1. Komórki macierzyste - typy i rozwój:

Komórki macierzyste to inaczej komórki pnia. Komórki które wykazują jednocześnie dwie charakterystyczne cechy:

• Zdolność do potencjalnie nieograniczonej liczby podziałów,

• Możliwość różnicowania się do innych typów komórek.

Dzięki tym dwóm cechom komórki macierzyste zdolne są, w warunkach in vivo, do rekonstrukcji określonej tkanki - nawet w sytuacji, gdy stan końcowego zróżnicowania tkanki uniemożliwia dalszy podział jej komórek.

Wyróżniamy cztery główne rodzaje komórek macierzystych: zarodkowe (pobrane z ludzkich zarodków), płodowe (z płodów poaborcyjnych), pępowinowe (z krwi pępowinowej) oraz dojrzałe (pobrane z dojrzałej tkanki).

Rozwój komórek macierzystych zachodzi po ich ekspozycji na działanie morfogenu (substancji, która wpływa na przyszły los komórki oraz wywiera na nią różny skutek w zależności od swego stężenia). Dopiero wówczas można określi, w którą z czterech podstawowych typów tkanek przemienią się komórki macierzyste - w nabłonkową, nerwową, łączną czy mięśniową.

2. Fibroblast:

Jest to rodzaj komórki macierzystej występującej u zwierząt, pochodzącej z mezodermy, wydzielającej włókna i macierz tkanki łącznej (ECM - patrz punkt 5, 6). Posiada zwykle rozgałęzioną cytoplazmę oplatającą eliptyczne jądro komórkowe. Aktywne fibroblasty mogą być rozpoznawane dzięki obecności szorstkiego retikulum endoplazmatycznego. Nieaktywne fibroblasty, zwane fibrocytami, są mniejsze i wrzecionowate, ze zredukowanym retikulum.

Fibroblasty maja zastosowanie w produkcji takich związków jak kolagen, elastyna, glikozaminy, glikoproteiny oraz w procesie otrzymywania ECM.

3. Komórki mięśniowe:

Są to komórki tworzące zespoły, tzw. miocyty - posiadające zdolność do aktywnego kurczenia się, które są z kolei głównym składnikiem tkanki mięśniowej. Wyróżniamy trzy rodzaje tkanki mięśniowej:

• Gładka - działająca niezależnie od woli i świadomości człowieka, mająca zdolność do ciągłego lecz bardzo powolnego kurczenia się.

• Poprzecznie prążkowana szkieletowa - zbudowana z wielojądrzastych komórek nazywanych włóknami mięśniowymi, mających charakter syncytium. Tkanka ta posiada niezwykle dużą liczbę mitochondriów i charakterystyczne prążki wywołane obecnością miofilamentów aktynowo-miozynowych (biorących udział w zależnym od naszej woli skurczu włókien mięśniowych).

• Poprzecznie prążkowana serca - będąca swego rodzaju połączeniem dwóch poprzednich rodzajów. Budową przypomina mięsień poprzecznie prążkowany lecz niewielkie różnice w budowie komórek pozwalają na prowadzenie ciągłej aktywności (ciągłej pracy mięśnia). Mięśnie te działają niezależnie od naszej woli.

4. Zamrażanie komórek:

...

5. Liza komórek, powody uzyskiwania lizatów:

Liza jest to proces rozpadu komórek; lizat natomiast produkt lizy komórkowej. Do lizy komórki może doprowadzić działanie takich czynników jak detergenty, enzymy lityczne czy wirusy.

Po otrzymaniu lizat należy ultrawirować, co spowoduje jego rozdział na frakcje - w zależności od ciężaru poszczególnych substancji składowych komórki. Na dnie probówki znajdą się białka, następnie kwasy nukleinowe i kolejno sacharydy. Fragmenty lipidowe znajdą się w górnej części odwirowanego lizatu.

6. Badania z wykorzystaniem lizatów, elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z detergentem (SDS PAGE):

Badania te wykorzystują zjawisko przemieszczania się cząstek obdarzonych ładunkiem w polu elektrycznym, w którym nośnikiem jest żel (agaroza, poliakrylamid). SDS (dodecylosiarczan VI sodu) jest detergentem anionowym, który powoduje denaturację i przekształcenie białka w anion, w efekcie wszystkie białka mają liniowy kształt oraz ładunek ujemny, a szybkość ich migracji w żelu zależy wyłącznie od ich wielkości (im większy jon tym wolniej porusza się w polu elektrycznym). Białka są bezbarwne, dlatego stosuje się barwienie błękitem kumasyny lub związkami srebra.

Cztery typy komórek macierzystych

• Zarodkowe - Pobrane z ludzkich zarodków

• Płodowe- Pobrane z tkanek po aborcji

• Pępowinowe - Pobrane z krwi pępowinowej

• Dojrzałe (dojrzałego organizmu) - Pobrane z dojrzałej tkanki

Cechy kom. macierzystych

• Zdolne do samoodnawiania

• Zdolne do wieloliniowego różnicowania

• In vivo, zdolne do funkcjonalnej rekonstytucji (odtworzenia) określonej tkanki

• W tkankach wykorzystujących kom. macierzyste, jeśli kom. tracą zdolność do regeneracji i wytwarzania potomnej puli kom. macierzystych, tkanka ulegnie degeneracji.

