TEMAT: Prowadzenie testów toksykologicznych z zastosowaniem różnych organizmów.

CEL: Porównanie wrażliwości bioindykatorów w stosunku do toksycznego związku -antracenu, na podstawie prowadzonych testów i obliczonych wartości LC(50) dla każdego z nich po określonych czasach ekspozycji.

ZAKRES I METODYKA BADAŃ:

1. Test przeżywalności z zastosowaniem Rurecznika pospolitego (Tubifex tubifex).

Test ten polega na wykonaniu szeregu rozcieńczeń antracenu, następnie dodaniu

określonej ilości organizmów testowych do każdego z rozcieńczeń, określeniu liczby

martwych osobników po upływie 24 i 48 godzin, i obliczeniu wartości stężenia śmiertelnego LC(50)-24h, LC(50)-48h.

Stosowany bioindykator należy do typu Pierścienic oraz gromady Skąposzczetów. Jego środowiskiem bytowania jest warstwa przydenna stojących zbiorników słodkowodnych. Ciało ma kształt wąskiej, segmentowanej rurki koloru od bladego przez brudnoczerwony do jasnobrązowego. Jest to organizm dość odporny na niedostatek tlenu i zanieczyszczenia.

2. Test przeżywalności z zastosowaniem skorupiaków Daphnia magna Straus.

Test ten podobnie jak poprzedni polega na wykonaniu szeregu rozcieńczeń

antracenu, a następnie dodaniu określonej ilości organizmów testowych do każdego

z rozcieńczeń, określeniu liczby martwych organizmów po upływie 24 i 48 godzin, obliczeniu wartości stężenia śmiertelnego LC(50)-24h, LC(50)-48h.

Daphnia magna występuje w wodach słodkich o niewielkim stopniu zanieczyszczenia. Żywi się zawiesiną odfiltrowaną z wody oraz sama stanowi cenny pokarm dla ryb. Jest cennym bioindykatorem ze względu na krótki cykl rozwojowy, łatwą hodowlę, małe rozmiary oraz wrażliwość na działanie trucizn.

3. Test enzymatyczny z zastosowaniem skorupiaków Daphnia magna.

Typu IQ Toxicity Test (Fluotox).

Test IQ jest szybkim testem pozwalającym na precyzyjne obliczenie EC(50)-1h. Zasada tego testu polega na zastosowaniu fluorometrycznego biomarkera - metyloumbelliferylogalaktozydu IQ.

Po wykonaniu szeregu rozcieńczeń, dodaniu określonej ilości organizmów i inkubacji trwającej godzinę, należy dodać biomarker, który pod wpływem enzymu galaktozydazy, wytwarzanego przez żywe, w pełni sprawne organizmy hydrolizowany jest do metyloumbelliferonu fluoryzującego w świetle UV. Organizmy które nie wykazują fluorescencji są nieodwracalnie uszkodzone.

4. Test przeżywalności z zastosowaniem skorupiaków Artemia salina

Test typu Artoxkit M.

Test ten polega na wykonaniu szeregu rozcieńczeń antracenu, napełnieniu studzienek testowych według określonego schematu, dodaniu larw Artemi saliny będących w II i III stadium rozwoju do każdej studzienki, a następnie po upływie 24 godzin określeniu liczby martwych zwierząt.

Artemia salina występuje w zbiornikach zarówno o małej zawartości soli, jak i silnie zasolonych. Żywi się głównie planktonem roślinnym odfiltrowanym z wody. Rozmnaża się płciowo (jajożyworodnie przy sprzyjających warunkach środowiskowych oraz jajorodnie gdy warunki są niesprzyjające, wtedy to powstają formy przetrwalnikowe - cysty, z których przy odpowiednich warunkach wylęgają się naupliusy) oraz na drodze partenogenezy.

Wszystkie wyżej wymienione testy zostały wykonane według instrukcji zawartych w skrypcie do ćwiczeń laboratoryjnych „Toksykologia środowiska” autorstwa

Marii Łebkowskiej, Moniki Załęskiej-Radziwiłł oraz Bożeny Słomczyńskiej.

WYNIKI I OBLICZENIA:

Ad.1) Test przeżywalności z zastosowaniem Rurecznika pospolitego (Tubifex tubifex).

