W ciągu ostatnich 20 lat znacznie zwiększyło się zastosowanie fluorescencji w biologii. Od paru lat spektroskopia fluorescencyjna i zmiany fluorescencji w czasie są podstawowym narzędziem badawczym w biochemii i w biofizyce. Sytuacja ta zmieniła się tak, że fluorescencja jest obecnie stosowana do monitorowania środowiska (analityka żywności, przemysłowa - szczególnie biotechnologiczna), w chemii klinicznej, do sekwencjonowania (ustalenie kolejności) DNA i w analizie genetycznej. Dodatkowo fluorescencja ma zastosowanie w identyfikacji komórkowej i służy do ich sortowania, a także do lokalizacji i obserwacji przepływów międzykomórkowych przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Wskutek czułości detekcyjnych metod fluorescencyjnych i wskutek trudności ze stosowaniem substancji radioaktywnych obecnie wiele testów medycznych opartych jest na zjawisku fluorescencji. Testy te oparte są na znacznikowaniu fluorescencyjnym ( ELISA ). DAKTYLOSKOPIA :-)

Spektroskopia fluorescencyjna ma zaletę czułości, prostoty i obfitości szczegółów, jeśli chodzi o informacje na temat molekuł i ich oddziaływań. Pomiary fluorescencyjne charakteryzują się wysoką czułością ponieważ optyczne obserwacje są kontrastowe, co można obrazowo porównać do widoku gwiazd w nocy na ciemnym tle, w odróżnieniu od takiejże obserwacji świtem lub w ciągu dnia.

Luminescencja - emisja promieniowania elektromagnetycznego o natężeniu większym od promieniowania cieplnego w danej temperaturze, zachodząca w dłuższej skali czasowej (względem okresu emitowanych drgań).

- dzieli się na fluorescencję i fosforescencję zależnie od natury wzbudzonych stanów elektronowych

Schemat Jabłońskiego - Rys. 1.

Czas życia fluorescencji ( τ ) jest traktowany jako średni czas pomiędzy chwilami wzbudzenia i powrotu do stanu podstawowego - czas przebycia przez światło odległości 3m - pomiary czasowych charakterystyk fluorescencji wymagają użycia wyrafinowanej aparatury optycznej i elektronicznej

Fluorescencja jest charakterystyczna dla molekuł aromatycznych. Kilka typowych przykładów molekuł substancji fluoryzujących (fluoroforów) pokazano na rysunku 2.

• chinina - stosowana m.in. w toniku. Przy obserwacji szklanki toniku wystawionego na światło słoneczne obserwuje się pod kątem prostym do wzbudzenia niebieskie, powierzchniowe świecenie roztworu. Podczas przejścia do stanu podstawowego zostaje wyemitowane światło w zakresie 450 nm.

To świecenie staje się bardziej zauważalne po dodaniu do toniku mniej polarnego (o mniejszej stałej dielektrycznej) rozpuszczalnika, jakim jest alkohol. Zależność intensywności fluorescencji chininy od polarności rozpuszczalnika jest przykładem tego, jak w sposób nieinwazyjny można badać wpływ otoczenia, środowiska. Pierwsze badania fluorescencji roztworu chininy były przeprowadzone i opublikowane przez Herschela w roku 1845. Na podstawie posiadanej wówczas wiedzy nie można było wytłumaczyć zjawiska fluorescencji chininy.

Chinina była stymulatorem budowy pierwszego spektrofluorometru, w roku 1950. Podczas drugiej wojny światowej Departament Obrony USA był zainteresowany badaniami leków przeciw malarii, w tym chininy. Stąd wynikła potrzeba budowy i praktycznego zastosowania pierwszego spektrofluorometru.

• fluoresceina i rodamina - płyny chłodnicze; fluoresceina - została wykorzystana w roku 1877 do pokazania, że Dunaj i Ren są połączone podziemnymi strumieniami. Do Dunaju wlano fluoresceinę by po 60 godzinach stwierdzić jej obecność w małej rzece dopływającej do Renu (duża czułość fluorescencji na detekcję). Dzisiaj fluoresceina używana jest do lokalizacji na morzach, na przykład podczas lądowania kapsuł kosmicznych na Atlantyku.

• antracen i perylen - służą do monitorowania środowiska (plam rozlanego oleju)

• POPOP - używany w licznikach scyntylacyjnych

• akrydyna - w badaniach DNA

• kumaryna (umbeliferon) - w badaniach enzymatycznych

Fluorescencyjne charakterystyki spektralne są przedstawiane w postaci widm emisji. Widmo fluorescencji jest wykresem natężenia fluorescencji w zależności od długości fali (w nanometrach) lub w zależności od liczby falowej (w cm ^{- 1}).

Dwa typowe widma fluorescencji pokazane są na rysunku 3. Widma emisji zmieniają się w szerokim zakresie w zależności od budowy chemicznej fluoroforu i od rozpuszczalnika, w którym znajduje się on. Widma pewnych cząsteczek, takich np. jak perylen, mają strukturę oscylacyjną, związaną z poziomami oscylacyjnymi stanów elektronowych, wzbudzonego i podstawowego. Inne cząstki, takie jak chinina, nie posiadają tej struktury oscylacyjnej.

