IMMUNODIAGNOSTYKA

Wydział Lekarski, rok IV

ĆWICZENIA LABORATORYJNE

dr Mariusz Kaczmarek

POZNAŃ 2010

Ćwiczenie 1

Układ odporności. Odporność humoralna.

METODY JAKOŚCIOWE OCENY REAKCJI ANTYGEN-PRZECIWCIAŁO.

Zagadnienia:

antygeny, hapteny, antygenowość, immunogenność, epitop, powinowactwo, awidność, przeciwciała, monoklonalność, poliklonalność, monowalentność, poliwalentność, precypitacja, krzywa precypitacji, obszar ekwiwalentny, warunki reakcji precypitacji, metody oparte o zjawisko precypitacji, immunoelektroforezy, immunofiksacja, złożone techniki serologiczne, immunoblotting, immunoprecypitacja, aglutynacja, warunki reakcji aglutynacji, metody oparte o zjawisko aglutynacji

1. Metody oparte o zjawisko precypitacji:

• podwójna dyfuzja w agarze (PDA) - metoda Outcherlony'ego, immunodyfuzja.

Do wyciętych w żelu agarozowym studzienek nanosi się badane surowice i roztwory przeciwciał, które dyfundują w nośniku. W miejscu spotkania obu składników badanego układu tworzą się łuki precypitacyjne.

W trakcie ćwiczeń studenci wykonują preparaty PDA i oceniają precypitaty powstałe podczas reakcji kompleksów immunologicznych z odpowiednimi przeciwciałami.

• immunoelektroforeza prosta (IM-EL) - metoda umożliwia ocenę białek zawartych w surowicy, łączy elektroforezę i immunodyfuzję.

W pierwszym etapie mieszaninę białek zawartą w surowicy, umieszczoną w żelu agarozowym rozdziela się przy pomocy prądu elektrycznego. Następnie wycina się w żelu równoległy do kierunku migracji białek rowek, który wypełnia się odpowiednimi przeciwciałami. Dyfundujące w żelu składniki układu (badane białka i przeciwciała) tworzą łuki precypitacyjne o charakterystycznym kształcie i wielkości.

W trakcie ćwiczeń studenci wykonują poszczególne etapy immunoelektroforezy oraz oceniają powstałe precypitaty.

2. Złożone techniki serologiczne:

• immunoblotting

Poszukiwane przeciwciała zawarte w badanych surowicach wykrywane są przy pomocy immobilizowanych w nitrocelulozie białek antygenu. W skład systemu detekcyjnego wchodzi także antyglobulinowy koniugat wyznakowany enzymem (np. peroksydaza chrzanowa lub alkaliczna fosfataza). Dodanie substratu dla odpowiedniego enzymu powoduje powstanie nierozpuszczalnego w wodzie produktu widocznego jako barwny prążek na nitrocelulozie.

W trakcie ćwiczeń studenci wykonują test western-blott przy pomocy, którego oznaczają przeciwciała przeciwjądrowym i przeciw antygenom cytoplazmy przy pomocy testu paskowego ANA profile 3 EUROLINE firmy EUROIMMUN.

Preparatyka:

1. Podwójna dyfuzja w agarze (PDA)

1. Sprzęt i odczynniki:

• wypoziomowany stolik

• odtłuszczone w alkoholu płytki szklane 6 × 9 cm lub szkiełka podstawowe

• metalowa sztanca do PDA

• pipeta szklana 10 - 25 ml

• mikropipeta regulowana 10 - 200 μl

• 1 % agar lub agaroza w soli zbuforowanej pH 7,6 (PBS)

• łaźnia wodna lub kuchenka mikrofalowa

• wilgotna komora

• próbki badanych antygenów i odpowiednie surowice odpornościowe (zwierzęce)

2. Materiał badany:

surowica pacjenta lub inny roztwór białka do analizy (min. ilość 50 μl, opt. ~ 1 ml)

3. Zasada metody:

Podczas 24 h inkubacji w komorze wilgotnej dochodzi do swobodnej dyfuzji białek próbki badanej i zastosowanych do identyfikacji przeciwciał zwierzęcych. W miejscu zetknięcia się obu składników układu dochodzi do powstania kompleksów immunologicznych, a następnie (w strefie ekwiwalencji, tzn. równowagi stężeń Ag-Ab) wytrącenia się precypitatu, który można analizować wizualnie

4. Wykonanie

• gorący agar wylać przy pomocy ogrzanej pipety na płytkę szklaną do uzyskania warstwy grubości ok. 1 mm,

• po zastygnięciu wyciąć studzienki w żelu przy pomocy sztancy,

• napełnić przeciwstawne studzienki roztworami antygenu i odpowiednio dobranych surowic odpornościowych lub seryjnymi rozcieńczeniami tej samej surowicy odpornościowej,

• umieścić płytkę w komorze wilgotnej w temperaturze pokojowej na 24 lub 48 h.