Stężenie [mg/l]	100	50	25	12,5	6,25	3,1250	1,5625	0,7813	Kontrola
Początkowa ilość organizmów.	41	40	41	40	40	40	40	40	40
Ilość martwych organizmów po czasie 24 h.	26	16	11	8	3	2	0	0	0
Ilość martwych organizmów po czasie 48 h.	30	25	22	20	16	12	9	0	0
logC (Xi)	2,0000	1,6990	1,3979	1,0969	0,7959	0,4949	0,1938	-0,1072	-
Xi^2	4,0000	2,8865	1,9542	1,2032	0,6334	0,2449	0,0376	0,0115	-
% (24h)	63	40	27	20	7	5	0	0	0
Probit (Y1)	5,3319	4,7467	4,3872	4,1584	3,5242	3,3551	-	-	-
X1Y1	10,6638	8,0645	6,133	4,5614	2,8048	1,66027	-	-	-
% (48h)	73	62	54	50	40	30	22	0	0
Probit (Y2)	5,6128	5,3055	5,1004	5,0000	4,7467	4,4756	4,2278	-	-
X2Y2	11,2256	9,0139	7,1301	5,4846	3,7778	2,2148	0,8194	-	-

niebieskie zaznaczenie- oznacza, że dany probit nie należy do przedziału:
, czyli nie bierzemy go pod uwagę w obliczeniach. W związku z tym pomijamy również w obliczeniach odpowiadające im wartości X_i , X_i², Y_i , X_iY_i.

Po 24 godzinach:

X₁śr = 1,3979 Y_1śr = 4,4297

∑X₁ = 6,9897 ∑Y₁ = 22,1484

∑X₁² = 10,6774 ∑X₁Y₁ = 32,2276

Po 48 godzinach:

X_2śr = 1,0969 Y_2śr = 4,9241

∑X₂ = 7,6784 ∑Y₂ = 34,4688

∑X₂² = 10,9598 ∑X₂Y₂ = 39,6661

Obliczanie stężenia letalnego LC(50)-24h metodą probitową:

Przedział ufności:

Dolna granica:

Górna granica:

⁼ 63,99 mg/l

przedział ufności: (48,79 - 83,93)

Obliczanie stężenia letalnego LC(50) - 48h :

mg/l

przedział ufności: (2,5 - 100,35)

Ad.2) Test przeżywalności z zastosowaniem skorupiaków Daphnia magna Straus.

Stężenie [mg/l]	100	50	25	12,5	6,25	3,125	1,5625	0,7812	Kontrola
Początkowa ilość organizmów.	20	20	20	20	20	20	20	20	20
Ilość martwych organizmów po czasie 24 h.	12	8	6	4	3	1	0	0	0
Ilość martwych organizmów po czasie 48 h.	15	11	8	7	5	4	3	2	0
logC (Xi)	2,0000	1,6990	1,3979	1,0969	0,7959	0,4949	0,1938	-0,1072	-
Xi^2	4,0000	2,8865	1,9542	1,2032	0,6334	0,2449	0,0376	0,0115	-
% (24h)	60	40	30	20	15	5	0	0	0
Probit (Y1)	5,2533	4,7467	4,4756	4,1584	3,9636	3,3551	-	-	-
X1Y1	10,5066	8,0645	6,2566	4,5614	3,1546	1,6603	-	-	-
% (48h)	75	55	40	35	25	20	15	10	0
Probit (Y2)	5,6745	5,1257	4,7467	4,6147	4,3255	4,1584	3,9636	3,7184	-
X1Y2	11,3490	8,7084	6,6356	5,0619	3,4426	2,0578	0,7682	-0,3988	-

niebieskie zaznaczenie- oznacza, że dany probit nie należy do przedziału:
, czyli nie bierzemy go pod uwagę w obliczeniach. W związku z tym pomijamy również w obliczeniach odpowiadające im wartości X_i , X_i², Y_i , X_iY_i.