Komórki macierzyste

• Organizm używa kom. macierzystych gdy stan końcowego zróżnicowania ( nie umożliwia) jest niezgodny z podziałem komórek

• Kom. macierzyste są wykorzystywane tam gdzie (wymiana, obrót) turnover zachodzi szybko

• Wyściółka jelita, ust, przełyku

• Warstwa naskórka

• Tkanki krwiotwórcze

Rozwój kom. macierzystych

• Rozwój kom. macierzystych rozpoczyna się po ekspozycji na morfogen:

• Substancji mającej wpływ na przebieg formowania

• Gdy rozpoczną się zmiany, można określić w którą z 4 podstawowych typów tkanki się przekształcą.

• Nabłonkową, nerwową, mięśniową, czy łączną

Potencjał kom. macierzystych

• Unipotentne

• Dają początek jednemu typowi komórek

• Gonocyty

• Plemniki i oocyty

• Oligopotentne

• Dają początek kilku typom komórek

• Komórki epidermalne

• Multipotentne

• Dają początek wielu typom komórek

• Kom. macierzyste jelit

• Pluripotentne

• Dają początek większości komórek ciała

• Komórki mesenchymal Totipotentne

• Mogą wytwarzać wszystkie typy komórek ciała

• Wykorzystanie ograniczone do zapłodnionego jaja i blastomerów wczesnego zarodka

Dojrzałe komórki macierzyste

• Hematopoetyczne kom. pnia (HSC)

• Krew i szpik kostny

• Kom. macierzyste tkanki łącznej

• Tłuszcz, kości, chrząstka--fibroblasty

• Niektóre epitelialne kom. macierzyste

• Skóra, receptory czuciowe

• Neuronalne kom. pnia (NSC)

• Mięśniowe kom. pnia (MSC)

Część 2

Fibroblasty są komórkami macierzystymi, ich różnicowanie do adipocytów i potencjalne zastosowanie kliniczne

Fibroblasty są unikatowe

• W skład rodziny komórek tkanki łącznej wchodzą:

• Fibroblasty

• Komórki chrząstki (chondrocyty)

• Komórki kościotwórcze (osteocyty)

• Komórki tłuszczowe (adipocyty)

• Komórki mięśni gładkich

• Fibroblasty są zdolne do transformacji w każde z wymienionych komórek, czasem nawet odwracalnie

• Transformacje są regulowane przez skład ECM, kształt komórki, hormony iczynniki wzrostu

Fibroblasty

• Funkcja:

• Niewątpliwie, najpowszechniejsze komórki

• Komórki aktywne

• Tworzą kolagen, kolagenazy, elastynę i inne włókna

• produkują substancje podstawy (ECM)

• Wygląd (in vivo):

• Kształt wrzecionowaty.

• Cytoplazma jest niebieskawa w typowym barwieniu histologicznym

• Jądro zawiera wyraźne jąderko

Białe adipocyty

• Wygląd:

• triglicerydy zgromadzone w cytoplazmie

• nie połączone pęcherzyki

• jądra przesunięte na bok.

• Funkcja:

• Pobieranie, synteza, przechowywanie mobilizacja neutralnych lipidów

• używane jako źródło energii dla komórek, amortyzacja, izolacja

• Lokalizacja:

• pod skórą

• wokół nerek

• w kościach (dorośli)

Tkanka tłuszczowa dorosłych jest źródłem komórek macierzystych

• Białe adipocyty pobrane z ciała

• Hodowane w obecności czynników odróżnicowujących (szczególnie niska zawartość surowicy)

• rewersja komórek do fibroblastów

• Komórkom podaje się różne czynniki dla stymulacji wytwarzania innych typów komórek

• Nowe komórki zastępują uszkodzone obszary in vivo

• Ciągle daleko do powszechnego stosowania.

Tłuszcz wykorzystany do naprawy czaszki

• Grudzień 2004 w Niemczech u 7 letniej dziewczynki

• Niewielki fragment kości można pobrać z grzebienia biodrowego

• Uzyskane z tłuszczu komórki macierzyste mogą odgrywać rolę w przyspieszaniu procesów regeneracyjnych

• Niepotwierdzone w podwójnie ślepej próbie dowody potencjalnego zastosowania

Różnicowanie

• Różnicowanie jest procesem preprogramowania komórek macierzystych do przekształcenia się w komórki specyficzne.

• Zarodkowe i płodowe kom. macierz. mają możliwość przekształcenia się w większą liczbę różnych komórek niż dojrzałe kom. macierzyste. Niewiele wiadomo o czynnikach koniecznych do przekształcania ES i FS w nowe kom.

• Problemy etyczne

• Zróżnicowane kom. Są wstrzykiwane do obszaru ciała gdzie powinna zajść regeneracja tkanki.