Zjawisko fluorescencji charakteryzuje się szeregiem ogólnych własności, z wyjątkiem kilku dobrze znanych przypadków. Przypadki takie rozważa się oddzielnie.

• przesunięcie Stokesa - patrząc na schemat Jabłońskiego zauważamy, że energia emisji jest mniejsza niż absorpcji. Dlatego widmo fluorescencji jest przesunięte względem widma absorpcji w stronę długofalową. Zjawisko to pierwszy zaobserwował Stokes w roku 1852 . Te pierwsze obserwacje były wykonane z pomocą bardzo prostej metody zobrazowanej na rys. 4. Żródłem światła UV było Słońce. Poprzez filtr przepuszczający światło o długości fali mniejszej niż 400 nm wzbudzano roztwór chininy (por. rys. 3). Detektorem było oko. Aby zapobiec dostawaniu się do oka światła ultrafioletowego wykorzystywano żółty filtr przepuszczający światło o długości fali większej niż 400 nm. Jako tego filtru używano lampki wina. Ponieważ chinina ma maksimum emisji w pobliżu 450 nm, więc jej fluorescencja była łatwo obserwowalna.

Przesunięcie Stokesa jest najsilniejsze dla polarnych fluoroforów w polarnych rozpuszczalnikach i wynika ono z oddziaływania fluoroforu z rozpuszczalnikiem.

Grupa indolowa tryptofanu w proteinach jest jednym z takich czułych wskaźników fluorescencyjnych - widmo emisji indolu umożliwia wnioskowanie na temat lokalizacji tryptofanu w proteinach. Emisja jest bardziej lub mniej długofalowa zależnie od miejsca podstawienia.

Z powodu czułości widm emisji na rodzaj otoczenia, widma emisji zewnętrznych fluoroforów są często wykorzystywane do lokalizacji sondy znajdującej się na makromolekule. Na przykład, jedną z często używanych w tym celu sond jest TNS czyli 6-(p-toluidinyl)naphthalene-2-sulfonic acid, rys. 5. Ma ona dodatkowe własności, słabo fluoryzuje w wodzie.

Słaba fluorescencja w wodzie i silna po związaniu z biomolekułą jest typową własnością stosowanych sond, w tym także bromku etylu używanego w przypadku DNA. Proteiny mają grupy hydrofobowe. Te grupy hydrofobowe mogą wiązać także inne niepolarne molekuły. Po dodaniu do roztworu TNS następuje silny wzrost natężenia fluorescencji a także przesunięcie widma emisji w stronę krótkofalową.

• inną ogólną własnością fluorescencji jest niezależność widma emisji od długości fali światła wzbudzającego, w paśmie absorpcji - widmo emisji nie zależy od długości fali światła wzbudzającego - własność ta znana jest pod nazwą reguły Kashy. Jednak już Wawiłow pisał w 1926 roku o niezależności wydajności kwantowej od długości fali światła wzbudzającego. Przy wzbudzeniu do wyższych stanów elektronowo-oscylacyjnych, nadwyżka energii ulega szybkiemu rozproszeniu. Luminofor przechodzi do najniższego poziomu oscylacyjnego stanu S₁ .

Relaksacja ta zachodzi w czasie 10^-12s i jest uwarunkowana silnym przekrywaniem się funkcji falowych blisko położonych poziomów. Wskutek tej szybkiej relaksacji, widma emisji są zazwyczaj niezależne od długości fali światła wzbudzającego.

Z wyjątkową sytuacją mamy do czynienia wtedy, gdy molekuła barwnika może istnieć w dwóch formach jonowych, z których każda charakteryzuje się własnymi widmami absorpcji i emisji. Także pewne molekuły mogą wykazywać się emisją bezpośrednio ze stanu S₂, jednak jest to przypadek rzadki i nie obserwowany w molekułach biologicznych.

• reguła zwierciadlanej symetrii - rys. 3. W przypadku chininy bardziej krótkofalowy pik odpowiada absorpcji do stanu S₂, po czym następuje szybka relaksacja do stanu S₁. Dlatego emisja zachodzi tylko z niższego stanu energetycznego (S₁). Widmo emisji chininy jest zwierciadlanym obrazem widma absorpcji S₀ → S₁.

Nie jest natomiast zwierciadlanym względem absorpcji całkowitej, do obu wyższych stanów singletowych, pierwszego i drugiego. Reguła ta jest prawdziwa dla większości fluoroforów: emsja jest zwierciadlanym odbiciem absorpcji tylko przy przejściu ze stanu podstawowego do pierwszego wzbudzonego, nie zaś względem widma absorpcji całkowitej.

Ogólnie, ta symetria jest wynikiem tego, że te same przejścia są zaangażowane w powstawanie widm absorpcji i emisji, a więc wchodzą w grę te same rozkłady poziomów wibracyjnych (elektronowo-oscylacyjnych) stanów podstawowego S₀ i pierwszego wzbudzonego S₁. W wielu molekułach te rozkłady niewiele różnią się pomiędzy stanami S₀ i S₁. Zgodnie z zasadą Francka-Condona wszystkie przejścia elektronowe są pionowe, to znaczy zachodzą bez zmiany konfiguracji jąder. W wyniku tego, jeśli wybrane przejście elektronowo-oscylacyjne ma duże prawdopodobieństwo przejścia w absorpcji (duża wartość czynnika Francka-Condona), to odpowiada mu również odpowiednio silne przejście odwrotne, związane z emisją, między tymi samymi stanami. Zostało to zobrazowane na rys. 6.

