Wykładowca: mgr A. Szczepanek

Biochemia - ćwiczenia 21.01.2011
(piątek)

Opracowane na podstawie podręcznika Hames'a i Hooper'a - Biochemia, krótkie wykłady; notatek z wykładów; oraz źródeł Internetowych.

Enzymy

Enzymy są katalizatorami, które zwiększają szybkość reakcji chemicznej, same nie ulegając zmianie. W nieobecności enzymu reakcja może zachodzić niezwykle wolno, natomiast w jego obecności szybkość reakcji znacznie wzrasta, nawet do 10⁷ razy. Reakcje katalizowane przez enzymy zazwyczaj przebiegają we względnie łagodnych warunkach (temperatura poniżej 100^oC, ciśnienie atmosferyczne i obojętne pH) - w porównaniu z warunkami odpowiednich niekatalizowanych reakcji chemicznych. Enzymy są wysoce specyficzne względem substratów, na które działają, i produktów, które tworzą. Poza tym aktywność enzymatyczna może być regulowana, zmieniając się w zależności od stężenia substratów lub innych cząsteczek. Prawie wszystkie enzymy są białkami, chociaż zidentyfikowano też kilka rodzajów cząsteczek RNA aktywnych katalitycznie.

Podział enzymów

- katalizatory biologiczne

- enzymy jako białko proste (enzymy proteolityczne, amylaza, ureaza, aldolaza)

- enzymy jako białko złożone

- enzymy należące do białek złożonych zawierające ni aminokwasowe grupy luźno związane z cząsteczką białkową (koenzymy)

Wiele enzymów ma nazwy utworzone przez dodanie końcówki ,,-aza" do nazwy substratu. Tak więc ureaza jest enzymem katalizującym hydrolizę mocznika (ang. urea), a fruktozo-l,6-bisfosfataza hydrolizuje fruktozo-1-6-bisfosforan. Jednakże pewne enzymy, np. trypsyna i chymotrypsyna, mają nazwy nic odnoszące się do ich substralów (nazwy zwyczajowe). Są też enzymy, które mają po kilka różnych nazw. W celu ujednolicenia nazw enzymów opracowano system nazewnictwa enzymów, uzgodniony międzynarodowo (Enzyme Commission — EC). System ten dzieli wszystkie enzymy na sześć głównych klas, opartych na typie prowadzonej reakcji. Następnie każdy enzym zostaje zidentyfikowany przez czteroliczbowy numer. Tak więc trypsyna ma numer (EC) 3.4.21.4, przy czym pierwsza liczba (3) oznacza, że jest ona hydrolazą, druga liczba (4) oznacza, że jest proteazą, która hydrolizuje wiązania peptydowe, trzecia liczba (21) uziuiizu, że enzym jest piulecizą seiynową, mującą w miejscu aktywnym krytyczną resztę seryny, a czwarta liczba (4) wskazuje, że był to czwarty enzym historycznie przypisany do tej klasy. Dla porównania: chymotrypsyna ma numer EC 3.4.21.1, a elastaza 3.4.21 -36.

Koenzymy - małocząsteczkowe, niebiałkowe związki organiczne decydujące o aktywności katalitycznej pewnych enzymów. Biorą udział w reakcjach przez oddawanie lub przyłączanie pewnych reagentów (atomów, grup atomów lub elektronów). Pozostają luźno związane z właściwym enzymem. Jako koenzymy funkcjonują w większości witaminy lub jony połączone odwracalnie z apoenzymem. Koenzymy pod względem chemicznym są nukleotydami, czyli związkami, które składają się z cukru (pentoza: ryboza, deoksyryboza), zasady azotowej (purynowe: adenina, guanina; pirymidynowe: tymina, cytozyna, uracyl) oraz z fosforanu (jednego lub kilku).

