróconych detektorem UV/VIS: długość fali - 326 nm; eluent - 98% etanolu + 2% wody

• Analizę ilościową należy przeprowadzić na podstawie powierzchni piku

• Możliwe jest również przeprowadzenie analizy przy użyciu detektora fluorymetrycznego

BETA-KAROTEN

Karotenoidy o właściwościach prowitaminy A są nazwą opisową dla wszytkich karotenoidów wykazujących aktywność biologiczną betakarotenu

Zawartość betakarotenu w wybranych produktach spożywczych w mikrogramach/100g

Warzywa i owoce

• Marchew, dynia, botwina, papryka czerwona, szczaw, szczypiorek, szpinak, natka pietruszki pow 3000

• Agrest, arbuz, brzoskwinia, morele, pomarańcza, śliwki, wiśnie pow 100

Zwierzęta nie mają zdolności syntetyzowania karotenoidów, ale mogą wchłaniać i gromadzić barwniki dostarczane z paszą, stąd niektóre produkty pochodzenia zwierzęcego, np. mleko, masło, jaja zawierają karotenoidy

Produkty mleczne

• Sery podpuszczkowe 100-400

• Mleko w proszku pełne 150

• Śmietany 50-190

• Sery twarogowe 3-60

• Mleko krowie, jogurty, kefiry 10-20

Jaja

• Jaja kurze całe 280

Obecnie znanych jest ponad 400 barwników karotenoidowych naturalnych, ale tylko kilkanaście z nich odgrywa istotną rolę zdrowotną

Barwniki karotenoidowe można podzielić na 4 grupy

• Karoteny - alfa, beta, gamma-karoteny oraz likopen

• Ksantofile - oksy- i hydroksypochodne karotenów, m.in. kryptoksantyna, luteina

• Estry ksantofili - z kwasami tłuszczowymi

• Kwasy karotenoidowe - karboksylowe pochodne karotenów

Marchew - beta-karoten

Pomidory - likopen

Owoce palmy - kryptoksantyna

Kukurydza - zeaksantyna

Czerwona papryka - kapsantyna i kapsorubina

Owoce dzikiej róży - rubiksantyna

Owoce, warzywa - fitoen, fitofluen (bezbarwne karotenoidy)

Wykorzystanie beta-karotenu z diety

Zwiększa	Zmniejsza
-Odpowiednia ilość i jakość białka -Rodzaj, ilość i świeżość tłuszczu -Obecność środków emulgujących -Obecność pro i przeciwutleniaczy	-Obecność błonnika -Zbyt duża ilość żelaza -Obecność azotanów i azotynów -Alkohol -Wolne rodniki

Wykorzystanie beta-karotenu z dziennej racji pokarmowej wynosi około 30%

1 j.m. = 0,6 mikrogramów beta-karotenu

1,2 mikrogramy karotenoidów o aktywności biologicznej prowitaminy A

1 równoważnik (ekwiwalent) retinolu = 6 mikrogramów betakarotenu

12 mikrogramów pozostałych prowitamin A

Rówoważniki (ekwiwalenty) retinolu (mikrogramy) = (beta-karoten x 0,167) + (pozostałe prowitaminy A x 0,084)

WYKŁAD 11 6.01.2009

Karotenoidy wykazują następujące właściwości fizyczne i chemiczne:

• Są rozpuszczalne w tłuszczach

• Są łatwo rozpuszczalne w chloroformie, benzenie, eterze naftowym, trudno rozpuszczalne w alkoholu

• Są wrażliwe na utlenianie, autooksydację, światło

• Są oporne na działanie podwyższonej temperatury w atmosferze beztlenowej z wyjątkiem zmian stereoizomerycznych

• Mają charakterystyczne widmo absorpcji z różnym maksimum, zależnie od stosowanego rozpuszczalnika

Do oznaczania karotenoidów zaleca się metody:

• Chromatografii kolumnowej

• Wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) - inna metoda pozwalająca na rozdzielenie karotenoidów

- Najczęściej stosowaną metodą oddzielania i oznaczania różnych karotenoidów jest chromatografia kolumnowa

- Różnice w budowie poszczególnych barwników pozwalają na rozwinięcie na kolumnie chromatograficznej wyraźnych stref adsorpcji przy zastosowaniu odpowiedniego adsorbentu i mieszanin eluujących

- Z różnych stosowanych adsorbentów do rozdziału karotenoidów najlepszy jest tlenek magnezu i celit zmieszane w stosunku 1:3, z zastosowaniem do wymywania 2-5% acetonu w eterze naftowym

Rozdział karotenoidów na kolumnie chromatograficznej (pojawiają się strefy adsorpcji w następującej kolejności od góry) (przykładowe karotenoidy)

• Likopen

• Izomery likopenu

• Gamma-karoten

• Beta-karoten

• Alfa-karoten

• Fitofluen (phytofluene)

Do produktów pochodzenia zwierzęcego oraz mieszanin zawierających obok karotenoidów witaminę A, zaleca się stosowanie tlenku glinu, a do eluowania obok eteru naftowego z 2-5% dodatkiem acetonu heksan