5. Ocena i interpretacja wyników:

PDA jest techniką jakościową; powstanie łuku precypitacyjnego świadczy o obecności poszukiwanego białka w próbce badanej; stosując podwójne rozcieńczenia analizowanej surowicy odpornościowej można określić jej miano (tzn. największe rozcieńczenie , przy którym tworzy się prążek precypitatu).

2. Immunoelektroforeza prosta (IM-EL)

1. Sprzęt i odczynniki:

• wypoziomowany stolik

• odtłuszczone w alkoholu płytki szklane 6 × 9 cm lub szkiełka podstawowe

• metalowa sztanca do IM-EL

• pipeta szklana 10 - 25 ml

• mikropipeta regulowana 10 - 200 μl

• 1 % agaroza w buforze weronalowym 0,01M pH 8,6

• łaźnia wodna lub kuchenka mikrofalowa

• aparat do elektroforezy

• zasilacz

• wilgotna komora

• wzorcowa surowica ludzka

• królicze przeciwciała przeciw ludzkim Ig GAM

2. Materiał badany:

surowica ludzka (min. ilość 50 μl, opt. ~ 1 ml)

3. Zasada metody:

etap I  - elektroforeza: rozdział białek badanej surowicy w polu elektrycznym,

etap II - 24 h inkubacja: białka surowicy badanej i dodane po elektroforezie przeciwciała zwierzęce kontaktują się ze sobą w żelu, tworząc najpierw kompleksy Ag-Ab, a następnie w strefie ekwiwalencji, prążki precypitatu.

4. Wykonanie:

• przygotować bufor weronalowy: weronal 184 g

weronal sodu 10,3 g

rozpuścić w wodzie, doprowadzić pH do 8,6, uzupełnić do 1L objętości.

• gorący agar wylać na płytkę szklaną do uzyskania warstwy ~ 1 mm

• po zastygnięciu wyciąć studzienki w żelu i napełnić je próbkami badanych surowic (nierozcieńczonych); do jednej ze studzienek podać wzorcową surowicę ludzką;

• umieścić płytkę w aparacie do elektroforezy, połączyć żel na płytce z buforem w zbiornikach aparatu przy pomocy „kluczy” z bibuły Whatman 3,

• przeprowadzić elektroforezę w warunkach: 120 V; 0,1 A; 80 min; przewidywana wędrówka immunoglobulin w kierunku elektrody (-)

• po wyłączeniu z prądu płytkę wyjąć z aparatu, wyciąć rowki równoległe do przewidywanego rozdziału białek, usunąć z nich żel,

• wypełnić rowki odpowiednio dobranymi surowicami zwierzęcymi (po 50 μl),

• umieścić płytkę w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej.

5. Ocena i interpretacja wyników:

• tworzące się w żelu łuki precypitacyjne oceniamy wizualnie po 24 h inkubacji odnosząc długość, grubość i kształt poszczególnych linii do linii uzyskanych z ludzką surowicą wzorcową; ocena ma charakter jakościowy

• poziom danej immunoglobuliny uważa się za prawidłowy („norma”) jeśli uzyskany w trakcie testu łuk precypitacyjny nie różni się zasadniczo od uzyskanego w tym samym teście łuku dla surowicy wzorcowej. W przeciwnym przypadku poziom ocenianej immunoglobuliny podaje się jako obniżony lub podwyższony („wzrost”, „spadek”). Białko monoklonalne uważa się za obecne jeśli wyraźnemu wzrostowi poziomu jednego z łańcuchów lekkich immunoglobulin towarzyszy istotny spadek poziomu drugiego łańcucha lekkiego (odpowiednio kappa lub lambda) i temu obrazowi towarzyszy wyraźna dysproporcja w poziomach łańcuchów ciężkich immunoglobulin (istotny wzrost poziomu jednej klasy immunoglobuliny przy jednoczesnym spadku poziomu pozostałych).