Wyjątki od reguły symetrii zwierciadlanej - p-terphenyl - rys. 7 - widmo absorpcji jest pozbawione struktury, jednak widmo emisji wykazuje strukturę oscylacyjną. Takie odchylenie od symetrii zwierciadlanej wskazuje na różny rozkład jąder w stanach podstawowym i wzbudzonym. Zmiana konfiguracji jąder może nastąpić przed emisją, jeśli czas życia stanu wzbudzonego S₁ jest dostatecznie długi względem natychmiastowej absorpcji tak, by mógł ustalić się nowy rozkład jąder w stanie wzbudzonym.

W przypadku p-terphenylu wydaje się, że oznacza to, iż pierścienie stają się bardziej współpłaszczyznowe w stanie wzbudzonym. W wyniku tego widmo emisji jest bardziej strukturowane niż widmo absorpcji.

W dodatku do odstępstwa od symetrii zwierciadlanej związek p-terphenylu jest wyjątkowy także dlatego, że jego widmo emisji ma strukturę oscylacyjną, a widmo absorpcji jej nie wykazuje. Natomiast ogólnie zachodzi odwrotna zależność, tzn. obserwuje się strukturę widma absorpcji i brak tej struktury w widmie emisji.

Inną od zmiany konfiguracji jąder przyczyną braku symetrii zwierciadlanej mogą być reakcje zachodzące poprzez stan wzbudzony. Jeden z przykładów pokazany jest na rys. 8, gdzie mamy widmo emisji antracenu w obecności dwuetyloaniliny.

Strukturowana emisja przy krótszych falach jest odbiciem zwierciadlanym widma absorpcji antracenu. Niestrukturowana emisja przy dłuższych falach wiąże się z powstaniem kompleksu związanego z przeniesieniem ładunku (charge-transfer), który powstaje między wzbudzonym antracenem i dwuetyloaniliną. W tym więc przypadku brak struktury w widmie emisji, przy długofalowej jego części, jest zjawiskiem złożonym.

• czas życia i wydajność kwantowa fluorescencji - są być może najważniejszymi właściwościami fluoroforów.

Wydajność kwantowa jest to stosunek liczby emitowanych fotonów do liczby zaabsorbowanych fotonów. Substancje o dużej wydajności kwantowej, bliskiej jedności, jak np. rodamina, wykazują silną emisję.

Wydajność kwantowa zdefiniowana jest następująco :

, gdzie

Γ jest stałą szybkości emisji fluoroforu

k_nr - stałą szybkości zaniku bezpromienistego do stanu S₀

Wydajność kwantowa może być bliska jedności jeśli stała szybkości zaniku bezpromienistego jest dużo mniejsza od stałej szybkości zaniku promienistego

Czas życia jest także istotny ponieważ determinuje on dostępny czas oddziaływania molekuły fluoroforu z otoczeniem i stąd dostępną informację zawartą w emisji. Czas życia określony jest następująco :

Czas życia fluoroforu w nieobecności procesów bezpromienistych nazywany jest promienistym lub naturalnym czasem życia. Jest on określony zależnością:

Wydajność kwantowa i czas życia mogą być modyfikowane przez czynniki, które wpływają na wartości stałych szybkości Γ lub k_nr . Na przykład, molekuła może nie fluoryzować z powodu szybkiej wewnętrznej konwersji lub małej stałej szybkości emisji.

Wygaszanie fluorescencji - natężenie fluorescencji może być zmniejszane poprzez różne procesy. Takie zmniejszanie natężenia nazywa się wygaszaniem. Wygaszanie powodowane jest różnymi mechanizmami. Wygaszanie zderzeniowe zachodzi gdy wzbudzony stan fluoroforu jest dezaktywowany wskutek kontaktu z inną molekułą fluoroforu, którą nazywa się wygaszaczem

• wygaszanie zderzeniowe

• wygaszanie spotkaniowe - przykładami mogą być tlen, halogenki, aminy i molekuły pozbawione elektronu takie jak akrylamidy. Mechanizm wygaszania zależy od rodzaju par molekuł, które spotykają się. Na przykład, wygaszanie indolu przez akrylamidy jest prawdopodobnie spowodowane przeniesieniem elektronu z indolu do akrylamidu, co nie zachodzi w stanie podstawowym

• wygaszanie statyczne - fluorofory mogą tworzyć kompleksy niefluoryzujące z gasicielami. Procesy takie nazywane są wygaszaniem statycznym ponieważ zachodzą w stanie podstawowym i nie wymagają aktywacji poprzez dyfuzję lub proces spotkaniowy (zderzeniowy).

Wygaszanie może być powodowane także wskutek innych trywialnych, tzn. niemolekularnych mechanizmów, takich jak osłabienie padającego światła przez same fluorofory (zamianę na ciepło) lub inne obiekty.