Po 24 godzinach:

X₁śr = 1,3979 Y₁śr = 4,5195

∑X₁ = 6,9897 ∑Y₁ = 22,5976

∑X₁² = 10,6774 ∑X₁Y₁ = 32,5437

Po 48 godzinach:

X₂śr = 0,9464 Y₂śr = 4,5409

∑X₂ = 7,5711 ∑Y₂ = 36,3275

∑X₂² = 10,9713 ∑X₂Y₂ = 37,6248

Obliczanie stężenia letalnego LC(50)-24h metodą probitową:

mg/l

przedział ufności: (28,97 - 176,43)

Wyznaczenie stężenia letalnego LC50-48h metodą graficznej interpolacji:

Z wykresu odczytujemy, że LC50-48h występuje przy stężeniu ~ mg/l.

liniowego i logarytmicznego 28,18 mg/l są do siebie zbliżone. Dlatego też w dalszych ( dokładniejszych ) obliczeniach powinniśmy uzyskać podobny wynik.

Obliczanie stężenia letalnego LC(50)-48h metodą probitową:

=30,54 mg/l

przedział ufności: (7,02 - 132,85)

Po porównaniu uzyskanej metodą probitową wartości LC(50)-48 h z wstępnymi wynikami odczytanymi z wykresów stwierdzamy, że nie popełniliśmy błędu w trakcie obliczeń. Wszystkie wartości stężenia letalnego są mocno do siebie zbliżone.

Ad.3) Test enzymatyczny z zastosowaniem skorupiaków Daphnia magna.

Typu IQ Toxicity Test (Fluotox).

Stężenie [mg/l]	Początkowa ilość organizmów.	Ilość organizmów wykazujących świecenie	Ilość organizmów nieodwracalnie uszkodzonych	%	logC (X)	Probit (Y)	XY	X^2
100	20	0	20	100	2,0000	-	-	4,0000
50	20	1	19	95	1,6990	6,6449	11,2895	2,8865
25	32	4	28	87	1,3979	6,1264	8,5643	1,9542
12,5	32	18	14	44	1,0969	4,8490	5,3189	1,2032
6,25	32	24	8	25	0,7959	4,3255	3,4426	0,6334
3,125	36	32	4	11	0,4949	3,7735	1,8673	0,2449
1,5625	33	30	3	9	0,1938	3,6592	0,7092	0,0376
0,7812	32	30	2	6	-0,2140	3,4452	-0,7374	0,0458
0,3906	32	31	1	3	-0,4083	3,1192	-1,2736	0,1667
Kontrola	32	32	0	0	-	-	-	-

niebieskie zaznaczenie- oznacza, że dany probit nie należy do przedziału:
, czyli nie bierzemy go pod uwagę w obliczeniach. W związku z tym pomijamy również w obliczeniach odpowiadające im wartości X_i , X_i², Y_i , X_iY_i.

Po 1 godzinie:

Xśr = 0,7959 Yśr = 4,5467

∑X = 3,9794 ∑Y = 22,7336

∑X² = 4,0733 ∑XY = 19,9024

Obliczanie stężenia efektywnego EC(50)-1h metodą probitową:

mg/l

przedział ufności: ( 0,81 - 17,85 )

Ad.4) Test przeżywalności z zastosowaniem skorupiaków Artemia salina

Test typu Artoxkit M.

Stężenie [mg/l]	100	50	25	12,5	6,25	3,125	1,5625	0,7812	0,3906	0,1953	0,0976	Kont.
Początkowa ilość organizmów.	105	99	92	107	110	97	135	115	111	108	97	142
Ilość martwych organizmów po czasie 24 h.	70	57	47	52	51	42	56	42	37	26	16	0
logC (X)	2,0000	1,6990	1,3979	1,0969	0,7959	0,4949	0,1938	-0,2140	-0,4083	-0,7093	-1,0106	-
X^2	4,0000	2,8865	1,9542	1,2032	0,6334	0,2449	0,0376	0,0458	0,1667	0,5031	1,0212	-
% (24h)	67	58	51	49	46	43	41	37	33	24	16	0
Probit (Y)	5,4399	5,2019	5,0251	4,9749	4,8996	4,8236	4,7725	4,6681	4,5601	4,2937	4,0055	-
XY (24 h)	10,8798	8,83787	7,0248	5,457	3,8995	2,38696	0,925	-0,999	-1,86189	-3,04551	-4,0478	-

Po 24 godzinach:

Xśr = 0,4851 Yśr = 4,7877

∑X = 5,3362 ∑Y = 52,6649

∑X² =12,6967 ∑XY = 29,4566

Obliczanie stężenia letalnego LC(50)-24h metodą probitową:

mg/l

przedział ufności: (0,47 - 250,82)

Zestawienie wyników dla przeprowadzonych testów:

• Test przeżywalności z zastosowaniem Rurecznika pospolitego (Tubifex tubifex).