3. Immunoblotting

1. Sprzęt i odczynniki:

• pipety nastawne 1 - 1000 μl

• probówki 1,5 ml

• zestaw ANA Profile 3 EUROLINE firmy EUROIMMUN

2. Materiał badany:

surowica ludzka (min. ilość 50 μl, opt. ~ 1 ml)

3. Zasada metody:

Opakowanie zawiera 16 pasków testowych (membrany) z naniesionymi w postaci linii scharakteryzowanymi biochemicznie antygenami. Każdy pasek pozwala na wykrycie In vitro 14 różnych antygenów: nRNP, Sm, SS-A (SS-A natywne i Ro 52), SS-B, Scl-70, Jo-1, CENP B, PCNA, dsDNA, nukleosomy, histony, rybosomalne białko P oraz AMA-M2 w surowicy lub plazmie. W pierwszym etapie paski membrany inkubuje się z rozcieńczonymi surowicami pacjentów. W pozytywnych przypadkach przeciwciała klasy IgG (a także IgA i IgM) wiążą się podczas drugiego etapu inkubacji z przeciwciałami przeciwko ludzkiej IgG znakowanymi enzymem (koniugat enzymatyczny), który następnie katalizuje reakcję barwną.

4. Wykonanie:

• Przeznaczone do badania próbki surowicy oraz kontrolę dodatnią należy rozcieńczać w stosunku 1:101 w buforze do próbek (np. 15 μl surowicy + 1,5 ml buforu do próbek). Bufor do próbek jest gotowy do użycia; koniugat enzymatyczny należy rozcieńczyć w stosunku 1:10 (np. 150 μl + 1,35 ml buforu do próbek). Bufor do płukania należy rozcieńczyć wodą destylowaną w stosunku 1:10 (1 ml buforu do płukania + 9 ml wody/pasek)

• Potrzebną ilość pasków (odpowiadającą liczbie pacjentów + kontrola pozytywna) należy umieścić w rynienkach płytki do płukania w taki sposób by numer paska był widoczny. Inkubować 5 min w 1,5 ml buforu do rozcieńczenia. Po usunięciu płynu do rynienek podać po 1,5 ml rozcieńczonych surowic pacjentów.

• Inkubować 30 min w temperaturze pokojowej (+ 18 - 25°C) z ostrożnym mieszaniem (kołyska laboratoryjna).

• Płukanie: opróżnić rynienki reakcyjne i trzykrotnie płukać, za każdym razem używając 1,5 ml buforu płuczącego (3 × 1 min, kołyska laboratoryjna).

• Inkubacja koniugatu: odpipetować do każdej rynienki reakcyjnej po 1,5 ml roztworu koniugatu enzymatycznego (znakowana alkaliczną fosfatazą kozia Ig anty- ludzka IgG). Inkubować 30 min w temperaturze pokojowej z mieszaniem.

• Płukanie: opróżnić rynienki inkubacyjne. Płukać jak wyżej.

• Inkubacja substratu: odpipetować do każdej rynienki inkubacyjnej po 1,5 ml roztworu substratu/chromogenu (NBT/BCIP). Inkubować 10 min w temperaturze pokojowej na kołysce laboratoryjnej.

• Przerwanie reakcji: opróżnić rynienki i trzykrotnie płukać wodą destylowaną (3 × 1 min, kołyska laboratoryjna).

• Pomiar: Paski należy umieścić w arkuszu protokołu oceny testu, wysuszyć. Arkusz zeskanować i dokonać oceny półilościowej testu przy pomocy programu EUROLineScan firmy EUROIMMUN.

5. Ocena i interpretacja wyników:

Zależnie od intensywności wybarwienia prążka wynik dla poszczególnych antygenów podaje się jako negatywny, słabo dodatni, dodatni, silnie dodatni.

Metody ilościowe oceny reakcji antygen-przeciwciało.

Zagadnienia:

elektroforeza rakietkowa, immunodyfuzja Mancini'ego, turbidymetria, nefelometria, metody wykorzystujące odczynniki znakowane, RIA, ELISA, wiarygodność metody diagnostycznej, przykłady zastosowania testów diagnostycznych

Metody oceny ilościowej:

• ocena turbidymetryczna

Pomiar zmętnienia próbki, będącego wynikiem reakcji antygen-przeciwciało, przy jednoczesnej kontroli prędkości zachodzenia reakcji zmętnienia oraz czasu po którym prędkość zachodzącej reakcji była maksymalna.

W trakcie ćwiczeń studenci oznaczają metodą turbidymetryczną poziom składowych układu dopełniacza C3c i C4.

• odczyn immunoenzymatyczny ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay)

W metodzie ELISA studzienki reakcyjne mikropłytek (faza stała) opłaszczone są antygenem. W pierwszym etapie przeciwciała obecne w badanych surowicach łączą się z zaadsorbowanym antygenem. W drugim etapie do układu dodaje się wyznakowanego enzymem koniugatu antyglobulinowego. Następnie dodawany jest substrat dla enzymu, który w reakcji z enzymem daje barwny produkt. Przy użyciu odpowiedniego czytnika można mierzyć różnice w zabarwieniu reakcji w zależności od stężenia poszukiwanej substancji.