Wiele małych molekuł lub jonów może wygaszać fluorescencję (być gasicielami). Substancje te zawierają jod (I^-), tlen i acrylamid. Ta własność fluoroforów może być wykorzystana do lokalizacji sond na makromolekułach lub do określenia porowatości protein i membran względem molekuł gaszących.

Idea ta została zilustrowana na rys. 9, który pokazuje jak zachowują się widma emisji sond fluoryzujących związanych z proteinami lub błonami pod wpływem wodnych roztworów jodu. Jak widać, po prawej stronie rysunku, natężenie emisji tryptofanu na powierzchni proteiny (W₁) , lub na powierzchni błony (P₂) maleje w obecności wodnego roztworu gasiciela. Natomiast natężenie tryptofanu wbudowanego w proteinę lub membranę zmienia się mniej, lewa strona rysunku. Albo można działać wygaszaczami, takimi jak bromki, celem badania brzegów membran poprzez pomiary intensywności wygaszania.

Fluorofory stosowane w biochemii

Fluorofory dzielą się na dwie główne klasy, wewnętrzne (właściwe) i zewnętrzne (niewłaściwe). Fluorofory właściwe to takie, które występują w stanie naturalnym (np. w proteinach - grupa indolowa tryptofanu, NADH, FAD, FMN). Fluorofory zewnętrzne to takie, które dodawane są do próbki nie wykazującej odpowiednich własności spektralnych (np. DPH dodawany do błon - błony same nie wykazują fluorescencji - DPH spontanicznie łączą się z niepolarnymi obszarami błon - z powodu słabej rozpuszczalności DPH w wodzie i wygaszania fluorescencji DPH przez wodę, emisja jest obserwowana tylko z miejsc, w których DPH jest związane z błoną; np. akrydyna, bromek etylu i inne planarne kationy wiążąc się z DNA służą do wizualizacji oraz identyfikacji chromosomów; DNS-Cl - chlorek dansylu, FITC - izocyjanina fluoresceiny).

Indykatory fluorescencyjne - fluorofory których własności widmowe dobierane są w zależności od badanych substancji, np. PBFI. Fluorofor ten ma centralną grupę 4 NH ₄⁺, która wiąże K⁺. Pod wpływem tego kationu natężenie emisji PBFI rośnie, umożliwia to detekcję tego kationu.

Indykatory fluorescencyjne są obecnie wykorzystywane do wskazywania obecności wielu substancji włączając w to jony Ca ²⁺ , Mg ²⁺ , Na ²⁺ , Cl ^- a także O₂ oraz do wskaźnikowania pH.

Sensory fluorescencyjne - Ponadto, obok zastosowań fluorescencji w biochemii i biofizyce, wzrasta liczba zastosowań w analitycznej i klinicznej chemii. Użycie fluorescencji w klinicznej diagnostyce zastępuje stosowanie źródeł radioaktywnych. Użycie metod optycznych eliminuje niebezpieczeństwa związane z zastosowaniem radioaktywności.

Fluorescencja stosowana jest na szereg sposobów w badaniach biomedycznych. Obrazowanie fluorescencyjne żeli stosowane jest do detekcji fragmentów DNA, metoda ta charakteryzuje się dużą czułością i może często zastępować używanie ³²P i autoradiografię. Sekwencjonowanie DNA i realizacja projektu zmierzającego do zbadania genomu ludzkiego odbywają się praktycznie przy zastosowaniu znaczników fluorescencyjnych, zamiast radioaktywnych źródeł.

Innym polem aktywności badawczej , przy zastosowaniu fluorescencji, jest chemia kliniczna. Stosowany w tym przypadku indykator, PBFI , pokazany jest na rys. 10, znany jest on wielu analitykom badającym poziom potasu we krwi.

Znaczniki fluorescencyjne stosowane są w immunologii chemicznej do pomiaru mas cząsteczkowych, małych molekuł stosowanych w pigułkach i dużych makromolekuł antyciał. Znana jest metoda fluorescencyjna oznaczania poziomu cukru w krwi. Liczne formy tego typu zastosowań zostały zobrazowane schematycznie na rys. 11. Obiektem badawczym, próbką, może być ogólnie biorąc krew. Sensor fluorescencyjny może być wprowadzany do próbki z pomocą kapilary. Poziom sensora jest odczytywany z pomocą niekosztownego instrumentu fluorescencyjnego, w którym stosować można diodę świetlną lub wskaźnik laserowy jako źródło światła. Można oczekiwać, że w następnym dziesięcioleciu będą stosowane powszechnie przez lekarzy punktowe wskaźniki fluorescencyjne, a także znajdą się one w powszechnym, domowym, użytku.

Fluorofory naturalne

Naturalne proteiny fluoryzujące wywodzą się z aromatycznych kwasów aminowych, tryptofanu (TRP), tyrozyny (TYR) i fenyloalaniny (PHE), rys. 12.