METODA CHROMATOGRAFII KOLUMNOWEJ - metoda ta polega na pomiarze przy długości fali świetlnej 450 nm absorbancji eterowych roztworów beta-karotenu i pozostałych karotenoidów wyizolowanych za pomocą adsorpcyjnej chromatografii kolumnowej

Wykonanie oznaczenia beta-karotenu

Postępowanie analityczne obejmuje etapy:

• Ewentualne zmydlanie próbki i ekstrakcje oznaczanych karotenoidów

• Rozdział na kolumnie chromatograficznej

• Pomiar zawartości beta-karotenu

1. Ekstrakcja karotenoidów

• Odważyć 5-10 g zhomogenizowanej próbki zawierającej 10-500 mikrogramów karotenoidów

• Wykonać ekstrakcję karotenoidów po uprzednim zmydlaniu próby eterem naftowym (zmydlanie próbki zalecane jest przede wszystkim do produktów pochodzenia zwierzęcego oraz mieszanych i zawierających tłuszcz)

• Lub po roztarciu próby z bezwodnym siarczanem sodu, do uzyskania jednorodnej suchej masy

• Uzyskany ekstrakt eterowy odparować do sucha w atmosferze azotu na łaźni wodnej lub w wyparce próżniowej rotacyjnej

• Suchą pozostałość rozpuścić w 1-2 cm3 eteru naftowego

2. Kolejność warstw w kolumnie: (kolejność dodawania - przygotowanie kolumny chromatograficznej)

• Wata

• Na2SO4 bezwodny

• Al2O3

• Na2SO4 bezwodny

3. Pomiar zawartości beta-karotenu

• Zmierzyć absorbancję roztworu przy długości fali 451 nm wobec eteru naftowego jako próby „ślepej”

• Zawartość beta-karotenu odczytać z krzywej wzorcowej, a następnie po uwzględnieniu współczynników rozcieńczeń podać w mikrogramach na 100 g produktu

WITAMINA E

Jest to grupa związków obejmująca wszystkie pochodne tokoli i tokoferoli wykazujących aktywność biologiczną alfa-tokoferolu, zawierająca 4 tokoferole i 4 tokotrienole

Zawartość witaminy E w wybranych produktach spożywczych w mg/100g

Produkty zwierzęce

• Mięso 0,3-0,6

• Halibut 0,9

• Dorsz 0,3

• Mleko 0,1

• Masło 0,3-7,0

• Jaja 1,0

Produkty roślinne

• Kasza jęczmienna 0,5

• Płatki owsiane 0,8

• Ryż 0,2

• Chleb pszenny 0,4

• Chleb żytni 0,7

• Kiełki pszenicy 10-26

• Warzywa 0,1-2,5

• Owoce 0,2-1,3

Oleje roślinne

• Słonecznikowy 48-52

• Sojowy 4-14

• Rzepakowy 15-22

Margaryny 5-37

Wykorzystanie witaminy E z dziennej racji pokarmowej wynosi od 20 do 80 % - średnio 40%

Zawartość witaminy E w produktach podaje się w j.m. lub mg

1 mg d-alfa-tokoferolu = 0,91 mg octanu d-alfa-tokoferolu = 1,75 mg d-beta-tokoferolu = 7,0 mg d-gamma-tokoferolu

1 mg octanu dl-alfa-tokoferolu = 1 j.m.

1 mg octanu d-alfa-tokoferolu = 1,36 j.m.

1 mg d-alfa-tokoferolu = 1,49 j.m.

Witamina E jest wrażliwa na działanie:

• Tlenu

• Ogrzewania powyżej 200 C

• Obecność katalizatorów (np. śladów miedzi, żelaza) w wysokich temperaturach wpływa na jej zniszczenie

• Środowiska kwaśnego i zasadowego

Na wykorzystanie z diety witaminy E wpływa

• Obecność wielonienasyconych kwasów tłuszczowych [alfa-tokoferol (mg) / NNKT (g) = 0,6]

• Selen, cynk, żelazo, miedź

• Witamina A

• Witamina C

• Metale ciężkie

• Nitrozoaminy

• Dwutlenek azotu

Do oznaczania witaminy E zaleca się metody

• Kolorymetryczną z reakcją Emmerie-Engla

• Fluorymetryczną

• Wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC)

• Chromatografię gazową (GC)

Oraz metody biologiczne

Etapy poprzedzające oznaczanie właściwe metodami chemicznymi

1. Przygotowywanie próbki

Wielkość naważki - w zależności od rodzaju produktu 2-40 g (ilość tokoferoli do oznaczenia 4-60 mikrogram)

Zalecane sposoby przygotowania próbki

• Tłuszcze i oleje - lekko ogrzać do stopienia, dobrze wymieszać, wykonać naważkę i zmydlać bezpośrednio

• Mleko płynne, w proszku, odżywki mleczne - wyekstrahować tłuszcz poprzez wytrząsanie kolejno próby z alkoholem etylowym, eterem etylowym, eterem naftowym, zebrane frakcje eterowe połączyć i odparować do sucha otrzymując tłuszcz