• Gdy dojdzie do kontaktu kom. macierzystych substancjami wzrostowymi organizmu, te substancje programują kom. macierzyste do wzrostu identycznego z otaczającą tkanką.

Różnicowanie komórek w hodowli

Jak zachodzi różnicowanie hodowanych komórek

• Spontanicznie

• Tak jak w komórkach badanej linii E63s

• Interakcje komórka-komórka

• Dodanie chemicznego induktora różnicowania

• Tak jak dla układu fibroblast/adipocyt

• Wspólne induktory dla dla wielu typów komórek:

• Kwas retinowy

• DMSO

• DEX

• Usunięcie czynników wymaganych do pluripotencji

• Wymiana DNA

Indukcja różnicowania w 3T3s

• Dexametazon-

• glukokortykoid (hormon stresowy)

• powszechny induktor różnicowania

• Izobutylometyloksantyna-

• z rodziny kofein

• powoduje przejście zapasów glikogenu w Glc

• podnosi poziom cAMP

• Insulina-produkowana przez wysepki komórek Langerhansa w trzustce w odpowiedzi wzrost poziomu glukozy

• Pula glukozy i triglicerydów

• Z medium wzbogaconego surowicą

Interpretacja poprzedniego schematu

• Deksametazon i IBMX pobudzają komórki do pobierania triglicerydów z surowicy.

• Używane wyłącznie do indukcji

• Insulina zapobiega uwalnianiu triglicerydów z komórek.

• Kontynuacja różnicowania

Tłuszcz, cukier i kofeina

Barwienie wtrątów lipidowych przy użyciu Oil Red O

Część 3

E63 - linia komórek mięśniowych

Barwienie wtrątów lipidowych przy użyciu Oil Red O

Część 3

E63 - linia komórek mięśniowych

Przegląd typów kom. mięśniowych

Morfologia mięśni szkieletowych

Rozwój mięśni szkieletowych

• Mioblasty

• jedno jądro w każdym

• brak miofibryli

• Myotubes (rurki mięśniowe)

• powstanie miofibryli

• inne organelle

E63s

• Linia kom. Wytworzona na Uniwesytecie Illinois z komórek szczurzych

• Rośnie lepiej na surowicy końskiej niż na noworodkowej surowicy cielęcej

• Należy stosować odpowiednie media!

• Używać Kanamycyny zamiast mieszanki Penicylina/Streptomycyna

• Wzrost przy 8-10% CO₂

Zamrażanie hodowanych komórek

Powody zamrażania hodowli macierzystych (stock)

• Zabezpieczenie cennych zasobów

• Linie kom. W ciągłej hodowli są podatne na zmienność

• Ustalone linie komórkowe mogą się zestarzeć

• Linie kom w ciągłej hod. Mogą być niestabilne genetycznie

• Zanieczyszczenie mikroorganizmami

• Zanieczyszczenie inymi liniami kom.

• Uszkodzenie inkubatora

• Oszczędność czasu i materiałów przy utrzymywaniu linii nie potrzebnych do bieżących prac

• Potrzeba przekazania innym eksperymentatorom

Przechowywanie i tempo zamrażania

• Ciekły azot jest najlepszą metodą zabezpieczania linii hodowlanych (kultur)

• Najmniejszy spadek jakości hodowli zachodzi w -196^oC

• Znaczne spadki mogą wystąpić w -80^oC

• Utrata 5-10% komórek na rok

• Wolne zamrażanie, najlepiej przy 1^oC/min. W styropianowym pojemniku owiniętym bibułą

• -20^oC, 1 dzień

• -80^oC, 1 dzień

• Przeniesienie do ciekłego azotu w czasie poniżej 2 min.

Inne ważne czynniki

• Zamrażanie przy wyższym stężeniu surowicy

• 20% rather than 10%

• Zamrażanie przy dużej gęstości kom.

• 1 x 10⁶ lub wyższej (do 1 x 10⁷)

• Zamrażanie w obecności związków chroniących

• Glicerol (hodowle bakteryjne)

• Dimethyl sulfoxide DMSO (większość linii kom.)

• Zwykle 10%

• Może przenikać przez wiele syntetycznych i nturalnych błon, ze skórą włącznie

• Każda szkodliwa substancja może być przeniesiona w obecnośći DMSO przez skórę do krwiobiegu

• Zachowaj ostrożność pracując z toksynami i DMSO

Protokół

• Sprawdzenie hodowli (kontrola)

• Zdrowy wzrost

• Wolne od zanieczyszczeń

• Komórki powinny być w fazie log

• Trypsynizuj, zawieś i policz komórki

• Wiruj zawiesinę i zawieś kom. w medium do zamrażania przy 1 x 10⁶-1 x 10⁷ komórek/ml

• Umieść w opisanych ampułkach

• Data, stężenie kom. linia (3T3-L1) i inicjały operatora

Wirowanie

• Zwiększenie gęstości kom.

• Odmycie reagentów

• Kom. Sedymentują przy 80-100g

• Wyższe ciążenie może wywołać uszkodzenia lub spowodować aglutynację

• Należy zrównoważyć probówki!