63,99 mg/l

mg/l

• Test przeżywalności z zastosowaniem skorupiaków Daphnia magna Straus.

71,49 mg/l

30,54 mg/l

• Test enzymatyczny z zastosowaniem skorupiaków Daphnia magna.

Typu IQ Toxicity Test (Fluotox).

10,54 mg/l

• Test przeżywalności z zastosowaniem skorupiaków Artemia salina

Test typu Artoxkit M.

10,82 mg/l

Wnioski:

W przeprowadzonych przez nas testach korzystaliśmy z różnych bioindykatorów. Znalazł się tam przedtawiciel skąposzczetów- Tubifex tubifex, skorupiaki Daphnia magna, Daphnia magna Straus i Artemia salina. Wszystkie te organizmy należą do konsumentów.

Testy te miały na celu porównanie czułości wykorzystywanych przez nas bioindykatorów. Informacja ta jest bardzo ważna przy dalszej ocenie stanu zanieczyszczeń wód powierzchniowych. Im czulszy jest dany bioindykator, tym wcześniej można wykryć potencjalne zanieczyszczenie.

Analizując uzyskane przez nas wyniki w testach, w których LC(50) liczone było po 24 i 48 h zauważamy, że LC(50)-24 h jest co najmniej dwukrotnie wyższe od LC(50)-48 h. Nie wiemy jednak, który z tych wyników jest bardziej miarodajny, ponieważ nie wiemy czy wyniki po 24 i 48 h różnych testów są porównywalne w świetle prawa. Dlatego też analizując wyniki będziemy porównywać odpowiednio stężenia letalne po 24 h i oddzielnie po 48 h. Dodatkowo, dla zobrazowania tematu porównamy LC(50) -24 h otrzymane w teście z zastosowaniem skorupiaków Artemia salina z LC(50) -48 h otrzymanych w pozostałych testach.

Czułość bioindykatorów w stosunku do antracenu po 24 h jest różna dla poszczególnych organizmów. Najczulszym bioindykatorem okazał się skorupiak Artemia salina (10,82 mg/l). Pozostałe bioindykatory LC(50) wykazały przy dużo wyższym stężeniu antracanu: Tubifex- tubifex przy 63,99 mg/l, Daphnia magna Straus przy 71,49 mg/l, czyli są mniej czułe.

Analizując wyniki LC(50)-48 h nie mamy wątpliwości, że Tubifex- tubifex ( 15,87 mg/l ) jest bardziej czułym bioindykatorem niż Daphnia magna Straus ( 30,54 mg/l ).

Porównując LC(50) -24 h otrzymane w teście z zastosowaniem skorupiaków Artemia salina z LC(50) -48 h otrzymanych w pozostałych testach stwierdzamy, że najbardziej czułym bioindykatorem okazał się skorupiak Artemia salina (10,82 mg/l). Mniej czuły okazał się Tubifex- tubifex ( 15,87 mg/l ), a najmniej korzystnie wypadł bioindykator Daphnia magna Straus ( 30,54 mg/l ).

Ciekawy wynik uzyskaliśmy w teście enzymatycznym wyznaczającym EC(50)-1 h przeprowadzanym na skorupiakach Daphnia magna. Zmiany w organizmach nastąpiły przy niewielkim stężeniu antracenu 10,54 mg/l. Gdybyśmy porównali ten test z testem na przeżywalność z zastosowaniem skorupiaków Daphnia magna Straus zauważylibyśmy, że stężenie letalne dla 50 % badanych organizmów po 48 h występuje przy stężeniu 30,54 mg/l, zaś steżenie efektywne dla 50 % badanych organizmów przy 10,54 mg/l już po 1 h.

6

---