Centrum aktywne

Centrum aktywne enzymu jest regionem, który wiąże substrat i przemienia go w produkt. Zazwyczaj jest to względnie niewielka część całej cząsteczki enzymu i stanowi określoną trójwymiarową przestrzeń, utworzoną przez reszty aminokwasów, które w liniowym łańcuchu polipeptydowym mogą leżeć daleko od siebie. Centrum aktywne jest często szczeliną lub zagłębieniem w cząsteczce enzymu, które tworzy środowisko w znacznym stopniu niepolarne, co ułatwia wiązanie substratu. Substrat jest wiązany w miejscu aktywnym przez liczne słabe siły (oddziaływania elektrostatyczne, wiązania wodorowe, siły van der Waalsa, oddziaływania hydrofobowe), a w pewnych przypadkach przez odwracalne wiązania kowalencyjne. Po związaniu cząsteczki substratu i utworzeniu kompleksu enzym-substrat, katalitycznie czynne reszty w obrębie aktywnego miejsca enzymu działają na cząsteczkę substratu tak, aby przekształcić go początkowo w stan przejściowy, a następnie w produkt, który zostaje uwolniony do roztworu. Potem enzym, już wolny, może związać kolejną cząsteczkę substratu i rozpocząć nowy cykl katalityczny.

Zaproponowano dwa modele wyjaśniające, jak enzym może wiązać swój substrat. W modelu zamka i klucza, zaproponowanym przez Kamila Fischera w 1894 roku, kształt substratu i aktywnego miejsca enzymu miałyby pasować do siebie jak klucz do zamka. Oba kształty są uważane za sztywne i utrwalone oraz pasujące do siebie idealnie po odpowiednim zestawieniu. W modelu indukowanego dopasowania, zaproponowanym w 1958 roku przez Daniela E. Koshlanda, Jr., wiązanie substratu indukuje zmianę konformacyjną w aktywnym miejscu enzymu. Poza tym enzym może zniekształcić substrat wymuszając w nim konformację podobną do stanu przejściowego. Na przykład, związanie glukozy z heksokinazą indukuje taką konformacyjną zmianę w strukturze enzymu, że jego centrum aktywne przyjmuje kształt komplementarny do substratu (glukozy) tylko po jego związaniu z enzymem. Różne enzymy wykazują cechy charakterystyczne dla obu modeli, a więc pewną komplementarność i pewne zmiany konformacji.

Model Klucza-Zamka Model indukowanego dopasowania

Specyficzność substratowa

Właściwości i ułożenie przestrzenne reszt aminokwasów tworzących aktywne miejsce enzymu determinują rodzaj cząsteczki, która może zostać związana i stać się substratem dla tego enzymu. O specyficzności substratowej często decydują zmiany stosunkowo niewielkiej liczby aminokwasów w miejscu aktywnym. Widać to wyraźnie w trzech enzymach trawiennych: trypsynie, chymotrypsynie i elastazie. Te trzy enzymy należą do rodziny enzymów o nazwie proteazy serynowe — „serynowe", ponieważ mają w miejscu aktywnym resztę seryny, której udział w katalizie jest krytyczny, a „proteazy", ponieważ katalizują hydrolizę wiązań peptydowych w białku. Te trzy enzymy rozszczepiają
wiązania peptydowe w białkowych substratach po karboksylowej stronie pewnych reszt aminokwasów.

Trypsyna rozszczepia (tnie) po karboksylowej stronie dodatnio naładowanych reszt Lys lub Arg, chymotrypsyna — po karboksylowej stronie dużych reszt aminokwasów aromatycznych i hydrofobowych, a elastaza — po karboksylowej stronie reszt o krótkich, nie naładowanych łańcu-
chach bocznych. Różna specyficzność tych enzymów jest narzucona przez charakter grup aminokwasów w miejscach wiązania substratu, komplementarnych względem substratu, na który działają. Tak więc trypsyna ma w swym miejscu wią/ania substratu ujemnie naładowaną resztę Asp,
która oddziałuje z dodatnimi ładunkami na bocznych łańcuchach Lys i Arg substratu (rys. 2a).

Chymotrypsyna ma w miejscu wiązania substratu reszty aminokwasów o krótkich łańcuchach bocznych, takie jak Gly i Ser, co umożliwia wejście do tych miejsc dużych łańcuchów bocznych sub-
stratu (rys. 2b).

Natomiast elastaza ma względnie duże, nie naładowane boczne łańcuchy aminokwasów Val i Thr, wystające do miejsca wiązania substratu, co pozwala na wejście do tego miejsca wyłącznie krótkich
łańcuchów bocznych Gly i Ala substratu (rys. 2c).