• Użycie parzystej liczby kom. naprzeciw siebie

• Przy liczbie nieparzystej próbka z wodą dla równowagi

Zawieszanie (sposoby)

• Po odwirowaniu otrzymujemy, niewielki osad (pelet) na dnie probówki

• Usuń płyn z probówki - pipetor (Nie aspirator próżniowy) bez uszkodzenia osadu

• Dodaj 1-2ml medium do zamrażania do probówki i zawieś osad.

• Dodaj pozostałą objętość medium do zawiesiny w probówce

Część 2

Lizowanie hodowanych komórek

Powody uzyskiwania lizatu

• Uwalnianie DNA, RNA lub białek z komórki

• Użyteczne dla badania biologicznych właściwości makrocząsteczek

• Poszukiwanie białek produkowanych przez zróżnicowane komórki i nieprodukowanych przez niezróżnicowane.

Jak uzyskać lizat

• Mechaniczne zniszczenie błon plazmatycznych i uwolnienie białek

• Błony zewnętrzne i błony organelli

• Zniszczenie błon przez zdrapanie kom. I sonikację zawiesiny

• Zniszczone są również błony lizosomów uwalniając komórkowe “enzymy systemu trawiennego”.

• Może to zniszczyć inne uwolnione białka jeśli nie spowolnimy działania enzymów

Spowolnienie niszczenia białek

• Zasada # 1 : Utrzymuj wszzystko w chółodzie!

• Probówki, zdrapki, PBS, media bez surowicy, płytki—na lodzie!

• Płytki w pojemniku lodowym, a probówki w lodówce

• Niektórzy badacze używają PMSF

• Fluorek fenylometylosulfonylu

• Silny inhibitor proteaz

• Wyjątkowo niebezpieczny!

• Nie jest powszechnie stosowany

Używanie buforu do próbek SDS-PAGE z ME do ułatwienia lizy komórek

• detergent

• niszczy błony

• linearyzuje białka

• Nadaje im ładunek ujemny

• Beta Merkaptoetanol

• Rozbija mostki disiarczkowe w białkach

• Silny, charakterystyczny zapach!

• Bromophenol blue

• Barwnik znacznikowy

• Glicerol

• Zapewnia próbce odpowiedni ciężąr przy nanoszeniu na żel

Zdrapywanie i sonikacja

• Zdrapywanie komórek

• Użycie siły mechanicznej do usunięcia kom. z płytki gdy integralność kom. nie musi być zachowana

• Sonikacja

• rozbija błony kom. Falami dzźwiękowymi o dużej częstotliwości

Zachowanie ostrożności przy sonikacji

• Stosuj przerwy aby nie dopuścić do przegrzania

• Trzymaj próbkę na lodzie

• Zapobiegaj spienieniu się próbki

• odwiruj po sonikacji

• Przemywaj sondę sonikatora etanolem między probkami

• Aby nie zanieczyścić następnej próbki

• Nie dotykaj sondą niczego poza próbką

Próbki przeznaczone do lizy

• Fibroblasty—6cm płytka

• Adipocyty---płytki z dołkami

• E63 3 jednodniowa---6cm płytka - mioblasty

• E63 siedmiodniowa płytka---6cm---myotubes (włókna mięśniowe)

• Szukanie ciężkiego łańcucha miozyny

Przypisanie kolorów taśmy znacznikowej

• Różowa probówka, różówa taśma, F—fibroblast

• Zielona probówka, zielona taśma, A—adipocyty

• Niebieska probówka, niebieska taśma, lizat B---mioblastów (3dniowe)

• Żółta probówka, żółta taśma, lizat T---myotube (7dniowe)

• Kolorowe probówki umożliwiają łatwą identyfikację próbek w lodzie

Dobra technika

• Praca szybka, staranna w chłodzie da dobre rezultaty!!

• Proteazy rozbijają białka na fragmenty nie rozpoznawalne jako kompletne cząsteczki przez przeciwciała w Western blotingu

Przykład “dobrego” żelu gdy lizaty sa przygotowane właściwie

• Nie widać “smears” rozmazanych białek

• Białka występują w pełnym spektrum wielkości

• Są wyraźnie oddzielone prążki (bands)

• Reprezentujące dużą liczbę natywnych białek

• brak wyraźnych prążków świadzcy o złej technice lizy, proteazy strawiły białka

• Najważniejsze: trzymaj wszystko na lodzie!!!

