WYKORZYSTANIE FLPC I HPLC DO SEPARACJI, OCZYSZCZANIA I CHARAKTERYSTYKI BIAŁEK.

1. Apiraza ziemniaczana - białko o aktywności katalitycznej.

Dostarczanie energii w procesach metabolicznych nie jest jedyną biologiczną rolą ATP. Związek tek pełni także rolę w przekazywaniu informacji, jest koenzymem. Produkty hydrolizy ATP (ADP, AMP i adenozyna), a także inne nukleotydy są cząsteczkami sygnałowymi. Substancje te regulują różne, często przeciwstawne procesy. Stężenie zewnątrzkomórkowych nukleotydów kontrolują E-NTPDazy (Ecto-Nucleoside Triphosphate Diphosphohydrolases), zwane także apirazami. Enzymy te występują u zwierząt i roślin, a także u drożdży i pierwotniaków.

NTPDazy są enzymami zaliczanymi i do klasy hydrolaz popodklasy difosfohydrolaz ATP (EC 3.6.1.5). Enzymy te charakteryzują się niską specyficzności substratową i hydrolizują di- i trifosfonukleotydy zgodnie z schematem:

XTP lub XDP + 2H₂O = XMP + 2 (H₂PO₄^-)

ENTPDazy różnią się znacznie stosunkiem szybkości hydrolizy ATP do ADP (K_sh). Stała K_sh jest najważniejszym kryterium podziału NTPDaz. Apiraza ziemniaczana hydrolizuje ATP i ADP z jednakową szybkością.

Funkcje apiraz roślinnych są stosunkowo słabo poznane. Glikozylotransferazy, i inne enzymy biorące udział w syntezie skrobi są regulowane przez poziom ATP, ADP i P_i. Dlatego uważa się, że apiraza ziemniaka reguluje etapy biosyntezy skrobi. Niektóre apirazy roślinne mogą też pełnić rolę w symbiozie bakterii brodawkowych z korzeniami roślin wyższych. Wykazano również niezbędność apiraz w kiełkowaniu ziaren pyłku.

E-NTPDazy są potencjalnymi środkami antyagregacyjnymi. NTPDazy hydrolizują ATP i ADP - cząsteczkę odpowiedzialną za inicjację i agregację płytek krwi. Obecnie prowadzone są badania nad możliwością farmakologicznego zastosowania apiraz w leczeniu chorób serca i mózgu (np. zawał, udar), lub mózgu oraz po interwencjach naczyniowych, np. angioplastyce.

Oznaczanie aktywności ENTPDazy- apirazy ziemniaka

Przed rozdziałem chromatograficznym białka (patrz pkt 2) preparat dializujemy do buforu startowego. Oznaczamy zawartość białka i aktywność enzymu. Mierzymy objętość preparatu i obliczamy aktywność całkowitą i właściwą badanego enzymu.

1. Odczynniki:

A 200 mM Hepes-OH pH 7,6

B 32 mM EDTA

C 12 mM CaCl₂

D 8 mM ATP

E 8 mM ADP

F 50 mM Hepes-OH pH 7,6 (stosujemy do rozcieńczania enzymu)

G SDS - EDTA

H Molibdenian amonowy

G Odczynnk redukujący

2. Przygotowanie mieszanin inkubacyjnych

Do oznaczenia aktywności enzymatycznej NTPDazy należy sporządzić następujące roztwory mieszając:

a) 1 cz. 200 mM Hepes-OH pH 7,6 + 1 cz. H₂O + 1 cz. 12 mM CaCl_2/ 24mM MgCl₂ + 8 mM ATP

b) 1 cz. 200 mM Hepes-OH pH 7,6 + 1 cz. H₂O + 1 cz. 32 mM EDTA + 8 mM ATP

c) 1 cz. 200 mM Hepes-OH pH 7,6 + 1 cz. H₂O + 1 cz. 12 mM CaCl₂ / 24mM MgCl₂ + 8 mM ADP