• Produkty zawierające większą ilość wody - utrzeć z bezwodnym siarczanem sodu aż do otrzymania suchej mieszaniny. Przenieść ilościowo do gilzy aparatu Soxhleta i prowadzić ekstrakcję tłuszczu alkoholem etylowym absolutnym w ciągu 10-16 godzin

• Produkty suche - zemleć, umieścić w gilzie aparatu Soxhleta, prowadzić ekstrakcję alkoholem etylowym absolutnym w ciągu 10-16 godzin. Otrzymany ekstrakt wytrząsać z eterem naftowym, zebraną frakcję eterową odparować do sucha otrzymując tłuszcz

2. Zmydlanie próby (hydroliza zasadowa)

• Prowadzić na wrzącej łaźni wodnej pod chłodnicą zwrotną w atmosferze azotu przy użyciu stężonego (50-60%) wodorotlenku potasu (0,5-1 cm3/1 g próbki) i małej ilości alkoholu w obecności przeciwutleniaczy (pirogallolu, kwasu askorbinowego lub hydrochinonu)

• Nadmiar pirogallolu może utrudniać późniejszą chromatografię, ponieważ produkty jego utleniania są rozpuszczalne w eterze i heksanie

• Ograniczyć czas zmydlania do minimum

• Dodatkowym środkiem ostrożności przy zmydlaniu jest zastosowanie czynnika chelatującego (EDTA-Na - wersenianu dwusodowego) w ilości 0,1-0,2 g dla związania śladów metalu

• Zmydlanie jest etapem, podczas którego mogą zachodzić znaczne straty tokoferoli, dlatego należy przeprowadzić odzysk dodawanego alfa-tokoferolu

3. Ekstrakcja witaminy

• Po zmydleniu przeprowadzić 3-krotną ekstrakcję porcjami mieszaniny eterów dietylowego (wolnego od nadtlenków) i naftowego (1:2)

• Połączone ekstrakty przemyć kilkakrotnie wodą do odczynu obojętnego (wobec fenoloftaleiny), a następnie przesączyć w celu osuszenia przez warstwę bezwodnego siarczanu sodu

• Odparować rozpuszczalnik do sucha w atmosferze azotu

• Stosować np. benzen, heksan, lub bezwodny etanol jako rozpuszczalniki suchej pozostałości

4. Rozdział chromatograficzny (niezbędny przy wykonywaniu oznaczenia metodą kolorymetryczną lub fluorymetryczną)

• Nanieść za pomocą mikropipety lub mikrostrzykawki benzenowy roztwór na płytkę chromatograficzną pokrytą żelem krzemionkowym z dodatkiem 0,004% soli sodowej fluoresceiny (uraniny)

• Naniesione krople suszyć strumieniem azotu

• Natychmiast po zakończeniu nakładania próbek i standardu umieścić płytkę w komorze chromatograficznej zawierającej rozpuszczalnik (np. benzen:alkohol etylowy 99:1 lub chloroform lub benzen:alkohol metylowy 98:2); komorę przykryć

• Gdy czoło rozpuszczalnika dojdzie do szczytu płytki, wyjąć ją z komory, osuszyć w strumieniu azotu i w świetle UV (366 nm lub 254 nm) obrysować identyfikując poszczególne zgaszone plamy tokoferoli (standardu i próby badanej)

• Można również dodatkowo spryskać płytki odczynnikiem wywołującym zabarwienie (np. stosując mieszaninę 0,1% chlorku żelazowego i alfa-alfa'-dwupirydylu (1:1) lub 0,2% roztwór 4,7-dwufenylo-1,10-fenantroliny w alkoholu etylowym lub kwas fosforomolibdenowy

5. Eluowanie

• Zakreślone na płytce obszary żelu zeskrobać za pomocą szpatułki, przenieść do poszczególnych próbówek wirówkowych

• Dodać alkohol etylowy, energicznie wytrząsać, a następnie całość odwirować

• Po odwirowaniu część płynu znad osadu pobrać do oznaczeń kolorymetrycznych lub fluorymetrycznych

Oznaczanie kolorymetryczne z reakcją Emmerie-Engla

• Pobrać uprzednio przygotowane po rozdziale chromatograficznym poszczególne roztwory otrzymanych tokoferoli do próbówek kolorymetrycznych dodając 0,5% roztwór alfa-alfa'-dwupirydylu i 0,2% roztwór chlorku żelazowego

• Powstałe zabarwienie mierzyć w ciągu 1-2 minut przy długości fali 520 nm, wobec próby odczynnikowej

• W reakcji tej wykorzystuje się właściwości redukcyjne tokoferoli w stosunku do jonów żelazowych (Fe3+ Fe2+)

• Powstałe jony żelazawe łącząc się z alfa-alfa'-dwupirydylem dają barwny czerwony kompleks

• Przez zastąpienie alfa-alfa'-dwupirydylu 4,7-dwufenylo-1,10-fenantroliną do redukcji żelaza zwiększa się około 3-krotnie czułość metody, a czas reakcji ulega skróceniu do 10-30 sekund; pomiar natężenia barwy 534 nm