Blot mioblast/myotubes 3/16/04 z MF20 i koza anty-mysz z AP

• Molecular weight standard Group 1, Group 2 Group 3 Group 4

Komórki epitelialne

• CHO-K1

• Chinese hamster ovary (jajnik chińskiego chomika)

• Uzyskanyprzez Pucka w 1957

• MDCK

• Madin Darby canine kidney epithelium (epitelium nerki psa)

• Służy do namnażania wielu różnych zwierzęcych wirusów ISHIKAWA

• Endometrialny rakfrom od 39 letniej kobiety

• Obecne na kom. receptory estrogenu i progesteronu

• Wrażliwy na hormony steroidowe

• HeLa

• Ludzki nabłonek szyjki macicy

• Z raka szyjki macicy 31 letniej murzynki

• Pierwsza linia aneuploidalna uzyskana z ludzkiej tkanki utrzymywana w hodowli komórkowej

Krew

• HL60

• Limfocyty krwi obwodowej uzyskane przez lymfoorezę od 36 letniej kobiety

• 10% ulegnie spontanicznemu różnicowaniu

• Można przyspieszyć używając DMSO, hypoksantynę, TPA, kwas retinowy

• THP1

• Human blood monocyte (monocyty ludzkiej krwi)

• Z krwi obwodowej rocznego chłopca z białaczką monocytarną

• Można róznicować do linii makrofago-podobnej przy użyciu DMSO

• Ku-812

• Z ludzkiej białaczki

• Komórki identyczne morfologicznie z bazofilami

Komórki fibroblastów

• BHK

• Nerka chomika 5 dniowego

• Odpowiednia do badań nad replikacją wirusów

• Polio, wścieklizna, pryszczyca

• NIH 3T3

• Z zarodka szwajcarskiej myszy (NIH)

• Wrażliwy na namnażanie wirusa białaczki

• VERO

• Linia fibroblastów małpiej nerki

• Odpowiednia do replikacji wirusów

• Odpowiednia dla produkcji szczepionek

• COS-1 and COS-7

• Z nerki afrykańskiej zielonej may

• Transformowana mutantem wirusa SV40

• Dobry model do transfekcji

Komórki neuronalne

• PC-12

• zyskane ze szczurzych nafnerczowych phaeochromocytoma

• Odpowiada odwracalnie na czynniki wzrostu nerwów przez indukcję neuronalnych fenotypów

• Syntezują, magazynują catecholaminę, dopaminę i NPP

• Produkując kolagen -zachowyją kształty neuronalne, bez kolagenu tworzą sferyczne sferyczne clustery

• SH-SY5Y

• Trzykrotnie clonowana sub-linia linii uzyskanej przez biopsję szpiku kostnego

• Może przekształcać glutaminian w neuroprzekaźnik GABA

• tracą charakter neuronalny w miarę pasażowania

• Nie używać powyżej 20 pasaży

• Weryfikacja cech takich jak absorbowanie noradrenaliny

Komórki mięśniowe

• C2C12

• Subklonowane z linii mioblastów uzyskanych zmięśni nogi normalnej, dorosłej myszy C3H.

• Szybkie różnicowanie; produkuje Silnie kurczące się myotubes ekspresjonujące charakterystyczne białka mięśniowe.

• Jest modelem do badania in vitro miogenezy i róznicowania komórek.

• L6-G8

• Subklon L6, linii komórkowej z mięśnia udowego szczura.

• Poprzednio, osiągając konfluencję kom. ulegały fuzji tworząc myotubes i można było obserwować ich skurcze.

• Jednakże, komorki te utraciły zdolność ulegania fuzji po uzyskaniu konfluencji.

Źródła linii komórkowych

• ATCC

• American type culture collection

• ECACC/Sigma Aldrich

• European Collection of Cell Culture

Media, niekompletna lista

• MEM

• Minimum Essential Media

• Czasem nazywane Eagle's MEM or Basal Medium Eagle (BME)

• Pierwsze szeroko stosowane medium dla szerokiego spektrum komórek ssaków

• Opracowane przez Harry Eagle (1950s)

• DMEM

• Dulbecco's Modified Eagle Media

• 2x the [amino acids] and 4x the vitamins of MEM

• Często zawiera 4.5mg/D glucose

• Standardowe medium dla komórek ssaków

• Ham's F12 (Mieszanki odżywcze)

• Złożona formuła odpowiednie do hodowli bez sur.

• DMEM i F12 mogą być mieszane do hodowania szerokiego spektrum kom.

• Opracowane do hodowli komórek CHO

Media c.d.

• RPMI i McCoy's

• Opracowane w Roswell Park Memorial Institute w Buffalo New York.

• McCoy's było początkowo stosowane do hodowli kom. hepatoma i podtrzymywania wzrostu hodowli pierwotnych

• RPMI to modyfikowane medium McCoy's

• Długotrwałe hodowle limfocytów z krwi obwodowej

• Zawiesina lub or monolayer

• Odpowiednie dla różnorodnych hodowli w zawiesinach

• L15 Leibovitz

• Można używać w hodowlach bez CO₂ (nakrętki butelek mogą być szczelnie zamknięte!)

• Stosowane w studenckich laboratoriach lub do kolekcjonowania bioptatów

• Standardowy system buforujący wodorowęglan sodu/CO₂ jest zastąpiony przez:

• Bufor fosforanowy (zbalansowany roztwór soli Hanksa)

• Aminokwasy zasadowe

• Wyższ poziom pirogronianu i galaktozy

Media c.d.