d) 1 cz. 200 mM Hepes-OH pH 7,6 + 1 cz. H₂O + 1 cz. 32 mM EDTA + 8 mM ADP

3. Wykonanie

Przygotowujemy 16 - po 4 próbówki dla każdej mieszaniny (3 powtórzenia i 1 próbę zerową). Do probówek dodajemy 0,1 ml odpowiedniej mieszaniny inkubacyjnej i wstawiamy na 10 min. do łaźni wodnej o temp.37 ^oC. Reakcję inicjujemy dodając do przygotowanych mieszanin 0,1 ml odpowiednio rozcieńczonego enzymu. Próby zerowe inkubujemy bez enzymu, który dodajemy dopiero po mieszaninie hamującej. Wszystkie próby inkubujemy 30 lub 60 min. w temperaturze 37^oC. Reakcję przerywamy dodając do wszystkich probówek 0,2 ml mieszaniny hamującej o następującym składzie: SDS- EDTA + molibdenian amonowy (1 : 1V/V). Próbówki wyjmujemy z łaźni i do prób zerowych dodajemy 0,1 ml enzymu. Następnie do wszystkich prób dodawać 0,5 ml przesączonego (!) odczynnika redukującego i po dokładnym wymieszaniu wstawić do termostatu (37⁰C) na 5 min. Absorbancję mierzymy względem prób zerowych przy λ = 700 nm. Wyznaczony dla metody Komoszyński /Skalska oznaczania ilościowego fosforanów wpółczynnik kalibr.=1,062.

2. Średniociśnieniowa chromatografia jonowymienna apirazy z ziemniaka (Solanum tuberosum) na kolumnie MonoQ HR5/5.

Nowoczesne metody syntezy nośników do wysokosprawnej chromatografii cieczowej pozwalają na przygotowanie kolumn, w których dużą szybkość i precyzje rozdziału uzyskuje się dzięki odpowiedniemu kształtowi i wielkości cząsteczek nośnika. Wypełnieniem stosowanej w tej chromatografii kolumn HR5/5 są zbudowane z hydrofobowego polimeru, 3μm idealnie sferyczne cząsteczki ze związanymi z ich powierzchnią kationowymi grupami czynnymi (aminy czwarto-rzędowe).Dzięki takiej strukturze nośnika w bardzo krótkim czasie ustala się równowaga między stężeniem jonów w solwencie ,a stopniem jonizacji grup czynnych jonitu. W wyniku tego procesu związane z kolumną frakcje wymywają się w bardzo zwartych szczytach. Pozwala to na separację białek o zbliżonych punktach izoelektrycznych. Separacja białek będzie wynikiem ich różnego powinowactwa jonowego do nośnika- anionitu.

Przygotowanie chromatografii

Materiał: 10-50mg roztworu białka pozbawionego zanieczyszczeń stałych.

Roztwór białka przed chromatografią należy wirować 20min przy 100tys.x g lub

przesączyć przez 0,4 μm sączek.

Odczynniki: a/ 20mM bufor startowy Tris/Cl pH 8,5

b/ 1M roztwór NaCl w buforze startowym

c/ 2M NaCl

d/ 2M NaOH

e/ 75% kwas octowy

f/ odczynnik Bradford

g/roztwory substratu do oznaczeń aktywności enzymów-skład mieszanin i sposób ich przygotowania przedstawiono w załączonej notatce.

Aparatura: 1. Kolumna Mono Q HR5/5 - V₀=8ml

2. Zestaw HPLC pompa LKB 2248 z tytanowymi tłokami ,mieszacz gradientu, kontroler, zawór, detektor, integrator.

3. Kolektor frakcji.

4. Szkło

5. Sączki i sonifikator

UWAGA: Elementy takie jak przewody, kuweta przepływowa w detektorze oraz zawór powinny być wykonane z materiałów biokompatybilnych. Ich stosowanie zwiększa odzysk i wydajność chromatografii.