Indolowe grupy reszt tryprofanowych są dominującym źródłem absorbcji promieniowania UV i emisji w proteinach. Tyrozyna posiada wydajność kwantową podobną do tryptofanu, jednak jej emisja ma węższy rozkład widmowy. Sprawia to wrażenie, że posiada większą wydajność kwantową. W natywnych proteinach emisja tyrozyny jest często wygaszana, być może wskutek wzajemnego oddziaływania z łańcuchem peptydowym albo wskutek bezpromienistego przenoszenia energii do tryptofanu. Denaturacja protein często powoduje wzrost emisji tyrozyny. Jak w przypadku fenolu, pK_a tyrozyny maleje gwałtownie po wzbudzeniu, wskutek możliwości jej jonizacji w stanie wzbudzonym. Emisja fenyloalaniny jest obserwowana jedynie wtedy, gdy próbka proteinowa nie zawiera tyrozyny i tryptofanu, co jednak rzadko zdarza się.

Emisja tryptofanu jest bardziej wrażliwa na lokalne otoczenie, tryptofan jest więc częściej stosowany celem dostarczania informacji o konformacyjnych zmianach protein. Powodem przesunięć widmowych może być szereg zjawisk, jak np. tworzenie się wiązań typu ligandów i asocjacji typu proteina-proteina. W dodatku położenie maksimów emisji protein jest odzwierciedleniem „przeciętnej ekpozycji” reszt tryptofanowych na fazę wodną. Fluorescencyjne czasy życia reszt tryptofanowych są przyjmują wartości od 1 do 6 nanosekund. Fluorescencja tryptofanu jest wygaszana przez jod, akrylamid i blisko leżące grupy dwusiarczkowe. Możliwe jest także, że reszty tryptofanowe mogą być wygaszane przez elektroujemne grupy, takie jak -NH₃⁺ , -CO₂H oraz protonowane reszty histydynowe. Obecność wielu podstawników tryptofanowych w proteinach, każdy w innym otoczeniu, powoduje że zanik natężenia fluorescencji jest wielowykładniczy.

• Fluorescencyjne kofaktory enzymatyczne

Kofaktory enzymatyczne często fluoryzują, przykładem może być NADH (rys. 12). Jego widma absorpcji i emisji, z maksimami 340 nm i 460 nm, pokazane są na rysunku 13.

Fluoryzująca grupa NADH jest zredukowanym pierścieniem nikotynoamidowym. W roztworze jego fluorescencja jest częściowo wygaszana przez zderzenia lub przez bezpośredni kontakt z adeniną. Wiązanie się NADH z proteinami powoduje, że wydajność kwantowa NADH rośnie prawie czterokrotnie, także czas życia wzrasta od 0,4 ns do około 1,2 ns. Jednakże, w zależności od rodzaju proteiny, wydajność fluorescencji NADH może rosnąć lub maleć (wskutek wiązania się z proteiną). Wzrost wydajności kwantowej może następować wskutek wiązania się NADH w formie wydłużonej, co zapobiega bezpośredniemu kontaktowi pomiędzy adeniną a zredukowaną fluorescencyjną grupą nikotynoamidową.

Kofaktor pyridoksalu również fluoryzuje. Jego widma absorpcyjne i emisyjne są zależne od jego struktury chemicznej w proteinach, gdzie grupy pyridoksalu są często sprzężone z resztami lizynowymi poprzez grupy aldehydowe. Widmo emisji pyridoksaminy jest bardziej krótkofalowe niż fosforanu pyrodiksalu (Rys. 13). Widmo emisji pyridoksaminy zależy od pH (nie pokazane), a emisyjne widmo grup pyridoksalowych zależy od ich oddziaływania z proteinami. Kiedy wiąże się z fosforylazą, maksimum emisji przemieszcza się do 535 nm. Powodem tego jest, być może, formowanie się zasady Schiffa z enzymem.

Ryboflawina, FMN i FAD absorbują światło w zakresie widzialnym (około 450 nm) i emitują powyżej 525 nm (Rys. 13). Typowe czasy życia FMN i FAD są równe 4,7 ns i 2,3 ns. Tak jak w przypadku NADH, fluorescencja flawiny jest wygaszana przez adeninę. To wygaszanie (statyczne) spowodowane jest tworzeniem się kompleksu flawiny z adeniną. W przeciwieństwie do NADH, który silnie fluoryzuje po związaniu się z proteiną, flawoproteiny nie fluoryzują, z pewnymi wyjątkami. Zanik natężenia fluorescencji wiązań proteinowo-flawinowych jest zazwyczaj złożony, dwuwykładniczy. Czasy zaniku składowych mają wartości równe 0,1 ns i 5 ns.

Nukleotydy i kwasy nukleinowe, ogólnie biorąc, nie fluoryzują. Jednak pewne wyjątki istnieją, na przykład tRNA^PE drożdży zawiera silnie fluoryzującą zasadę znaną pod nazwą zasady-Y_t , która ma maksimum emisyjne w pobliżu 470 nm i czas życia około 6 ns. Molekuły opisane powyżej reprezentują główne fluorofory występujące w tkankach zwierzęcych.

Większość naturalnych próbek fluoryzujących z komórek i tkanek zawiera NADH i flawiny. Fluorescencja innych jednostek naturalnych nie została jeszcze dostatecznie zidentyfikowana. Najlepiej znaną fluorescencją z tkanek jest fluorescencja protein kolagenu i elastyny. Przy wzbudzeniu powyżej 340 nm, proteiny te fluoryzują w zakresie około 405 nm, rysunek 13.