• Glasgow minimum essential media (G-MEM)

• Opracowane do hodowli baby hamster kidney cells (BHK-21)

• Neurobasal media

• zaprojektowane specjalnie do hodowli neuronów

• Iscove's modified Dulbecco's media

• Odpowiednie do szybkiego namnażaniagęstych hodowli komórkowych

• Wysoko wzbogacone, syntetyczne medium

• Medium 199

• Popularne w hodowlach fibroblastów

• Originalnie opracowane dla fibroblastów kurzych zarodków

Zrównoważone roztwory soli

• Sole nieorganiczne, może zawierać dwuwęgnan sodu i czaem, glukozę

• Do rozcieńczania koncentratów aminokwasów i witamin

• do izotonicznego przemywania i medium do sekcji

• PBS

• Earle's buffered salts solution (EBSS)

• Wyższe stężenie dwuwęglanu compatible do hodowli w 5% CO₂

• Hank's buffered salts solution (HBSS)

• Dobre do zamkniętych butelek z fazą gazową lub powietrzem

Lista buforów

• Różnią się wartościami pK_a i toksycznością dla komorek

• Dwuwęglan sodu

• Najpowszechniej stos. Większość płynnych media jest z nim przygotowywanych.

• HEPES

• 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid

• Może być toksyczny dla zróżnicowanych typów komórek

• Może zwiększać wrażliwość media na fototoksyczny efekt indukowany promieniowaniem UV

• Bufferall

• Zawiera 3 biologiczne bufory

• Bardzo dobrze chroni przed wahaniami pH

SDS-PAGE lizatów mioblastów, miotubuli, fibroblastów i adipocytów

• Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

• Jest techniką umożliwiającą rozdział białek w oparciu o ich wielkość.

• Preparaty użyte do rozdziału

• Lizaty komórek fibroblastów

• Lizaty komórek adipocytów

• Lizaty komórek of mioblastów

• Lizaty komórek of miotubuli

• Standard białek o znanej wielkości

Sodium Dodecyl Sulfate

• Ujemnie naładowany detergent wiążący się z hydrofobowymi regionami cząsteczek białek

• Powoduje rozfałdowanie cząsteczek

• z form globularnych do wydłużonych/linearnych łańcuchów polipeptydowych

• Poszczególne cząsteczki białka są uwalniane z ich asocjatów z innymi białkami lub cząsteczkami lipidów przez SDS i pozostają rozpuszczone w roztworze detergentu. Wszystkie białka traktowane SDS będą niosły “ujemny” ładunek

Żel poliakrylamidowy Gel

• Żele są uzyskiwane przez polimeryzację akrylamidu i bisakrylamidu (poliakrylamid).

• Małe cząsteczki białek wędrują szybko poprzez sieć poliakrylamidu.

• Długie, linearne białka są zatrzymywane (hamowane) przez żel migrują wolniej

• Nadsiarczan amonu (Ammonium persulfate) inicjuje reakcję.

• TEMED katalizuje polimeryzację.

• Niezpolimeryzowany akrylamid jest silną neurotoksyną.

Elektroforeza

• Proces migracji naładowanych cząsteczek w roztworach w przyłożonym polu elektr.

• Elektroda ujemna na górze, dodatnia na dole żelu

• Białka traktowane SDS mają końcowy ładunek ujemny i będą migrować w kierunku elektrody dodatniej

PAGE jest prowadzona w pionie

Wyjaśnienie wątpliwości związanych z definicją anoda/katoda :

• Katoda: Elektroda na której zachodzi redukcja. To jest ujemna elektroda w baterii do której płynie prąd, ale jest to dodatni biegun baterii.

• Anoda: Elektroda na której zachodzi utlenianie. Jest to elektroda do której wędrują aniony z powodu jej potencjału elektrycznego. W spontanicznych ogniwach anoda jest ujemna. W niespontanicznych lub elektrolitycznych anoda jest przyjmowana za pozytywną.

• Z CRC Handbook of Physics and Chemistry

Żel zagęszczający

• Niski procent akrylamidu (2.5%-4%)

• Większe rozmiary porów

• Nie ogranicza migracji białek

• Różnica składu jonowego pomiędzy buforem żelu zagęszczającego a buforem elektrodowym pozwala białkom wędrować szybko przez tę warstwę i “zagęścić się” ułożyć w jednej warstwie.

Żel rozdzielający

• Wyższy procent (7.5%-20%) akrylamidu

• Rozmiar porów jest mniejszy niż w żelu zagęszczającym

• Szybkość wędrowania białek zalezy od logarytmu ich wielkości (ciężar cząsteczkowy).

• Większe białka mają kłopoty z przeciskaniem się przez żel i ich dystans wędrowania jest mniejszy niż mniejszych białek które wędrują łatwiej i szybciej (dalej).

Dopasowanie rozmiaru porów do rozdzielanych białek

• Różne stężenia akrylamidu służą do rozdziału białek o różnych ciężarach cząst.

• Wyżej procentowy żel będzie lepiej rozdzieał mniejsze białka.

• Gradient (4-20%) będzie rozdzielał wszystkie białka równie dobrze.