METODA WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ (HPLC)

• Wykonaną naważkę badanego produktu zmydlić, a zmydlony hydrolizat ekstrahować mieszaniną eterów etylowego i naftowego (1:2); osuszone połączone ekstrakty odparować w atmosferze azotu, a suchą pozostałość rozpuścić w bezwodnym etanolu

• Nanieść roztwór badanej próbki na aparat

• Jako fazę ruchomą stosować roztwór metanolu i wody (98:2), długość fali 285 nm; szybkość przepływu 1,2 ml/min

• Analizę ilościową przeprowadzić na podstawie powierzchni pików próby badanej i standardów witaminy E

TIAMINA - WITAMINA B1

Występuje w produktach w postaci

• Niezestryfikowanej (tzw wolna tiamina)

• Fosforanów (mono-, di- i trifosforanów <wzory>)

Zawartość tiaminy w wybranych produktach spożywczych w mg/100g

Produkty zwierzęce

• Jaja kurze całe 0,065

• Mięso wieprzowe 0,40 - 1,00

• Pozostałe mięsa 0,04 - 0,18

• Wędliny 0,04 - 0,90

• Ryby i przetwory rybne 0,02 - 0,25

• Mleko w proszku pełne 0,30

• Mleko i produkty mleczne 0,02 - 0,05

Produkty roślinne

• Nasiona strączkowe (suche) 0,70 - 0,80

• Produkty zbożowe 0,10 - 0,70

• Warzywa i owoce świeże 0,02 - 0,10

Tiamina jest wrażliwa na działanie

• Temperatury powyżej 100C (odporna na ogrzewanie jedynie w środowisku kwaśnym)

• Tlenu i promieni jonizujących

• Niskich temperatur (w środowisku obojętnym lub alkalicznym)

• Dwutlenku siarki

• Tiaminazy (obecnej np. w surowych rybach i mięczakach)

• Katalizatorów Cu2+ i Fe3+

Do oznaczania tiaminy zalecane są metody

• Tiochromowa

• Za pomocą techniki HPLC

• Mikrobiologiczne, w których jako organizm testowy używane są różne drobnoustroje, do których wzrostu niezbędna jest tiamina, np. Lactobacillus fermenti i viridescens, Kloeckera brevis, Ochromonas danica i inne

METODA TIOCHROMOWA - polega na utlenianiu tiaminy przy użyciu K3Fe(CN)6 w środowisku zasadowym do tiochromu, który odznacza się intensywną niebieską fluorescencją (435 nm) po naświetleniu światłem o długości fali 365 nm

Utlenianie

Chlorowodorek tiaminy ^NaOH chlorek

Chlorek hydroksyd

Hydroksyd tiochrom

Fluorescencja w przypadku roztworów pozbawionych innych związków fluoryzujących jest w standardowych warunkach proporcjonalna do stężenia tiochromu, a pośrednio do zawartości tiaminy w roztworze

Metoda tiochromowa jest najczęściej stosowaną metodą oznaczania tiaminy w żywności

Przed przeprowadzeniem reakcji utlenienia konieczne jest:

• Uwolnienie tiaminy z połączeń białkowo - fosforanowych, w jakich występuje naturalnie w produktach, za pomocą hydrolizy kwasowej (0,1 n HCl) i enzymatycznej (enzym Taka-Diastase)

• Oddzielenie jej od innych substancji fluoryzujących i interferujących poprzez oczyszczenie roztworu na kolumnie jonowymiennej wypełnionej amberlitem

Metoda tiochromowa

• Wykazuje dużą specyficzność

• Jest stosunkowo szybka i niezbyt pracochłonna

• Wymaga odpowiedniego sprzętu (fluorymetru)

METODA PRZY UŻYCIU TECHNIKI HPLC - polega na wstępnym uwolnieniu tiaminy z połączeń białkowych i fosforanowych, a następnie jej ilościowym oznaczeniu przy użyciu HPLC w układzie faz odwróconych z detektorem fluorymetrycznym

WYKŁAD 12 13.01.2009

RYBOFLAWINA - WITAMINA B2

Zawartość ryboflawiny w wybranych produktach spożywczych w mikrog/100g

• Produkty o zawartości powyżej 1000 (drożdże, mleko w proszku)

• Produkty o zawartości 400-1000 (makrela, grzyby, sery, jajko)

• Produkty o zawartości 100-400 (strączkowe suche, mięso, ryby, mleko, kasza gryczana, płatki owsiane, kukurydza, brokuły)

• Produkty o zawartości poniżej 100 (większość warzyw i owoców, zbożowe)

Wchłanianie witaminy B2 z przewodu pokarmowego jest ściśle związane z podawaną dawką

Maksimum wchłaniania ma miejsce w dawkach nie przekraczających 25 mg

Z większych dawek wchłania się 50% ryboflawiny

Ryboflawina jest wrażliwa na działanie

• Temperatur w środowisku obojętnym lub alkalicznym (odporna na ogrzewanie jedynie w środowisku kwaśnym)

• Światła i promieni UV

• Katalizatorów Cu²⁺ i Fe³⁺

Do oznaczania ryboflawiny zalecane są metody:

• Fluorymetryczna

• Lumiflawinowa

• Za pomocą techniki HPLC

• Mikrobiologiczne, w których jako organizmy testowe używane są różne drobnoustroje, do których wzrostu niezbędna jest ryboflawina, np. Lactobacillus casei, Streptococcus zymogenes i inne

METODA FLUORYMETRYCZNA - polega na pomiarze charakterystycznej dla ryboflawiny zielonożółtej fluorescencji o maksymalnej intensywności przy pH około 7;

- Długość fali światła wzbudzającego 450 nm, długość fali pomiaru światła emitowanego 524 nm.