• sondy fluorescencyjne - znamy wiele przykładów gdy badana molekuła nie fluoryzuje albo jej widma „nie pasują” do planowanego doświadczenia. Na przykład DNA i lipidy nie fluoryzują. W tym wypadku wygodnie jest badać fluorescencję sond związanych z badanymi molekułami. W wypadku protein często jest wskazane znacznikowanie ich przez chromofory, które mają bardziej długofalowe pasma absorpcji i emisji niż aromatyczne kwasy aminowe. Wtedy tak oznakowana proteina może być badana w obecności innych, nieoznakowanych protein. Liczba znanych fluoroforów wzrosła gwałtownie w ciągu ostatniej dekady.

Sondy reagujące z proteinami - liczne fluorofory tworzą wiązania kowalencyjne i niekowalencyjne z proteinami. Kowalencyjne wiązania sond tworzone są z pomocą różnych reaktywnych grup, które wiążą się z proteinami poprzez wiązanie się z aminami, wodorosiarczkami albo z łańcuchami histydyny. Niektóre z częściej stosowanych sond pokazano na rysunku 14.

Chlorek dansylu (DNS-Cl) został pierwotnie opisany przez Webera. Ta praca zapoczątkowała badania z użyciem sond fluorescencyjnych, szczególnie w zastosowaniach polaryzacyjnej spektroskopii w biochemii. Szerokie zastosowania dansylu są wynikiem jego wcześniejszej prezentacji oraz tego, że jego czas życia jest równy 10 ns. Grupy dansylowe mogą być wzbudzane w zakresie 350 nm, tam gdzie nie absorbują proteiny. Ponieważ grupy dansylowe absorbują w pobliżu 350 nm, więc mogą one służyć jako akceptory fluorescencji protein. Widmo emisji dansylu jest również bardzo wrażliwe na polarność rozpuszczalnika, maksima emisji występują zazwyczaj w pobliżu 520 nm.

Fluoresceina i rodamina są również stosowane jako sondy. Barwniki te mają długofalowe maksima absorbcyjne w pobliżu 480 i 560 nm. W odróżnieniu od dansylu rodamina i fluoresceina nie są wrażliwe na polarność rozpuszczalnika. Dalszym powodem ich zastosowań jest ich duży molowy współczynnik ekstynkcji, równy 8*10⁴ M^-1 cm^-1

Prostym zastosowaniem fluoresceiny i rodaminy jest znakowanie przeciwciał. Szeroka gama opartych na fluoresceinie i rodaminie znaczników immunoglobulin znajduje się w sprzedaży. Proteiny te są często używane w mikroskopii fluorescencyjnej i badaniach immunologicznych. Powodem stosowania tych sond jest ich duża wydajnośc kwantowa oraz długofalowe widma absorpcji i emisji. Minimalizuje to problemy zwiazane z tłem promieniowania, które pojawiaja się w badaniach biologicznych. Nie trzeba także stosować optyki kwarcowej. Czasy życia tych barwników są rzędu 4 ns, a ich widma emisyjne nie są znacząco wrażliwe na polarność rozpuszczalnika.

Rola przesunięcia stokesowskiego w znakowaniu protein - jednym z problemów zwiazanych z zastosowaniem fluoresceiny jest jej tendencja do samowygaszania. Wiadomo, że jasność znakowanych fluoresceiną protein nie rośnie proporcjonalnie do ilości znacznika. W rzeczywistości intensywność ta może maleć wraz ze wzrostem stężenia fluoresceiny.

Fluoresceina ma małe przesunięcie stokesowskie. Jeśli więcej niż jedna molekuła fluoresceiny jest związana z proteiną to może nastąpić przeniesienie energii wzbudzenia pomiędzy tymi molekułami. Jeśli dwie molekuły fluoresceiny związane z tą samą proteiną znajdują się w odległości około 40 Å, jedna od drugiej, to może nastąpić bezpromieniste przeniesienie energii wzbudzenia z prawdopodobieństwem 50%. Wielokrotne grupy fluoresceinowe związane z proteiną powodują wysokie lokalne zagęszczenie fluoresceiny.

Wynika stąd wniosek, że przede wszystkim barwniki, które charakteryzują się dużym przesunięciem stokesowskim są dobrym materiałem na sondy fluorescencyjne. Należy do nich chlorek dansylu. Jego wadą jest duża hydrofobowość, co powoduje agregację protein. Nowsze barwniki są obecnie syntetyzowane. Mają one duże przesunięcia stokesowskie i charakteryzują się dobrą rozpuszczalnością w wodzie. Jednym z takich barwników jest żółć kaskadowa.

Maksima emisyjne niektórych pochodnych rodaminy mogą być z zakresu od 518 do 621 nm. W kilku ostatnich latach została wprowadzona nowa klasa barwników w zastępstwie do omawianych pochodnych rodaminy i fluoresceiny, pod nazwą handlową BODIPY. Bazą tych barwników jest rzadki fluorofor zawierających bor.

Sondy wrażliwe na rozpuszczalnik - w odróżnieniu od fluoresceiny, rodaminy i barwników BODIPY, istnieją fluorofory, które wykazują wysoką wrażliwość na polarność lokalnego środowiska zewnętrznego. Jednym z przykładów jest Prodan, który jest również dostępny pod nazwą Acrylodan (rysunek 14). W stanie wzbudzonym Prodanu następuje przeniesienie ładunku z grupy aminowej do karboksylowej. Po związaniu się z membraną Prodan i jego pochodne wykazują duże przesunięcia widmowe w punkcie temperaturowego przejścia fazowego membrany.