W trakcie ćwiczeń studenci oznaczają metodą ELISA poziom przeciwciał IgG przeciw bakteriom Borrelia burgdorferi.

Preparatyka:

1. Ocena turbidymetryczna

1. Sprzęt i odczynniki:

• turbidymetr

• kuwety plastikowe z mieszadełkiem

• zestaw regulowanych mikropipet 10 -1000 μl

• 0,9 % roztwór soli fizjologicznej

• Zestaw gotowych do użycia (rozcieńczonych) przeciwciał zwierzęcych przeciw składowym dopełniacza C3c i C4

2. Materiał badany:

1. surowica pacjenta (min. ilość 50 μl, opt. ~ 1 ml)

3. Zasada metody:

Aparat mierzy zmętnienie próbki, będące wynikiem reakcji Ag-Ab, kontrolując jednocześnie prędkość zachodzenia reakcji oraz czas po którym ta prędkość jest maksymalna.

4. Wykonanie

• Ogrzać przeciwciała i surowice do temperatury pokojowej.

• Rozcieńczyć badane surowice w soli fizjologicznej 1:21 (50 μl surowicy + 1000 μl 0,9 % NaCl).

• Podać odpowiednią ilość rozcieńczonej surowicy do kuwet (wg wskazań aparatu).

• Po włączeniu aparatu umieścić kolejne buteleczki z przeciwciałami w aparacie tak by odczytał on kod paskowy na etykiecie; w razie konieczności wprowadzić kod paskowy ręcznie.

• Umieścić kuwetę z badaną surowicą w aparacie.

• Podać do kuwety 500 μl roztworu odpowiedniego przeciwciała.

• Mieszanie próbek, odczyt i wydruk następują automatycznie w ciągu ~ 30 sek.

• Sprawdzić uzyskany wynik z normą dla poszczególnych białek.

• W razie dużych odstępstw od normy powtórzyć pomiar po rozcieńczeniu surowicy badanej wg wskazań aparatu.

5. Ocena i interpretacja wyników:

W zależności od ustawienia aparatu uzyskujemy wynik w mg/ml, mg/dl lub w jednostkach międzynarodowych; uzyskany wynik nie wymaga żadnych dalszych przeliczeń; należy go odnieść do płci i wieku pacjenta (szczególnie ważne w przypadku dzieci).

2. Odczyn immunoenzymatyczny ELISA

1. Sprzęt i odczynniki:

• pipety nastawne 1 - 1000 μl

• probówki 1,5 ml

• statyw do probówek

• zestaw ELISA Anty- Borrelia plus VlsE (IgG) firmy EUROIMMUN

2. Materiał badany:

• surowica ludzka (min. ilość 50 μl, opt. ~ 1 ml)

3. Zasada metody:

Opakowanie zawiera mikropłytkę ze studzienkami reakcyjnymi opłaszczonymi antygenem. W pierwszym etapie studzienki reakcyjne inkubuje się z rozcieńczonymi surowicami pacjentów. W pozytywnych przypadkach przeciwciała klasy IgG wiążą się z obecnymi na powierzchni studzienki antygenami. Związane przeciwciała wykrywa się podczas drugiego etapu inkubacji z przeciwciałami skierowanymi przeciwko ludzkiej IgG znakowanymi enzymem (koniugat enzymatyczny), który następnie katalizuje reakcję barwną.

4. Wykonanie

• Przeznaczone do badania próbki surowicy należy rozcieńczyć w stosunku 1:101 w buforze do próbek (np. 10 μl surowicy + 1 ml buforu do próbek). Bufor do próbek, koniugat enzymatyczny, kalibratory i kontrole gotowe są do użycia. Bufor do płukania należy rozcieńczyć destylowaną wodą w stosunku 1:10 (np. 5 ml buforu do płukania + 45 ml wody).

• Inkubacja próbek surowicy: zgodnie ze schematem odpipetować do studzienek reakcyjnych po 100 μl surowicy kalibracyjnej, pozytywnej i negatywnej surowicy kontrolnej oraz rozcieńczone surowice pacjentów. Inkubować 30 min w temperaturze pokojowej (+ 18 - 25°C).

• Płukanie: opróżnić studzienki reakcyjne i trzykrotnie płukać, za każdym razem używając 300 μl rozcieńczonego buforu płuczącego. Po każdym płukaniu płytkę mikrotitracyjną należy odwrócić studzienkami w dół i silnie wytrząsnąć nad papierem filtracyjnym, aby całkowicie usunąć resztki buforu płuczącego.