- Pomiary wykonywane są jednakże przy pH około 4,5 (w granicach 3-5), ponieważ przy takim pH intensywność fluorescencji jest stosunkowo stała i niezależna od szeregu czynników interferujących, tj stężenia soli czy cukrów, obecności jonów żelaza itp.

• Natężenie fluorescencji jest wprost proporcjonalne do stężenia witaminy w badanym roztworze

• Odczytu fluorescencji można dokonywać z krzywej wzorcowej lub przy użyciu standardu wewnętrznego, tzn stosując dodatek czystej ryboflawiny dodanej w ściśle określonej ilości do próbki równoległej do badanej

• Istotne znaczenie w tej metodzie ma stopień oczyszczenia próbki

Oznaczenie przebiega w trzech etapach:

1. Ekstrakcja witaminy - ma na celu uwolnienie witaminy z połączeń białkowych i fosforanowych przez zastosowanie hydrolizy kwasowej i enzymatycznej

2. Utlenienie substancji interferujących, stosowane w celu usunięcia innych substancji fluoryzujących i interferujących

3. Pomiar fluorymetryczny - wykonywany jest przed i po chemicznej redukcji ryboflawiny tak, aby z różnicy tych wartości określić faktyczne stężenie witaminy w roztworze

METODA LUMIFLAWINOWA

• Polega na przeprowadzeniu nierozpuszczalnej w chloroformie ryboflawiny pod wpływem naświetlenia (fotoliza) w środowisku zasadowym w rozpuszczalną w chloroformie lumiflawinę

Ryboflawina UV, pH>7 Lumiflawina

• Przemiana ta może jednak nie zachodzić ilościowo, dlatego też konieczne jest stosowanie idealnie powtarzalnych warunków pracy

• Powstały po zakwaszeniu związek można zmierzyć fluorymetrycznie (niebieska fluorescencja)

METODA PRZY UŻYCIU TECHNIKI HPLC

Polega na wstępnym uwolnieniu ryboflawiny z połączeńm białkowych i fosforanowych, a następnie jej ilościowym oznaczeniu przy użyciu HPLC w układzie faz odwróconych z detektorem fluorymetrycznym

WITAMINA C

Właściwości witaminy C wykazuje

• Kwas L-askorbinowy

• Jego forma utleniona - kwas L-dehydroaskorbinowy (wzory)

Zawartość witaminy C w wybranych produktach spożywczych w mg/100g

Warzywa

• Brukselka, brokuły, chrzan, kalafior, kalarepa, kapusta włoska, papryka, natka, szpinak pow 60

• Ziemniaki 11-16

Owoce

• Cytryna, grejpfrut, kiwi, pomarańcza, porzeczki, poziomki, truskawki, dzika róża pow. 40

Produkty zwierzęce

• Wątroby 20-30

• Mleko i produkty mleczne 0-3

Witamina C jest

• Wrażliwa na utlenianie, zwłaszcza w obecności katalizatorów (szczególnie Cu²⁺ i Fe³⁺)

• Wrażliwa na aktywność enzymów utleniających (oksydazy askorbinowej, peroksydazy, polifenolooksydazy)

• Najbardziej stabilna w środowisku kwaśnym (dodanie do próby 2-3% kwasu szczawiowego w celu stabilizacji lub 3% kwasu metafosforowego (HPO3) lub 8% kwasu octowego czy 2% kwasu solnego)

• Nietrwała w środowisku zasadowym i obojętnym

• W roztworach wrażliwa na ogrzewanie

• Wrażliwa na naświetlanie promieniami UV

Do oznaczania witaminy C zaleca się metody:

• Metodę Tillmansa (do oznaczania kwasu askorbinowego)

• Metodę Tillmansa w modyfikacji Pijanowskiego (do oznaczania sumy kwasu askorbinowego i dehydroaskorbinowego)

• Metodę fluorymetryczną (do oznaczania sumy kwasu askorbinowego i dehydroaskorbinowego)

• Metodę z zastosowaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) (do oznaczania kwasu askorbinowego i dehydroaskorbinowego jako oddzielnych związków)

METODA TILLMANSA W MODYFIKACJI PIJANOWSKIEGO

- Metoda Tillmansa polega na redukcji 2,6-dwuchlorofenoloindofenolu o barwie niebieskiej przez kwas askorbinowy w środowisku kwaśnym do bezbarwnego związku