Sondy niekowalencyjnie związane z proteinami - wiele barwników, używanych do znakowania protein tworzy z nimi wiązania niekowalencyjne. Są to typowe kwaśne siarczki naftyloaminy, z których najbardziej znanymi przykładami są

ANS (1-anilinonaftalene-8-sulfonic acid) i

TNS (6-(p-toluidynyl)naftalene-2-sulfonic acid).

Barwniki te często słabo fluoryzują albo w ogóle nie fluoryzują w wodzie. Silnie fluoryzują po połączeniu się z proteinami (apomyoglobin) lub z membranami. Weber i współpracownicy przebadali ich wiązanie z albuminami serum wołowego (BSA). Na rysunku 15 pokazano widma emisji BSA, wzbudzanego falą o długości 289 nm, w zależności od stężenia ANS (miareczkowanie). W nieobecności BSA emisja ANS jest znikoma (nie pokazano widma fluorescencji dla tego przypadku)

- numerki przedstawiają średnią liczbę molekuł ANS przyłączonych do BSA

Warto zauważyć, że emisja Tryptofanu z BSA jest wygaszana przy dodaniu ANS. Emisja ANS wzrasta wraz z maleniem emisji BSA, co widzimy na rysunku 15. Nie istnieje zauważalna emisja samego ANS, maksimum emisyjne dla około 500 nm, w wodzie, nie pojawia się. Barwniki typu ANS mają tę własność, że niepolarna ich część łączy się z niepolarną częścią makromolekuły. Ponieważ wodna faza barwnika nie wnosi przyczynku do sygnału fluorescencji, więc obserwowany sygnał powstaje z interesującego nas obszaru, czyli miejsca przyczepienia sondy do makromolekuły.

O wrażliwości ANS na polarne otoczenie przekonano się badając czasy życia ANS przy stopniowym zwiększaniu stężenia barwnika ANS w obecności BSA. BSA było stopniowo wysycane coraz to większą liczbą wiązań z molekułami ANS.

Największe wzmocnienie sygnału fluorescencji i najdłuższe czasy zaniku zostały stwierdzone dla pierwszych dwóch związanych molekuł ANS. Im więcej ANS było wiązanych, tym bardziej malał czas zaniku. Wyniki te tłumaczono wpływem rozpuszczalnika na ANS. Ogólnie mówiąc, związek ten przebadano szczegółowo mierząc widma i czasy życia dla wiązań z różnymi proteinami.

Sondy w membranach - znakowanie membran polega często na prostym przeniesieniu nierozpuszczalnego w wodzie materiału sondy fluorescencyjnej do niepolarnej fazy membran. DPH jest jednym z najczęściej stosowanych w tym celu związków. Dodanie DPH do zawiesiny membranowej powoduje kompletne jego związanie, bez znaczącej emisji z fazy wodnej. Całkowita emisja DPH pochodzi wtedy z membrany. W ciągu ostatnich kilku lat zadanie znakowania membran stało się łatwiejsze wskutek dostępności szerokiej gamy sond lipidowych.

Sondy lipidowe mogą być dołączane do łańcuchów kwasów tłuszczowych lub do fosfolipidów. Głębokość na jakiej sonda może przenikać do dwuwarstwy może być regulowana, poprzez dobór różnych łańcuchów.

Membrany mogą być również znakowane przez bardziej rozpuszczalne w wodzie związki takie jak fluoresceina czy rodamina. W takich przypadkach sondy mogą być dołączane w membranie do długich łańcuchów acylowych lub do fosfolipidów.

Mamy również sondy wrażliwe na różnicę potencjałów elektrycznych występujących w membranach. Można podać kilka mechanizmów odpowiedzialnych za generację pola elektrycznego w membranach, takich na przykład jak przechodzenie barwnika z wody do membrany, reorientacja barwników w membranie i agregacja barwnika w membranie. Barwniki karbocjaninowe (carbocyanine dyes) reagują typowo na segregację względem faz, wodnej i membrany, oraz na agregację w membranach. Natomiast barwniki styrylowe wydają się reagować bezpośrednio na pole elektryczne. Barwniki merocjaninowe (merocyanine dyes) są prawdopodobnie odpowiedzialne za oba mechanizmy wytwarzania potencjału.

Sondy DNA - emisja samego DNA jest bardzo słaba i leży daleko w ultrafiolecie, dlatego nie nadaje się do praktycznych badań. Na szczęście istnieje wiele barwników łączących się spontanicznie z DNA i silnie fluoryzujących. Kilka reprezentatywnych sond DNA pokazano na rysunku 16.