• Najbardziej typowe żele (10-20%)

Mobilność cząsteczek

Mobilność cząsteczki =

(zast. napięcie V )(ład. netto cząsteczki)

(tarcie cząsteczki)

LUB

V = Ez

f

V =szybkość (stopień migracji)

E=siła pola elektrycznego

z=ładunek cząsteczki

f=siły tarcia cząsteczki

Inne reagenty

merkaptoetanol

• Redukuje mostki disiarczkowe odpowiedające za pofałdowanie białka lub połączenie podjednostek białka.

• Dodawany do próbki przed elektroforezą w celu linearyzacji białek i rozdzielenia podjednostek

• Ma “brzydki” zapach!!

Glicerol

• Zwiększa gęstość próbki i umożliwia umieszczenie jej na dnie studzienki w żelu podczas nanoszenia pod warstwę buforu

Bromophenol Blue

• Niskocząsteczkowy barwnik dodawany do próbki. Wędruje szybciej niż najmniejsze białko i tworzy front barwnika umożliwiwjąc wizualizację migracji ( rozdzielane białka są zwykle niewidoczne)

Bufor elektrodowy

• Zawiera sole, elektrolity i bufory niezbędne dla zapewnienia odpowiedniego pH i przewodnictwa prądu elektrycznego.

Markery ciężarów cząsteczkowych

• Kombinacja białek o znanych cięż. cząst. (w jednej próbce).

• Używany do tworzenia krzywej stand. dystansów wędrówki białek zależ od cięż. cząst. (na papierze logarytmicznym).

• Można mierzyć dystans wędr. nieznanego białka i odczytać z krzywej standardowej jego ciężar cząsteczkowy w daltonach lub kilodaltonach.

Transfer barwnika/drabinki

• Transfer barwnika

• Barwnik pozostaje z białkami pomagając w wizualizacji transferu białek na nitrocelulozę

• Drabinka

• Większość standardów cząsteczkowych to połączenie naturalnie występujących białek

• Zabarwione różnymi barwnikami związanymi kowalencyjnie

• Dają bardziej rozmyte, rozdyfundowane prążki

• Przygotowane precyzyjnie dla dokładnego określania ciężarów cząsteczkowych w każdym rozdziale w żelu (PAGE)

Krzywa standardowa

• Używając papieru log. lub odpowiedniego programu komp., narysuj punkty odpowiadające dystansowi wędrówki zależnej od MW dla rozdzielonych standardów białkowych Zaznacz dystans wędrówki jednego białka w próbce i określ z krzywej stand. jego przybliżoną masę cząst.

Lizaty mięśni szkieletowych

Mioblasty

• Pojedyncze komórki, prekursory mięśni

• Nie wytwarzają wielu białek widocznych w dojrzałych mięśniach takich jak ciężkie łańcuchy miozyny (MHC) mw: 200kD

Miotubule

• Są tworzone przez fuzję mioblastów do długich komórek mięśniowych z kilkoma jądrami (syncytium)

• Produkują MHC i aktynę

• tworzą mechanizmy kurczliwości

myoD1

• Gen odpowiedzialny za różnicowanie mioblastów do dojrzałych komórek mięśni szkieletowych

Fibroblasty i adipocyty

• Adipocyty i Adipsyna

• Dla zróżnicowania 3T3-L1s adipocytów, należy dodać insulinę, dexametazon i IBMX.

• Zachodzi przejściowy wzrost syntezy DNA 18h po dodaniu IBMX po czym dochodzi do wstrzymania (arrest) w cyklu G1 (chwilowe wstrzymanie wzrostu)

• W tym czasie, kilka genów zostaje włączonych co prowadzi do zróżnicowania.

Adipsyna

• Jednym z włączonych genów jest ten który odpowiada za produkcję adipsyny

• Adipsyna

• Proteaza serynowa

• Niespodziewanie, PMSF jest inhibitorem proteazy serynowej

• Wydzielana przez adipocyty w większości modeli zwierzęcych (u ludzi jest również ekspresjonowana w monocytach/makrofagach)

• Jest jej brak w kilku zwierzęcych modelach otyłości

• Została zidentyfikowana jako białko identyczne z czynnikiem D dopełniacza (complement factor D)

• Jej MW = 22kD

FYI: Kaskada dopełniacza

• Około 20. białek normalnej surowicy

• MW 24kD-550kD

• Odziałuje z Ab wiążącymi Ag

• Różne efekty biologiczne

• Liza obcych komórek

• Inicjacja odpowiedzi zapalnej

• Opsonizacja

• Opłaszczanie powierzchni

• Zwiększenie aktywności fagocytującej makrofagów i neutrofili (białe krwinki)

Co można zrobić z żelem?

Zabarwić go

• Związać (fix) białka w żelu przez zanurzenie w metanolu i kwasie octowym

• Zabarwić żel “Fast Stain.”

• zmodyfikowany Coomasie blue, pozwala skrócić etap odbarwiania

• Odbarwianie w 10% kwasie octowym.

• Fotografia żelu.

• Obliczenie MW białek z krzywej stand.

Western Blot

• Transfer białek na nośnik łatwiejszy w obróbce i “blot” lub“reakcja” ze swoistymi przeciwciałami.