- W punkcie równoważnikowym nadmiar wprowadzonego indofenolu wywołuje pojawienie się różowego zabarwienia roztworu

- Modyfikacja Pijanowskiego dotyczy wstępnego zredukowania siarkowodorem (H2SO4 + Na2S) kwasu dehydroaskorbinowego do kwasu askorbinowego i usunięciu nadmiaru siarkowodoru za pomocą chlorku rtęci (HgCl2)

Oznaczenie przebiega w trzech etapach:

1. Przygotowanie próby i jej stabilizacja przy użyciu 3% kwasu szczawiowego

2. Redukcja kwasu L-dehydroaskorbinowego do kwasu L-askorbinowego przy użyciu siarkowodoru (H2S)

3. Miareczkowanie mianowanym roztworem 2,6-dwuchlorofenoloindofenolu kwasu L-askorbinowego do momentu pojawienia się różowego zabarwienia

Niedogodności metody:

I. Redukcja indofenolu może zachodzić również pod wpływem innych reduktonów, o mniejszym powinowactwie do indofenolu, np.

• SO2 (dodawany do produktów w celu ich utrwalenia - pulpy, przeciery, moszcze). Przepuszczenie przez próbkę strumienia dwutlenku węgla powoduje ulatnianie się dwutlenku siarki

• Jonów Fe²⁺; kwas octowy eliminuje wpływ dwuwartościowego żelaza na wynik miareczkowania

• Reduktonów cukrowych (triozoreduktonów) powstających podczas ogrzewania, szczególnie w środowisku alkalicznym; Zawartość reduktonów cukrowych ustala się w oddzielnej próbce tego samego materiału, po uprzednim związaniu reduktonów białkowych i kwasu L-askorbinowego za pomocą 8% formaldehydu, przy pH = 3,5 w czasie 8 minut. Wynik miareczkowania odpowiada zawartości reduktonów cukrowych

• Reduktonów białkowych zawierających grupy sulfhydrylowe (-SH), które w reakcji z 2,6 - dichloroindofenolem są utleniane do grup dwusiarczkowych; zawartość reduktonów białkowych ustala się po ich związaniu 4% formaldehydem, przy pH = 0,6 w czasie 8 minut. Wynik miareczkowania odpowiada zawartości reduktonów cukrowych i kwasu L-askorbinowego

• Barwników antocyjanowych podlegających utlenieniu odczynnikiem Tillmansa

II. Uchwycenie punktu równoważnikowego przy analizowaniu produktów zawierających znaczne ilości barwników wodorozpuszczalnych o barwie zbliżonej do odczynnika Tillmansa (np. antocyjanów o barwie amarantowej) jest utrudnione i wymaga zastosowania rozpuszczalników organicznych (np. ksylenu, benzenu, chloroformu), w których rozpuszcza się nadmiar indofenolu

III. Metody tej nie należy stosować do produktów zawierających znaczne ilości substancji zasadowych

METODA FLUORYMETRYCZNA

Metoda polega na utlenieniu kwasu L-askorbinowego do L-dehydroaskorbinowego i przeprowadzeniu reakcji z o-fenylenodiaminą, w wyniku której powstaje fluoryzujący kompleks. Jego stężenie określa się na podstawie pomiaru fluorymetrycznego przy długości fali światła wzbudzającego 365 nm i w obecności filtru wtórnego o przepuszczalności światła 430 nm. Natężenie fluorescencji jest wprost proporcjonalne do stężenia witaminy C w badanym roztworze

Metoda fuorymetryczna eliminuje negatywny wpływ

• Barwników antocyjanowych

• Reduktonów w żywności

Oznaczenie przebiega w trzech etapach:

1. Ekstrakcja witaminy z próbki produktu i jej stabilizacja przy użyciu mieszaniny kwasów metafosforowego i octowego. Mieszanina ta zapobiega utlenianiu witaminy przez jony miedzi i żelaza oraz inaktywuje enzymy poprzez denaturację białka

2. Utlenienie kwasu L-askorbinowego do formy dehydro przez zastosowanie wytrzasamoa z węglem aktywowanym

3. Pomiar fluorescencji kompleksu kwasu dehydroaskorbinowego z o-fenylenodiaminą

CHROMATOGRAFIA GAZOWA, GAS CHROMATOGRAPHY - GC

Wszystkie rodzaje chromatografii, jak również chromatografia gazowa, opierają się na zasadzie podziału związków między dwie fazy

• Fazę stacjonarną - ciało stałe lub ciecz trudno lotna osadzona na nośniku lub ścianie kolumny (wypełnienie kolumny)

• Fazę ruchomą - gaz

- Rozdzielenie substancji dokonuje się przez zróżnicowany podział składników pomiędzy fazę ruchomą i stacjonarną

- Chromatografia gazowa służy do rozdzielania mieszanin substancji, które w warunkach chromatografowania mają postać gazów lub par

- Substancje nielotne: sacharydy, aminokwasy, wyższe kwasy tłuszczowe, przed rozdziałem przeprowadza się w lotne pochodne