Wykonanie:

Przygotwanie kolumny: Kolumnę Mono Q V₀=8ml łączymy z zaworem i przemywamy

z szybkością 1ml/min kolejno:

a/ H₂O - 10ml

b/ 0,5ml 2M NaCl

c/ 10 ml H₂O

d/ 0,5ml 2M NaOH

e/ 10 ml H₂O

f/ 0,5 ml 75% kwasu octowego

g/ 10ml buforu startowego

Uwaga: Wszystkie roztwory ,które używamy do rozdziału białek i aktywacji kolumny należy

sonifikować (2min) i przesączyć przez filtr 0,4μm w celu pozbawienia zanieczyszczeń

i rozpuszczonych w nich gazów.

Przygotowanie gradientu: Uruchamiamy Kontroler, aktywujemy funkcję EDIT i układamy

następujący program chromatografii:

1/ 0-10min -przemywamy kolumnę buforem startowym

2/ 11-25min - przemywamy kolumnę rosnącym liniowo gradientem NaCl-0-1M

3/ 26-30min - przemywamy kolumnę -1M NaCl

4/ 31-32min- przemywamy kolumnę buforem startowym- 0M NaCl

Dane o przygotowanym gradiencie wprowadzamy do odpowiedniego pliku kontrolera. Po ułożeniu gradientu programujemy kolektor frakcji. Objętość zbieranych frakcji powinna być w zakresie 0,5ml-1ml,a szybkość przepływu buforu przez kolumnę nie większa niż 1ml/min.

Przygotowanie aparatury: Zrównoważoną buforem kolumnę HR5/5 łączymy z zaworem (wejście)i detektorem (wyjście).Włączamy detektor, ustawiamy długość fali λ=280nm i aktywując program CHROMA przygotowujemy komputer do integracji uzyskanych wyników. Przed pomiarem ustawiamy linię zerową detektora.

Przeprowadzenie chromatografii

Przed rozpoczęciem chromatografii przygotowujemy dwie erlenmajerki z:

1/ bufor startowy

2/ bufor startowy +1M NaCl

oraz 35 probówek z 0,2ml zimnego glicerolu.

W erlenmajerkach umieszczamy zakończenia przewodów prowadzących do mieszacza gradientu. Probówki wstawiamy do statywu kolektora frakcji. Sprawdzamy linię zerową detektora. Uruchamiamy zestaw HPLC, aktywujemy ułożony gradient przyciskiem GRADIENTi wybieramy odpowiedni plik. Na kolumnę nakładamy od 0,1ml-0,5ml preparatu bez zanieczyszczeń i zmętnień. Rozpoczynamy chromatografię przyciskając przycisk RUN. Po zrealizowaniu przez KONTROLER gradientu wyjmujemy z kolektora probówki i oznaczamy w każdej z nich aktywność enzymu

Aktywne apirazowo frakcje zagęszczamy i w uzyskanym preparacie raz jeszcze oznaczamy aktywność i białko.

Uzyskane wyniki przedstawiamy w postaci chromatogramu i tabeli z obliczeniami aktywności właściwej.

3. HPLC-wysokosprawna chromatografia cieczowa jako metoda określania aktywności enzymatycznej.

Poznanie mechanizmu działania apiraz i jej precyzyjna klasyfikacja wymaga identyfikacji produktów reakcji. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest jedną z podstawowych metod identyfikacji oraz analizy ilościowej nukleotydowych i nukleozydowych produktów tych reakcji.

Co stanowi podstawę technik HPLC?