• FYI:

• Northern blot

• DNA

• Southern blot

• RNA

• Zazwyczaj, ścieżki lizatów będą wyglądać po barwieniu jak rozmazane plamy z wyraźniejszymi prążkami, ponieważ rozdzielaniu uległo wiele białek o róznych MW. Barwią się wszystkie białka.

• Prążki mioblastów i miotubi

• Spodziewane uwidocznienie prążka miozyny około 200 kDa w ścieżce miotubuli , brak w ścieżce mioblastów

• Ogólnie jest więcej białek w ścieżce miotubuli.

• Jeśli zobaczymy prążek w okolicy miozyny w ścieżce mioblastów, może być kilka przyczyn:

• Mioblasty zaczęły się różnicować

• Próbka jest zanieczyszczona

Przykład “dobrego” żelu

• Widać “rozmazy” białek

• Białka występują w pełnym spektrum wielkości

• Widać na tym tle wyraźne prążki (distinct bands)

• Duża liczba natywnych białek

• Brak wyraźnych prążków świadzczy o złej technice pracy (proteazy strawiły część białek)

Western Blot

• Preniesienie (transfer) białek z żelu na nitrocelulozową błonę w celu poddania reakcji ze swoistymi białkami

• użycie Ab przeciwko epitopowi swoistemu dla testowanych białek.

• Nitroceluloza jest stosowana ponieważ jest łatwiej pracować z nią iż z żelem

• Nitroceluloza ma duże powiowactwo dla białek, nawet dla tych z palców, a więc zakładaj rękawiczki!!

• Nitroceluloza jest przykładana do i białka zżelu są pzenoszone na nitrocelulozę pod wpływem prądu

• białka, będą wędrować do bieguna dodatniego

• Używa się buforu blotingowego

• różne stężenie, elektrolitów, niż w żelu do rozdziału (bufor elekktrodowy)

• należy pokryć żel nowym buforem

• zawiera metanol, który usuwa SDS z białek, umożliwiając im re-naturację i lepsze rozpoznanie przez Ab

• zapobiega dyfuzji białek

• wzmaga wiązanie białek do błony i ułatwia bloting

• zastosowanie bloku lodowego dla chłodzenia systemu (duży prąd) aby żel nie ulegał roztopieniu

• Jeśli barwnik transferowy nie zotał wykorzystany, należy użyć barwnika Ponceau S.

• Umozliwi wizualizację wzsystkich białek

Media, niepełna lista

• MEM

• Minimum Essential Media

• Czasem nazywany Eagle's MEM lub Basal Medium Eagle (BME)

• Pierwsze szeroko stosowane medium, Dla hodowli wielu kom. ssaków

• Opracowane przez Harry'ego Eagle (1950s)

• DMEM

• Dulbecco's Modified Eagle Media

• 2x [aminokwasy] i 4x the witaminy z MEM

• Najczęściej zawiera 4.5mg/L glukozy

• Standardowe medium for mammalian cells

• Ham's F12 (Nutrient Mixtures)

• łożona formuła odpowiednie dla namnażania bez surowicy

• DMEM i F12 można mieszać dla hodowli różnorodnych komórek

• Odkryty najpierw do hodowli komórek CHO

Więcej Media

• RPMI and McCoy's

• Developed at Roswell Park Memorial Institute in Buffalo New York.

• McCoy's was originally used to grow hepatoma cells and supports growth of primary cultures

• RPMI is modified McCoy's

• Long term culture of peripheral blood lymphocytes

• Suspension or monolayers

• Suitable for a wide variety of suspension cultures

• L15 Leibovitz

• Can be used without CO₂ incubation (caps of flasks can stay tightly closed!)

• Found in teaching laboratories or when collecting biopsy samples

• Standard sodium bicarbonate/CO₂ buffering system is replaced by

• Combo of phosphate buffers (Hank's balanced salt solution)

• Free-base amino acids

• Higher levels of sodium pyruvate and galactose

Even more media

• Glasgow minimum essential media (G-MEM)

• Developed for the culture of baby hamster kidney cells (BHK-21)

• Neurobasal media

• Specially designed to support neurons

• Iscove's modified Dulbecco's media

• Suitable for fast growing, high density cell cultures

• Highly enriched synthetic media

• Medium 199

• Popular for fibroblast cultures

• Originally formulated for chick embryo fibroblasts

Balanced Salt Solutions

• Inorganic salts and may include sodium bicarbonate and sometimes glucose

• Diluent for amino acid concentrates and vitamins

• Isotonic wash or dissection medium

• PBS

• Earle's buffered salts solution (EBSS)

• Higher bicarbonate concentration compatible with growth in 5% CO₂

• Hank's buffered salts solution (HBSS)

• Good for sealed flasks with a gas phase of air

Media Buffers, a short list

• Vary in their pK_a values and toxicity to cells

• Sodium bicarbonate

• Most common and most liquid medias are prepared with this.

• HEPES

• 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid

• Can be toxic for differentiated cell types

• Can increase sensitivity of media to phototoxic effects induced by exposure to fluorescent light

• Bufferall

• Contains 3 biological buffers

• Very good a reducing pH fluctuations

---