• Inkubacja koniugatu: odpipetować do każdej studzienki reakcyjnej po 100 μl roztworu koniugatu enzymatycznego (znakowana peroksydazą królicza Ig anty- ludzka IgG). Inkubować 30 min w temperaturze pokojowej.

• Płukanie: opróżnić studzienki reakcyjne. Płukać jak wyżej.

• Inkubacja substratu: Odpipetować do każdej studzienki reakcyjnej po 100 μl roztworu substratu/chromogenu. Inkubować 15 min. W temperaturze pokojowej; chronić przed światłem.

• Przerwanie reakcji: Odpipetować do każdej studzienki reakcyjnej, w tej samej kolejności i z tą samą szybkością co przy pipetowaniu substratu, po 100 μl roztworu przerywającego reakcję.

• Pomiar: fotometryczna ocena intensywności barwy powinna być przeprowadzona w ciągu 30 min. Od zastopowania reakcji, przy długości fali λ = 450 nm i referencyjnej długości fali > 620 nm.

5. Ocena i interpretacja wyników:

• Odwzorowując w linearnym układzie współrzędnych wartości ekstynkcji 3 surowic kalibracyjnych i odpowiadające im względne jednostki (RU/ml), a następnie łącząc naniesione punkty, wykreśla się krzywą wzorcową, z której można odczytać stężenie przeciwciał w surowicy. Krzywą można wykreślić także za pomocą programu komputerowego.

• Do akceptowania i dokumentowania wyników wykorzystuje się program komputerowy dostarczony przez firmę EUROIMMUN.

• Górna granica normy (cut-off) rekomendowana przez EUROIMMUN wynosi 20 jednostek relatywnych (R/ml). Rekomenduje się następującą interpretację wyników:

< 16 RU/ml negatywny

16 - 22 RU/ml graniczny

> 22 RU/ml pozytywny

Ćwiczenie 2

Immunologia komórkowa - badania immunofenotypowe.

Zagadnienia:

pojęcie immunofenotypu, cytofluorymetria przepływowa, cytometr przepływowy, względna wielkość komórki, względna ziarnistość komórki, średnia intensywność fluorescencji, zjawisko fluorescencji, markery różnicowania, immunofenotyp krwi obwodowej

Ocena immunofenotypu:

• immunofluorescencja bezpośrednia - oznaczanie z pełnej krwi obwodowej

Określenie antygenów tzw. markerów różnicowania (ang. cluster of differentiation; CD) przy użyciu przeciwciał monoklonalnych, celem zróżnicowania komórek immunologicznie kompetentnych.

W trakcie ćwiczeń studenci oznaczają metodą immunofluorescencji bezpośredniej obecność antygenów różnicowania leukocytów krwi obwodowej i przeprowadzają analizę immunofenotypową badanych próbek.

Preparatyka:

Immunofluorescencja bezpośrednia

1. Sprzęt i odczynniki:

• cytometr przepływowy

• zestaw regulowanych mikropipet 10 -1000 μl

• probówki cytometryczne

• statyw do probówek

• tryskawka do PBS

• zlewka

• 10 × stężony bufor lizujący

• roztwór PBS pH 7,4

• przeciwciała monoklonalne znakowane fluorochromem

• płyn lizujący

• woda destylowana

2. Materiał badany:

krew obwodowa pobrana do probówki z antykoagulantem EDTA (min. ilość 500 μl)

3. Zasada metody:

Określenie przy pomocy cytofluorymetru przepływowego zespołu charakterystycznych cech antygenowych komórki, które pozwalają zidentyfikować populacje komórek o istotnym znaczeniu diagnostycznym.

4. Wykonanie

• Do probówek wprowadzić po 2 μl odpowiednich przeciwciał.

• Następnie do każdej probówki dodać po 50 μl dokładnie wymieszanej krwi.

• Inkubować 15 - 20 min w temperaturze pokojowej chroniąc przed światłem.

• Do każdej probówki dodać po 500 μl roztworu buforu lizującego, rozcieńczonego wodą destylowaną 1 : 10 i dokładnie wymieszać.

• Inkubować 10 min w temperaturze pokojowej chroniąc przed światłem.

• Przerwać lizę dodając do probówki ~2 ml PBS z tryskawki.

• Wirować probówki 5 min z prędkością 1500 obr./min.

• Zlać supernatant.

• Ponownie do probówki dodać PBS i wirować jak wyżej.

• Zlać supernatant i zawiesić osad w 150 μl PBS, próbki gotowe do akwizycji.

5. Ocena i interpretacja wyników:

Ocenę wykonanych próbek przeprowadza się przy użyciu cytometru przepływowego stosując odpowiedni program komputerowy. W trakcie oceny immunofenotypowej określa się odsetek komórek wykazujących fluorescencję danego fluorochromu.