Mechanizmy działania enzymów

• Obniżanie energii aktywacji przez tworzenie środowiska, w którym następuje stabilizacja stanu przejściowego

• Obniżanie energii stanu przejściowego przez likwidację niekorzystnych energetycznie oddziaływań ze środowiskiem, i ich zamianę na korzystne energetycznie oddziaływania z centrum aktywnym.

• Wykorzystanie alternatywnego szlaku przejścia, np. tymczasowa reakcja substratu do pośredniego kompleksu enzym-substrat (ES), która nie byłaby możliwa w nieobecności enzymu.

• Zmniejszanie entropii reakcji poprzez usytuowanie dostarczanych razem substratów w poprawnej orientacji, niezbędnej do zajścia reakcji.

Energia aktywacji i stan przejściowy

Aby zaszła reakcja biochemiczna, musi zostać pokonana bariera energetyczna związana z przekształceniem cząsteczki substratu w stan przejściowy. Stan przejściowy ma w przebiegu reakcji największą energię swobodną. Różnica energii swobodnej między substratem a stanem przejściowym nazywana jest energią aktywacji. Enzym stabilizuje stan przejściowy i zmniejsza wartość energii, zwiększają przez to szybkość przebiegu reakcji.

Zmiana energii swobodnej

Różnica poziomu energii między substratem a produktem nazywana jest zmianą energii swobodnej. Ujemna wartość energii wskazuje, że reakcja jest tcrmodynarrucznie korzystna we wskazanym kierunku, ale dodatnia wartość wskazuje, że reakcja jest termodynamicznie niekorzystna i aby zajść we wskazanym kierunku, wymaga nakładu energii. Reakcja energetycznie niekorzystna jest często napędzana przez powiązanie jej z reakcją energetycznie korzystną, taką jak hydroliza ATP.

Stan równowagi reakcji

Reakcja chemiczna często znajduje się w stanie równowagi dynamicznej. Siała równowagi (Km) określa slosunek stężeń substratu i produktu w momencie równowagi. Enzymy nie zmieniają położenia równowagi, ale przyspieszają jej osiągniecie zwiększając szybkość reakcji w kierunku zarówno wprost, jak i odwrotnym.

Km - stężenie substratu przy którym szybkość reakcji jest równa połowie szybkości maksymalnej

Szybkość działania enzymów

Aktywność enzymu wyraża się zwykle jako początkową szybkość (V₀) katalizowanej reakcji. Jednostką V₀ jest jednostka enzymatyczna (U) lub katal (Kat). Określenie aktywność (lub aktywność całkowita) odnosi się do całkowitej ilości jednostek enzymu w próbce, natomiast określenie aktywność specyficzna jest liczbą jednostek przypadającą na miligram białka.

Stężenie substratu

Przy małych stężeniach substratu ([S]) podwojenie [S] prowadzi do podwojenia wartości V₀, natomiast przy większych [S] enzym ulega wysyceniu, a jego V₀ już dalej nie wzrasta. Wykres V₀ jako funkcji |S| daje krzywą hiperboliczną.

Stężenie enzymu

Gdy [S] ma wartość wysycającą, podwojenie stężenia enzymu powoduje podwojenie wartości V₀.

Czynniki mające wpływ na aktywność enzymów (fizyczne, chemiczne)

• Zmiana stężenia substratów

• Temperatura

• Wpływ pH

• Sprzężenie zwrotne

• Potencjał oksydoredukcyjny

• Ko faktory działające z białkiem enzymatycznym

• Zmogeny

• Aktywacja i inhibicja allosteryczna

Klasyfikacja Enzymów

• Klasa I - oksydoreduktazy

• Klasa 2 - transferazy

• Klasa 3 - hydrolazy

• Klasa 4 - liazy

• Klasa 5 - izomerazy

• Klasa 6 - ligazy

Inhibicja enzymów

Katalityczna szybkość enzymu może być zmniejszona przez cząsteczki inhibitora. Istnieje wiele inhibitorów, w tym metabolitów obecnych normalnie w organizmie, oraz leków i toksyn, obcych dla
organizmu. Rozróżnia się dwa typy inhibicji (hamowania) enzymów: nieodwracalną i odwracalną. Inhibicję odwracalną można dalej podzielić na kompetycyjną i niekompetycyjną.