Jednym z najczęściej używanych barwników jest bromek etydyny (EB-ethidium bromide). EB słabo fluoryzuje w wodzie, jego intensywność wzraska około 30-krotnie po przyłączeniu do DNA. Czas życia EB wynosi około 1.7 ns w wodzie i wzrasta do około 20 ns po przyłączeniu do podwójnej helisy DNA. Wiązanie powstaje poprzez interkalację (wbudowanie się, wciśnięcie) pierścienia aromatycznego barwnika między dwie zasady podwójnej helisy DNA. Wiele sond DNA, na przykład oranż akrydynowy, łączą się również przez interkalację. Inne typy sond wiążą się z „gwintem” helikalnej „śruby” DNA, jak na przykład DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindole) i Hoechst 33342. Fluorescencja DAPI wydaje się być najsilniejsza gdy molekuła ta związana jest z DNA w pobliżu adeniny i tyminy (AT). Hoechst 33358 wiąże się nieco inaczej (specyficznie) z pewnymi parami zasad sekwencji DNA.

W ostatnich latach syntetyzuje się barwniki mające duże powinowactwo do DNA. Przykładem może być etydyna tworząca sondy w postaci dimerów (ethidium homodimer), a także TOTO z dodatnim ładunkiem. Barwniki te pozostają związane z DNA nawet podczas elektroforezy żelowej i dzięki temu umożliwiają detekcję DNA z dużą dokładnością.

Analogi zasadowe DNA - Natywne zasady DNA nie fluoryzują dostatecznie dobrze, dlatego zastępuje się je analogami fluorescyncyjnymi takimi jak zasada 2-AP (2-Aminopurine), która jest analogiem adeniny, a także IXP (isoxanthopterin) jako analog guaniny, rysunek 17.

W roztworze 2-AP ma wysoką wydajność kwantową i czas zaniku równy 10 ns. Po wbudowaniu go w helisę DNA, jego fluorescencja jest częściowo wygaszana i jego zanik staje się złożony. Wrażliwość 2-AP na otoczenie czyni tę sondę użyteczną do badań konformacji i dynamiki DNA w roztworze.

Podobnie jak 2-AP, związek IXP jest częściowo wygaszany po związaniu z DNA, jednak fluoryzuje silniej. Zależność wydajności fluorescencji IXP od struktury DNA jest wykorzystywana w immunologii, w walce z wirusem HIV. Chodzi o to, że DNA wirusa HIV wbudowuje się w genom zaatakowanej komórki gospodarza. Badania bazują na analizie oligonukleotydu DNA, który ma specyficzną sekwencję, podobną do wirusa HIV, co przedstawiono na rysunku 18.

Mechanizm enzymatyczny rozszczepia dwunukleotyd z końca -3' DNA wirusa i łączy go z końcem -5' DNA gospodarza. Nukleotyd IXP zostaje umiejscowiony w pobliżu końca -3' syntetycznego substratu. W wyniku tego połączenia wzrasta wydajność kwantowa fluorescencji IXP, co umożliwia detekcję tego promieniowania i identyfikację wirusa HIV.

Zakończenie

Wiele różnych molekuł fluoryzuje, liczne oddziaływania i procesy mogą wpływać na własności widmowe molekuł. Fluorofory mogą wiązać się kowalencyjnie z makromolekułami lub mogą oddziaływać z wybranymi jonami. Emisja może zachodzić w szerokim paśmie, od ultrafioletu (UV) do bliskiej podczerwieni (NIR). Dostępne są sondy (znaczniki) z czasami życia krótkimi, rzędu nanosekund i długimi, rzędu mikro- lub milisekund. Technologia chemiczna dostarcza nam coraz to nowych molekuł fluoryzujących tak, że można przeprowadzać doświadczenia, które kiedyś były niemożliwe. W wyniku tego metody fluorescencyjne są znowu aktywnie stosowane, nie tylko w biofizyce lecz również w obrazowaniu komórkowym, sekwencjonowaniu DNA, cytometrii przepływowej i w diagnostyce klinicznej.

W ciągu ostatnich 20 lat znacznie zwiększyło się zastosowanie fluorescencji w biologii. Od paru lat spektroskopia fluorescencyjna i zmiany fluorescencji w czasie są podstawowym narzędziem badawczym w biochemii i w biofizyce. Sytuacja ta zmieniła się tak, że fluorescencja jest obecnie stosowana do monitorowania środowiska (analityka żywności, przemysłowa - szczególnie biotechnologiczna), w chemii klinicznej, do sekwencjonowania (ustalenie kolejności) DNA i w analizie genetycznej. Dodatkowo fluorescencja ma zastosowanie w identyfikacji komórkowej i służy do ich sortowania, a także do lokalizacji i obserwacji przepływów międzykomórkowych przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Wskutek czułości detekcyjnych metod fluorescencyjnych i wskutek trudności ze stosowaniem substancji radioaktywnych obecnie wiele testów medycznych opartych jest na zjawisku fluorescencji. Testy te oparte są na znacznikowaniu fluorescencyjnym ( ELISA ). DAKTYLOSKOPIA :-)

Spektroskopia fluorescencyjna ma zaletę czułości, prostoty i obfitości szczegółów, jeśli chodzi o informacje na temat molekuł i ich oddziaływań. Pomiary fluorescencyjne charakteryzują się wysoką czułością ponieważ optyczne obserwacje są kontrastowe, co można obrazowo porównać do widoku gwiazd w nocy na ciemnym tle, w odróżnieniu od takiejże obserwacji świtem lub w ciągu dnia.

12

---