Chromatograf gazowy składa się z następujących elementów

• Butli z gazem nośnym

• Doprowadzenia gazu nośnego

• Regulatora przepływu gazu

• Układu do wprowadzania i odparowywania próbki

• Kolumny umieszczonej w termostacie

• Detektora

• Wzmacniacza i rejestratora

WYKŁAD 12 20.01.2009

GC - gaz nośny - najczęściej stosuje się gazy obojętne, chemicznie bierne

• Hel

• Azot

• Argon

• Wodór

Kolumny - w chromatografii gazowej stosuje się dwa rodzaje kolumn

• Kolumny z wypełnieniem, o średnicy 2-8 mm, długości kilku metrów

• Kolumny kapilarne o średnicy wewnętrznej 0,2 - 0,3 mm, o długości do kilkuset metrów, o otwartym przekroju dla przepływu gazu nośnego, co znacznie polepsza rozdział w porównaniu z kolumnami pakowanymi

Kolumny mają najczęściej postać spiralnych nawiniętych na walec rurek, tak aby można je było umieścić w termostacie

Materiałem stosowanym do wyrobu kolumn jest:

• Szkło

• Stal

• Lub teflon

Fazy stacjonarne w kolumnach kapilarnych mogą być absorbentami lub cieczami osadzonymi na ściankach kapilar

• Kolumny z warstwą porowatą wypełnione adsorbentem zwane PLOT (porous layer open tubular)

• Kolumny z gładkimi ściankami pokrytymi ciekłą fazą stacjonarną, tzw WCOT (wall coated open tubular)

• Kolumny, na ścianki których naniesiono nośnik nasycony fazą stacjonarną, zwane SCOT (support coated open tubular)

Ciekłe fazy stacjonarne

• Wybór fazy stacjonarnej zależy od rozdzielanej substancji tak, aby faza stacjonarna pod względem chemicznym była podobna do substancji rozdzielanej w myśli zasady że podobne rozpuszcza się w podobnym.

• Odporność termiczna faz stacjonarnych jest ograniczona: przekroczenie temperatur granicznych może wpływać na rozkład fazy i wymycie jej z kolumny przez gaz nośny

Temperatura rozdziału

• Temperatura rozdziału ma duży wpływ na rozdział związków i powinna być zbliżona do ich temperatury wrzenia

• Analizę można prowadzić w stałej temperaturze (chromatografia izotermiczna) lub w programowanej temperaturze (chromatografia gradientowa)

• Proces izotermiczny stosowany jest do rozdziału związków, których temperatury wrzenia nie różnią się więcej niż o kilkadziesiąt stopni. Przy dużych różnicach w temperaturze wrzenia poszczególnych związków stosuje się programowanie temperatury kolumny polegające na wzroście temperatur (C/min) podczas rozdziału

Detektory

Detektory stosowane w chromatografii gazowej mają za zadanie przetworzenie fizycznych bądź fizykochemicznych właściwości wykrywanej substancji na sygnał elektryczny

Z wielu detektorów używanych w chromatografii najczęściej używany jest detektor płomieniowo - jonizacyjny (flame ionization detector) w skrócie zwany FID

Detektor płomieniowo - jonizacyjny - zasada pomiaru polega na zmianie przewodnictwa elektrycznego płomienia wodoru w polu elektrycznym po wprowadzeniu substancji

Oprócz detektora jonizacji płomieniowej w analizie żywności używa się detektorów:

• Cieplno - przewodniościowego (katarometru)

• Wychwytu elektronów (electron capture)

• Do oznaczania określonych grup związków chemicznych detektorów o wysokiej selektywności

Proces rozdziału

• Czynnością wstępną przed wprowadzeniem próbki na kolumnę jest włączenie przepływu gazu nośnego oraz ustalenie jego szybkości przy użyciu przepływomierza umieszczonego za kolumną, jak też temperatury

• Analizowaną próbkę, czystą ciecz lub roztwór w niskowrzącym rozpuszczalniku, pobiera się strzykawką kalibrowaną w ilości kilku mikrolitrów

• Składniki chromatografowanej mieszaniny są wykrywane przez detektor, a odpowiadające im piki są rejestrowane w postaci chromatogramu

• Czas, jaki upływa od momentu naniesienia badanej substancji do momentu zarejestrowania maksimum piku odpowiadającego tej substancji definiowany jest jako czas retencji

• Powierzchnia zawarta pod pikiem na chromatografie jest proporcjonalna do ilości związku przepływającego przez kolumnę i detektor

• Na podstawie wielkości pików można obliczyć skład ilościowy analizowanej mieszaniny, porównując poszczególne piki z ich wzorcami

HPLC - WYSOKOSPRAWNA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA - HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

Chromatografia cieczowa pozwala na rozdzielenie składników jednorodnych mieszanin w wyniku różnego ich podziału między dwie nie mieszające się fazy:

• Ruchomą

• Stacjonarną

- Składniki wykazujące większe powinowactwo do fazy ruchomej poruszają się szybciej niż składniki o większym powinowactwie do fazy stacjonarnej

- Chromatografia cieczowa stosowana jest do grupy związków nielotnych czy rozkładających się w wysokich temperaturach

Aparatura:

• Zbiorniki eluentów

• Pompa

• Manometr

• Dozownik

• Przedkolumna

• Kolumna w termostacie

• Przepływomierz

• Detektor

• Kolektor frakcji

• Rejestrator, komputer

Kolumny

Rozdział chromatograficzny zachodzi w wypełnionej fazą stacjonarną kolumnie

Chromatografia analityczna - rozdział jakościowy i ilościowy; kolumny o średnicach wewnętrznych 4-4,6 mm i długości 10-30 cm

Chromatografia preparatywna - oddzielenie substancji od zanieczyszczeń; kolumny preparatywne rzędu kilku metrów i średnicy wewnętrznej > 1cm

W analityce używa się dwa typy kolumn

• O fazach normalnych (NP., Normal Phase) - polarna faza stacjonarna (np. żel krzemionkowy lub tlenek glinu), niepolarna faza ruchoma

• O fazach odwróconych (RP - Reverse Phase) - niepolarna faza stacjonarna (np. węglowa C-8, C-18, C-30), polarna faza ruchoma

• Kolumny RP są częściej stosowane w analityce

Fazę ruchomą (eluent) stanowią

• Pojedyncze rozpuszczalniki

• Lub ich mieszaniny tworzące mieszaninę jednorodną (nie może tworzyć się emulsja)

Pompowane do komory mieszania pod wysokim ciśnieniem przed podaniem na kolumnę

• Należy używać eluentów o bardzo wysokim stopniu czystości (odczynniki specjalne do HPLC)

• Nawet mała ilość innej substancji w fazie ruchomej może mieć znaczny wpływ na wynik rozdziału (zmiana czasu retencji, ogonowanie pików)

• Moc elucji rozpuszczalników, w przypadku niepolarnej fazy stacjonarnej (stosowanej przy RP), wzrasta w kolejności woda metanol acetonitryl aceton tetrahydrofuran; (im mniejsza jest zawartość acetonitrylu w wodzie, tym bardziej rozdzielony jest chromatogram - schemat)

Podczas rozdziału można stosować

• Stały skład eluentu (chromatografia izokratyczna)

• Zmienny wzajemny stosunek rozpuszczalników w mieszaninie (chromatografia gradientowa)

Elucja gradientowa polepsza rozdzielenie składników mieszaniny analizowanej próbki, a czasem jest wręcz konieczna do ich rozdziału

Detektory

Do wykrywania związków lub ich grup w HPLC stosuje się różne rodzaje detektorów, w których wykorzystuje się właściwości fizyczne rozdzielanych związków, np.

• Absorpcję

• Załamanie światła

• Fluorescencję i inne

Najbardziej rozpowszechnione są detektory UV

• Stosowane m.in. do oznaczania białek, polifenoli, konserwantów, zanieczyszczeń

• Działające na zasadzie absorpcji światła w zakresie ultrafioletu

• Wrażliwe na zmiany szybkości przepływu fazy ruchomej i na zmiany temperatury

• Względna czułość (czyli najmniejsze stężenie substancji rozpuszczonej, które można wykryć) jest równa około 1 nanograma (10^-9 g/kg)

• Zdolność załamywania światła przez związki zawierające asymetryczne atomy węgla (np. sacharydy) wykorzystano w detektorze refraktometrycznym

• Detekcja odbywa się na podstawie pomiaru różnicy załamania światła czystego eluentu i eluentu zawierającego badany związek przepływających przez dwie równoległe cele detektora

• Przy pracy z detektorem refraktometrycznym musi być utrzymana stała temperatura pomiaru, gdyż współczynnik załamania światła zmienia się wraz ze zmianą temperatury

• Detektor ten nie może być stosowany do pomiarów z użyciem elucji gradientowej, gdyż współczynnik załamania światła zmienia się wraz ze zmianą składu fazy ruchomej

• Czułość tego detektora nie przekracza najczęściej 10^-6 g/kg (1 mikrograma)

• Istota detekcji fluorescencyjnej polega na pomiarze intensywności światła, o określonej długości fali, emitowanego przez wykrywany związek w wyniku jego pobudzenia światłem o innej długości fali.

• Detektor fluorescencyjny przy wykrywaniu niektórych związków chemicznych może być około 1000 razy bardziej czuły niż detektor absorpcji w nadfiolecie i umożliwia wykrywanie związków na poziomie pikogramów (10^-12 g/kg)

• Detektor fluorescencyjny jest najbardziej specyficznym i selektywnym detektorem spośród wszystkich detektorów wykorzystywanych w chromatografii cieczowej

• W przypadku związków, które nie posiadają naturalnej zdolności do fluorescencji, można przeprowadzić związki nie fluoryzujące w ich fluoryzujące pochodne

Identyfikacja rozdzielonych związków

• Każdy z rozdzielanych związków ma swój stały czas retencji

Przy zastosowaniu takich samych warunków rozdziału (kolumna, jej wypełnienie, temperatura, rodzaj i szybkość przepływu fazy ruchomej)

• Na tej podstawie można przeprowadzić

• Analizę jakościową

• Analizę ilościową

---