Ćwiczenie 4

Immunologia komórkowa - ocena czynnościowa.

Zagadnienia:

komórki immunologicznie czynne, komórki pomocnicze, metody izolacji komórek, testy czynnościowe, reakcje nadwrażliwości, testy skórne, metody oceny funkcji limfocytów, test transformacji blastycznej, metody oceny aktywacji komórek, mitogeny, testy cytotoksyczne, metody oceny wydzielania cytokin, metody oceny funkcji komórek żernych, ocena adhezji, ocena zdolności do chemotaksji, zaburzenia chemotaksji, ocena zdolności do fagocytozy, indeks fagocytarny, zaburzenia fagocytozy, ocena zdolności do zabijania wewnątrzkomórkowego, wybuch tlenowy, zaburzenia wybuchu tlenowego, zaburzenia zabijania wewnątrzkomórkowego

1. Izolacja komórek na gradiencie i oznaczanie żywotności komórek.

• metoda izolacji w gradientach gęstości

Wykorzystuje różnice w wielkości i ciężarze właściwym poszczególnych komórek. Stosuje się mieszaniny rozdzielające: Ficoll (Percoll) - Isopaque (Uropolina) - [metoda Boyum'a], Gradisol (mieszanina Uropoliny i dekstranu) o różnej gęstości. Krew pobraną na antykoagulant i wymieszaną z PBS nawarstwia się na odpowiedni gradient i wiruje. Po wirowaniu komórki zbiera się powstałej interfazy.

• ocena żywotności izolowanych komórek

W celu oceny żywotności komórek wykorzystuje się np. roztwór błękitu trypanu. Dodanie tego barwnika pozwala ocenić przepuszczalność błony komórkowej, w teście martwe komórki barwią się na niebiesko. Oceniane komórki liczy się na kamerze pod mikroskopem świetlnym.

W trakcie ćwiczeń studenci przeprowadzają rozdział limfocytów z krwi obwodowej oraz oceniają ich żywotność.

2. Ocena cyklu komórkowego jednojądrzastych komórek krwi obwodowej.

Do uzyskanych na gradiencie limfcytów dodaje się 100μl roztworu 0,1% saponiny w celu permabilizacji komórek. Po inkubacji i wirowaniu do permabilizowanych komórek dodaje się roztwór jodku propidyny. Wyznakowane jodkiem propidyny preparaty poddaje się akwizycji przy pomocy cytometru przepływowego. W trakcie analizy ocenia się poszczególne fazy cyklu komórkowego.

W trakcie ćwiczeń studenci przeprowadzają barwienie jodkiem propidyny próbek limfocytów uzyskanych w trakcie separacji na gradiencie, a następnie obliczają odsetki komórek w poszczególnych fazach cyklu komórkowego.

Preparatyka:

1. Izolacja jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) w gradiencie gęstości

1. Sprzęt i odczynniki:

• probówki plastikowe 15 ml i 50 ml

• zestaw regulowanych mikropipet 10 -1000 μl

• Gradisol L (FICOLL o d = 1,077 g/cm³)

• Bufor PBS

2. Materiał badany:

krew obwodowa pobrana do probówki z antykoagulantem heparyną (min. ilość 500 μl)

3. Zasada metody:

Na określoną objętość gradientu gęstości nawarstwia się rozcieńczoną PBS krew obwodową. Po odwirowaniu zbiera się interfazę bogatą w komórki limfoidalne. Na dnie probówki zbierają się erytrocyty i granulocyty, które przedostały się przez warstwę Ficollu.

4. Wykonanie

• Pobraną na heparynę krew rozcieńczyć w probówce 50 ml roztworem PBS w stosunku 1 : 3.

• Do probówki 15 ml wprowadzić Gradisol L i krew zawieszoną w PBS w stosunku 1:1 (3:1) tak aby zachować granicę faz.

• Wirować probówki w ciągu 20 min, w temperaturze 20°C, przy 2000 obr./min.

• Zebrać z interfazy pierścień komórek jednojądrzastych.

• Płukać dwa razy w PBS. Wirować w temperaturze 4°C przy 200 g.

• Komórki zawiesić w PBS.

5. Ocena i interpretacja wyników:

Ocenę izolacji PBMC przeprowadza się pod mikroskopem świetlnym.