HPLC jest metodą analityczną (a także preparatywną), gdzie o szybkości chromatografii decyduje wysokie ciśnienie. Precyzja rozdziału substancji jest wynikiem niewielkich wymiarów i jednorodności cząsteczek nośnika jego ogromnej powierzchni aktywnej w stosunku do objętości fazy stałej (faza stała - cząsteczki nośnika wypełniające kolumnę, faza ruchoma - rozpuszczalnik lub eluent). HPLC pozwala na stosowanie wielu technik chromatograficznych t. j.

1. chromatografia jonowymienna

2. sączenie molekularne,

3. chromatografia adsorpcyjna a/ w fazie normalnej N-HPLC; b/ w fazie odwróconej
   RP-HPLC

Podstawą powyższego podziału jest rodzaj i właściwości fizykochemiczne wypełniającej kolumnę fazy stałej.

Techniką powszechnie stosowaną do rozdziału nukleotydów jest chromatografia w
odwróconej fazie (RP HPLC). Nośniki (faza stacjonarna) stosowane jako wypełnienie
kolumn w tej technice są niepolarne mają bowiem łańcuchy alkilowe (8 do 18 węglowe)
chemicznie związane z matrycą podczas gdy fazy ruchome są polarne . Praktycznie oznacza
to, że faza stacjonarna jest pasywnym składnikiem a rozdział substancji zależy od
powinowactwa rozdzielanych związków do fazy ruchomej (1).

Szczególna odmianą tej techniki jest rozdział z stosowaniem par jonowych (PIC). Ten rodzaj chromatografii stosuje się do rozdziału związków jonowych lub związków ulegających jonizacji. Pary jonowe tworzą się w wyniku asocjacji cząsteczek tych związków z odpowiednio dużymi organicznymi przeciwjonami. Pary te ulegają adsorpcji na fazie stałej a następnie w sposób selektywny przechodzą do fazy woda/rozpuszczalnik. Chromatografia PIC umożliwia jednoczesny rozdział kwasów zasad i związków obojętnych oraz zwiększa powtarzalność wyników i przedłuża czas życia kolumny.

ĆWICZENIE 1. Identyfikacja i przygotowanie krzywej kalibracyjnej dla ilościowego oznaczenia nukleotydów.

Odczynniki:

1. Faza ruchoma - 75 mM KH₂PO₄/K₂HPO₄ pH 6.0+ 50mM KCl + 10mM cztero-N-
   butyloaminy wodorosiarczan (TBA)+ 2% metanol.

2. Woda dejonizowana

3. 50% metanol

APARATURA

Kolumna chromatograficzna:

Discovery - 5um z prekolumną Discovery.

Zestaw HPLC firmy Waters:

• Sonifikator: In-Line Degasser AF,

• Pompa z modułem kontrolującym :Waters 515 HPLC Pump, Waters Pump Control Module,

• Detektor:Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector

• Autosampler: Waters 717 Plus Autosampler

• Przetwornik danych: komputer z programem Millenium (Waters)

1. Redestylowaną wodę, 50% metanol oraz przygotowaną fazę ruchomą sączymy przez sączek Millipore 0.5um. Montujemy kolumnę i sprawdzamy szczelność połączeń.

2. Uruchamiamy sonifikator i pompę

3. Kolumnę przemywamy 10 objętościami roztworów w następującej kolejności: H2O => 50% metanol => rozpuszszczalnik. W czasie przemywania kolumny i układu HPLC płuczemy igłę autosamplera.

4. Włączamy detektor UV

5. Włączamy komputer, uruchamiamy program Millenium- wprowadzamy w program parametry rozdziału

Wykonanie analizy

Chromatografię przeprowadzimy systemem izokratycznym używając do rozdziału wszystkich składników mieszaniny eluentu o takim samym składzie. Na zrównoważoną fazą ruchomą kolumnę nanosimy kolejno 5ul badanych substancji i przemywamy ją z szybkością lub 1.0 ml/min. Rozdział prowadzimy do momentu kiedy absorbancja po ukazaniu się rozdzielanych substancji w wypływie osiągnie wartość 0.