Inhibicja nieodwracalna

Inhibitor nieodwracalny wiąże się ściśle, często kowalencyjnie, z resztami aminokwasów w miejscu aktywnym enzymu, trwale inaktywując enzym. Przykładami nieodwracalnych inhibitorów są diizopropylofluorofosforan (DIPF), amid kwasu jodooctowego oraz penicylina.

Inhibicja odwracalna

Inhibitor niekompetycyjny wiąże się w enzymie z miejscami innymi niż centrum aktywne i zmniejsza szybkość katalityczną enzymu, powodując konformacyjną zmianę w jego kształcie przestrzennym.
Wpływu inhibitora niekompetycyjnego nic można przezwyciężyć przez duże stężenia substratu. Wykres Lineweavera-Burka ukazuje, że inhibitor niekompetycyjny zmniejsza V_max, ale nie zmienia
wartości K_m.

Regulacja aktywności enzymatycznej przez sprzężenie zwrotne

Szybkości reakcji katalizowanych w układach biologicznych przez enzymy są zmieniane przez aktywatory i inhibitory, nazywane łącznie cząsteczkami efektorowymi (efektorami). W szlakach metabolicznych produkt końcowy często hamuje w drodze sprzężenia zwrotnego decydujący etap, który wcześniej występuje na tym samym szlaku: ma to na celu przeciwdziałanie nagromadzaniu się intermediatów i niepotrzebnemu zużywaniu metabolitów oraz energii. W rozgałęzionych szlakach metabolicznych często działa proces hamowania w drodze sekwencyjnego sprzężenia zwrotnego.

Enzymy allosteryczne

Wykres zależności V0 od [S] dla enzymów allosterycznych ma kształt krzywej sigmoidalncj. Enzymy allosteryczne mają często więcej niż jedno centrum aktywne, które to miejsca kooperatywnie wiążą
cząsteczki substratu, dzięki czemu związanie substratu w jednym miejscu aktywnym indukuje w enzymie zmianę konformacyjną, zmieniającą powinowactwo do substratu w innych miejscach aktywnych. Enzymy allosteryczne są często białkami złożonymi z wielu podjednostek, z których każda ma centrum aktywne. Poza tym enzymy allosteryczne mogą być kontrolowane przez cząsteczki efektorowe (aktywatory lub inhibitory), które wiążą się do miejsc innych niż miejsca aktywne i zmieniają szybkość aktywności enzymatycznej. Transkarbamoilaza asparaginianowa jest enzymem allosterycznym, katalizującym decydujący etap w biosyntezie pirymidyn. Enzym ten składa się z sześciu podjednostek katalitycznych, z których każda ma centrum aktywne, oraz z sześciu podjednostek regulatorowych, do których wiążą się efektory allosteryczne: cytydynotrifosforan (CTP) oraz ATP. Transkarbamoilaza asparaginianowa jest hamowana w drodze sprzężenia zwrotnego przez końcowy produkt szlaku, CTP, działający jako inhibitor allosteryczny. Natomiast ATP, będący intermediatem pojawiającym się w szlaku wcześniej, działa jako aktywator allosteryczny.

Odwracalne modyfikacje kowalencyjne

Aktywność wielu enzymów jest zmieniana przez odwracalne tworzenie i rozrywanie wiązania kowalencyjnego między enzymem a małą grupą niebialkową. Najczęściej występującą modyfikacją jest dodawanie i usuwanie grupy fosforanowej, a więc odpowiednio, fosforylacja i defosforylacja. Fosforylacja jest katalizowana przez kinazy białkowe, często używające ATP jako donora grupy
fosforanowej, natomiast defosforylacja jest katalizowana przez fosfatazy białkowe.

Regulacja enzymatycznej syntezy i rozkładu

Ilość obecnego w komórce enzymu jest wynikiem równowagi miedzy szybkościami jego syntezy i degradacji. Poziom indukcji lub represji genu kodującego enzym oraz szybkość degradacji jego mRNA
decydują o szybkości syntezy białka enzymatycznego. Szybkość rozpadu (pólokres życia) raz zsyntetyzowanego białka enzymatycznego może być również zmieniana, co stanowi dalszy sposób regulowania aktywności enzymatycznej.

Immobilizacja enzymów

- fizyczna

- chemiczna

---