2. Liczenie komórek na hemacytometrze oraz określenie żywotności komórek przy pomocy błękitu trypanu.

1. Sprzęt i odczynniki:

• hemacytometr (kamera do liczenia komórek, np. Burkera)

• zestaw regulowanych mikropipet 10 -1000 μl

• probówki plastikowe

• mikroskop świetlny

• błękit trypanu 0,05 %

2. Materiał badany:

jednojądrzaste komórki krwi obwodowej izolowane w gradiencie gęstości

3. Zasada metody:

W wyniku barwienia błękitem trypanu komórki martwe wybarwiają się na niebiesko, do wnętrza komórek żywych barwnik nie wnika.

4. Wykonanie

• Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl 0,05 % błękitu trypanu (stosunek 1:1).

• Nałożyć 10 μl mieszaniny komórek i błękitu trypanu na hemacytometr pod szkiełko nakrywkowe.

• Umieścić kamerę do liczenia komórek pod mikroskopem świetlnym.

• Obliczyć ilość żywych (niewybarwionych) i martwych (niebieskich) komórek zawartych na powierzchni 1 mm². Powtórzyć liczenie dla 3 - 4 różnych pól i obliczyć średnią liczbę komórek na 1 mm².

• Po zakończeniu liczenia wyczyścić kamerę i szkiełko nakrywkowe wodą oraz 70% alkoholem, a następnie osuszyć.

5. Ocena i interpretacja wyników:

• Przeliczyć całkowitą liczbę żywych komórek wg wzoru:

# żywych komórek = średnia # żywych komórek × rozcieńczenie × 2 × 1⋅10⁵

(np. # komórek × 10 ml × 2 × 10 000)

• Obliczyć % żywych komórek wg wzoru:

× 100 = % żywych komórek

3. Ocena cyklu komórkowego jednojądrzastych komórek krwi obwodowej.

1. Sprzęt i odczynniki:

• cytometr przepływowy

• zestaw regulowanych mikropipet 10 -1000 μl

• probówki cytometryczne

• statyw do probówek

• tryskawka do PBS

• zlewka

• roztwór PBS pH 7,4

• 1 % roztwór saponiny w RPMI + 10% surowicy FBS

• roztwór jodku propidyny 100 g/ml w PBS

2. Materiał badany:

• PBMC uzyskane w trakcie izolacji na gradiencie.

3. Zasada metody:

Jodek propidyny jest barwnikiem fluorescencyjnym, który barwi jądra komórkowe badanych komórek interkalując z helisą DNA. Barwnik ten emituje czerwone światło fluorescencji w zakresie możliwym do oceny przy pomocy cytometru przepływowego.

4. Wykonanie

• Do badanych komórek dodać 200 l 1 % roztworu saponiny.

• Próbkę inkubować 30 min w lodówce.

• Po tym czasie wirować próbkę 10 min przy prędkości 1500 obr./min w temperaturze 4°C.

• Supernatant odrzucić, a uzyskany osad zawiesić w 150 l schłodzonego buforu PBS zawierającego 100 g/ml jodku propidyny.

• Próbę inkubowanć 30 min w temperaturze 4°C chroniąc przed światłem (w lodówce).

• Po tym czasie próbę poddać akwizycji przy użyciu cytometru przepływowego.

5. Ocena i interpretacja wyników:

W trakcie przeprowadzanej analizy ocenia się średnią intensywność fluorescencji (MFI) emitowaną przez jodek propidyny interkalujący z DNA badanych komórek. Ocenę intensywności fluorescencji przeprowadza się przy pomocy histogramu.

Ćwiczenie 4

Wykrywanie białek i kwasów nukleinowych in situ.

Metody immunomorfologiczne.

Zagadnienia:

sposoby detekcji reakcji antygen-przeciwciało, reakcje immunoenzymatyczne, reakcja APAAP, reakcja ABC, reakcja LAB, reakcje z użyciem barwnika fluorescencyjnego, immunofluorescencja wielokolorowa, mikroskopia konfokalna, mikroskopia wielofotonowa, reakcje z użyciem metali ciężkich, mikroskopia elektronowa, technologia ImageStream

Reakcje z użyciem barwnika fluorescencyjnego:

• zamrażanie materiału tkankowego

Szybkie zamrażanie zapobiega powstawaniu niszczących strukturę tkanki dużych kryształów lodu.

• reakcja pośredniej immunofluorescencji IMF

Wykrywanie autoprzeciwciał w surowicy w chorobach autoimmunologicznych.

W trakcie ćwiczeń studenci wykonują preparaty mikroskopowe na skrawkach tkankowych z wątroby szczura i oceniają je pod mikroskopem fluorescencyjnym.