Identyfikacja nukleotydów

Na kolumnę chromatograficzną nanosimy kolejno

1. 5ul 2mM ATP/ADP/AMP

2-4. po 5ul 2mM ATP, ADP lub AMP

5. Wyznaczamy czas retencji dla każdego z rozdzielanych nukleotydów.

Przygotowanie krzywej kalibracyjnej

1. 2mM AMP rozcieńczając H₂O tak aby uzyskać roztwory o następującym stężeniach:
   5, 10, 20, 40 nmola/5ul

2. Przygotowane roztwory rozdzielamy na kolumnie.

3. Integrując dane każdego programie Millenium określamy dla każdego stężenia nukleotydów powierzchnię i wysokość piku. Uzyskane wyniki drukujemy.

Zadania:

1. Dla każdego z nukleotydów ustalamy czasy retencji.

2. Sporządzamy krzywą kalibracyjną

3. Wyliczamy współczynnik kalibracji Wk

Analiza produktów reakcji i aktywności enzymatycznej apirazy ziemniaczanej.

Odczynniki:

1. Mieszaniny inkubacyjne o składzie:

A\ 60mM HEPES-OH pH 7.0 +3mM CaCl₂+ 1mM ATP

B\ 60mM HEPES-OH pH 7.0 +3mM CaCl₂+ 1mM ADP

C\ 60mM HEPES-OH pH 7.0 +6mM MgCl₂+ 1mM ATP

D\ 60mM HEPES-OH pH 7.0 +6mM MgCl₂+ 1mM ADP

2. 1M HClO₄

3. 1M KOH

Wykonanie analizy:

• Pipetujemy po 50l odpowiedniej mieszaniny inkubacyjnej do probówek eppendorfa (dla każdej mieszaniny inkubacyjnej po 2 probówki do reakcji enzymatycznej, 2 probówki do prób kontrolnych

• Probówki eppendorfa z mieszaninami inkubacyjnymi umieszczamy w łaźni wodnej na 5 min (preinkubacja)

• Startujemy reakcję dodając do mieszanin inkubacyjnych 50l enzymu w 30sek odstępach czasu. Po dodaniu enzymu próby mieszamy.

UWAGA! Enzymu nie dodajemy do prób zerowych

• Po 15 min inkubacji z enzymem reakcję hamujemy dodając 100l 1MHClO_4.

Do prób zerowych dodajemy najpierw HClO₄, później enzym.

• Próby wstawiamy do lodówki na ok. 3min, następnie odwirowujemy strącony osad białka w mikrowirówce (3min). 100l supernatantu starannie przepipetowujemy do czystych probówek.

• Supernatant zobojętniamy dodając 50l 1M KOH, mieszamy.

• Dodajemy 25l n-heptanu w celu odlipidowania próby- wytrząsamy 1 min na mikrowytrząsarce.

• Wirujemy w mikrowirówce (3min)

• 30 l tak przygotowanej próby pipetujemy starannie (tak by nie pobrać osadu!!!) do fiolek do HPLC.

• Próbę nanosimy na kolumnę jak wyżej.

Zadania:

Identyfikujemy produkty nukleotydowe powstałe z enzymatycznej degradacji ATP.

Stosując do obliczeń Wk wyliczamy ilość powstających w określonym czasie reakcji
nukleotydów i sporządzamy wykres.

Na podstawie uzyskanych wyników identyfikujemy enzymy uczestniczące w degradacji nukleotydów.

TABELA. Wyniki oczyszczania preparatu z użyciem kolumny MonoQ.

Próba	Objętość próby (ml)	Białko Całkowite (mg)	Aktywność Całkowita [μmolePi/min]	Aktywność Właściwa [μmolePi/minx mg białka]	Oczyszczenie (x)	Wydajność (%)
Przed chromatografią
Po chromatografii

Po omówieniu prezentowanych w tabeli i rysunkach wyników przedstawiamy wnioski.

---