1. Zamrażanie materiału tkankowego.

1. Sprzęt i odczynniki:

• termos z cienkościennym naczyńkiem metalowym

• pęseta

• worek foliowy

• mieszanina zamrażająca (suchy lód + aceton)

• płyn oziębiający (eter naftowy)

• płyn o dużej gęstości zamrażany razem z tkanką (tzw. Tissue-tek)

2. Materiał badany:

• blok tkankowy

3. Zasada metody:

Wiele antygenów w przebiegu rutynowego utrwalania i zatapiania w parafinie bloków tkankowych ulega zniszczeniu. W związku z tym materiał tkankowy przewidziany do rekcji immunomorfologicznych należy w większości przypadków przygotowywać w osobny sposób, zwykle przez zamrażanie. Zamrażanie tego materiału powinno odbywać się jak najkrótszym czasie, aby zapobiec tworzeniu się w tkance kryształów lodu, które mogą uszkodzić fizycznie tkankę.

4. Wykonanie

• Zamrażany blok tkankowy zanurza się w mieszaninie zamrażającej przygotowanej wcześniej w termosie

• Po kilku-kilkunastu sekundach następuje wyraźne i trwałe zblednięcie tkanki, świadczące o zamrożeniu materiału.

• Zamrożony blok tkankowy, przy pomocy pęsety wyjmuje się z mieszaniny zamrażającej, umieszcza w opisanym woreczku foliowym i przechowuje w zamrażarce (opt. − 70°C).

2. Oznaczanie autoprzeciwciał metodą immunofluorescencji pośredniej.

1. Sprzęt i odczynniki:

• szkiełka z preparatami wątroby szczura (substrat antygenowy dla wykrywanych autoprzeciwciał)

• kriostat

• odtłuszczone w alkoholu szkiełka nakrywkowe

• pipety jednorazowe i regulowane

• probówki plastikowe

• statyw do probówek

• płuczka szklana

• komora wilgotna

• bufor PBS o pH 7,6

• przeciwciała królicze anty ludzkie IgG, A, M znakowane FITC

• surowica kontrolna

• 90% buforowana gliceryna

• błękit Evansa

2. Materiał badany:

• surowica badana w ilości ~ 2 ml.

3. Zasada metody:

Autoprzeciwciała obecne w badanych surowicach przyłączają się w pierwszym etapie do substratu antygenowego (antygenów w skrawkach wątroby szczurzej) na szkiełkach podstawowych. W drugim etapie następuje detekcja autoprzeciwciał przy pomocy wyznakowanej fluoresceina antyglobuliny.

4. Wykonanie

• wyjąć szkiełka z antygenami z lodówki i doprowadzić je do temperatury pokojowej pod wentylatorem.

• przygotować rozcieńczenia badanych surowic w roztworze PBS (rozc. od 1:80)

• nałożyć po 25 μl surowic (kontrolnych i badanych) na szkiełko ze skrawkami.

• inkubować 30 min, przepłukać w PBS-Tween, płukać w płuczce 3 × 5 min.

• nałożyć 20 μl anty-ludzkiej IgG, A, M/FITC na szkiełko.

• inkubować 30 min, przepłukać w PBS-Tween, płukać w płuczce 3 × 5 min.

• zamknąć w glicerolu/PBS pod szkiełkiem nakrywkowym

• do ostatniego płukania można dodać błękit Evansa (10 kropli na 150 ml PBS-Tween)

5. Ocena i interpretacja wyników:

Ocenę preparatów przeprowadza się pod mikroskopem fluorescencyjnym. Za reakcję dodatnią uznaje się obecność żółtozielonej fluorescencji (w odpowiednim substracie komórkowym w zależności od rodzaju autoprzeciwciał).

LITERATURA:

1. Żeromski J. Immunologia dla studentów wydziału lekarskiego. Wyd. AM, Poznań 2008;

2. Żeromski J. Metody immunologiczne. Przewodnik do ćwiczeń z immunologii dla studentów Wydziału Lekarskiego. Wyd. AM, Poznań 1997;

3. Luft S. Metody diagnostyki serologicznej w reumatologii. PWN, Warszawa 1996;

4. Roitt I., Brostoff J., Male D. Immunologia. Elsevier Urban & Partner, Wrocław 2008;

5. Gołąb J., Jakóbisiak M., Lasek W. Stokłosa T. Immunologia. PWN, Warszawa 2008;

6. Ptak W., Ptak M., Szczepanik M. Podstawy immunologii. PZWL, Warszawa 2009;

7. Zeman K. Zaburzenia odporności u dzieci. PZWL, Warszawa 2002;

8. Zabel M. Immunocytochemia. PWN, Warszawa 1999;

9. Zuba-Surma E.K., Kucia M., Ratajczak M.Z. Post. Biol. Kom. 2007; 34(2): 361- 376;

21

---