IMMUNODIAGNOSTYKA
Reakcje precypitacji - antygeny biorące udział w reakcji to antygeny białkowe, zarówno pełnowartościowe jak i resztkowe (hapteny); cechą charakterystyczną jest ich wielowartościowość (jednowartościowe, posiadające tylko jedną determinantę antygenową [epitop] nie precypitują, choć też nie wszystkie wielowartościowe precypitują), ponadto są rozpuszczalne (co różni je od antygenów biorących udział w precypitacji, które tworzą zawiesinę); przeciwciała biorące udział w reakcji precypitacji noszą nazwę precypityn. Nieprecypitujące przeciwciała mają niskie powinowactwo do antygenu, albo wykazują dwuwartościowość monogamiczną (dwa miejsca wiązania dla dwóch determinant tej samej cząsteczki antygenu).
Reakcje precypitacji zachodzą w dwóch etapach:
antygen reaguje z precypityną → powstaje kompleks antygen-przeciwciało;
utworzenie strątu → wytrącenie kompleksu pod wpływem elektrolitów obecnych w środowisku reakcji; etap ten zachodzi tylko w optymalnych warunkach - w strefie ekwiwalencji (odpowiednie proporcje antygenu i przeciwciała; w przypadku nadmiaru któregoś z reagentów powstają niewidoczne kompleksy rozpuszczalne).
Przeciwciała o bardzo wąskiej strefie ekwiwalencji (wąski zakres stężeń reagentów, w którym ulegają one precypitacji) nazywamy przeciwciałami flokulującymi. Powstały w wyniku flokulacji precypitat ma postać luźnych kłaczków.
Optymalne warunki precypitacji: 0.15-molowy roztwór NaCl, pH 6.4-8.5
W przypadku surowic ludzkich, reakcje przebiegają identycznie w temperaturach 20 i 37°C.
Należy w reakcjach precypitacji stosować surowice zinaktywowane (pozbawione dopełniacza, który wiąże się z kompleksem antygen-przeciwciało powodując częściowe jego rozpuszczenie).
Odczyny precypitacji w środowisku płynnym:
Odczyn precypitacji pierścieniowej → do probówek wprowadzamy surowicę odpornościową i ostrożnie nawarstwiamy roztwór, w którym poszukujemy antygenu. Na granicy płynów powstaje pierścień (poszukując przeciwciał, badany roztwór nawarstwiamy na roztwór odpowiedniego antygenu);
Odczyn precypitacji szkiełkowej → na szkiełko przedmiotowe nakrapiamy roztwór antygenu i surowicy i intensywnie mieszamy. Na dnie kropli pojawia się strąt;
Odczyn flokulacyjny → zasadą tego odczynu jest reakcja przeciwciał obecnych w surowicy chorego z antygenem kardiolipinowym (otrzymywany z mięśnia serca wołu). Zinaktywowaną surowicę badaną nakraplamy do zagłębienia szkiełka Lindnera (szkiełko z łezką) i dodajemy zawiesinę antygenu kardiolipinowego. Wytrząsamy i oceniamy pod mikroskopem obecność kłaczków. Odczyn flokulacyjny stosowany w diagnostyce kiły znany jest jako odczyn VDRL (veneral disease research laboratory test), jego modyfikacją jest test mikroflokulacyjny, w którym do antygenu dodawany jest chlorek choliny inaktywujący dopełniacz, tak, że surowica nie musi być wstępnie inaktywowana.
Odczyny precypitacji w środowisku stałym (immunodyfuzja):
Pozwalają badać jednocześnie wiele układów antygen-przeciwciało; oparte są na zjawisku dyfuzji w żelu (agarowym, agarozowym lub poliakrylamidowym) - na granicy zetknięcia się dyfundujących reagentów (w ich strefie ekwiwalencji) powstają linie precypitacyjne. Przebieg immunodyfuzji zależy od wielkości cząsteczek i ich stężenia. Optymalne pH to 6.0-9.0, temperatura zazwyczaj pokojowa. Po zakończeniu badania preparaty się utrwala (płucze w NaCl, potem w wodzie destylowanej by usunąć cząstki reagentów nie związane w kompleksach; suszy przykrywając bibułą; wybarwia - najczęściej czernią amidową).
Immunodyfuzja pojedyncza → gdy jeden reagent dyfunduje, a stężenie drugiego jest stałe.
Immunodyfuzja podwójna → gdy oba reagenty dyfundują.
Obie można przeprowadzać w probówkach (metoda Oudina) lub na płytkach (metoda Outcherlony'ego):
Pojedyncza immunodyfuzja probówkowa → liczba pierścieni zależy od liczby reagujących antygenów i przeciwciał (niejednorodny/jednorodny antygen, mono-/poliwalentna surowica). Na dno probówki wlewa się agar zmieszany z surowicą odpornościową i czeka na zestalenie podłoża, następnie nawarstwia się roztwór antygenu, który dyfunduje do agaru. W strefie ekwiwalencji pojawi się pierścień precypitacyjny;
Podwójna immunodyfuzja probówkowa → na dno probówki wlewa się agar z surowicą, następnie warstwę samego agaru, potem roztwór antygenu, lub żel zawierający antygen - reagenty dyfundują do żelu obojętnego;
Pojedyncza immunodyfuzja płytkowa (immunodyfuzja radialna) → przeciwciała miesza się z płynnym agarem i wylewa na płytkę, po zastygnięciu wycina się studzienki i wypełnia roztworem badanego antygenu. Antygen dyfunduje pierścieniowo, tworząc pierścieniowe strefy precypitacyjne o średnicy wprost proporcjonalnej do stężenia antygenu, które można wyliczyć porównując do krzywej kalibracyjnej;
Podwójna immunodyfuzja płytkowa (PDA) → w żelu agarowym na płytce szklanej wycina sie studzienki, do jednych wprowadza sie roztwór antygenu, do drugich przeciwciała - reagenty dyfundują, a w strefie ekwiwalencji zaobserwujemy linie precypitacyjne (prosta - masy cząsteczkowe przeciwciała i antygenu sa zblizone; wygięcie w strone danego reagentu natomiast świadczy o jego wyższej masie cząsteczkowej). Można badać jednocześnie różne surowice z jednym antygenem, lub różne antygeny z jedną surowicą i określic stopień podobieństwa antygenowego (reakcja identyczności - linie precypitacyjne łączą się łukowato; reakcja nieidentyczności - linie się krzyżują; reakcja częściowej identyczności - linie łączą się, ale z ostrogą).
Immunoelektroforeza - metoda łącząca elektroforezę z podwójna immunodyfuzją:
mieszanina białek jest wstępnie rozdzielana w polu elektrycznym (próbka umieszczona w studzience wyciętej w 1% żelu agarowym → ruchliowść zależy od ładunku, masy i ksztaltu cząsteczki, a także od siły jonowej, pH środowiska i rodzaju podłoża);
immunodyfuzja rozdzielonych elektroforetycznie antygenów i odpowiednich przeciwciał (w agarze wycina się rowek równoległy do kierunku migracji, i dodaje się do neigo surowicę → antygeny i przeciwciała dyfunduja, dając linie precypitacyjne w ich strefie ekwiwalencji; im wyższe bylo stężenie antygenu, tym bliżej rowka z surowicą znajduje się linia precypitacyjna).
Wyróżniamy:
Immunoelektroforezę wg. metody Scheideggera → metoda tak jak opisano wyżej; przy badaniu surowicy ludzkiej do rowka nalewa się końską surowicę odpornościową poliwalentną przeciwko białkom surowicy ludzkiej;
Immunoelektroforezę rakietkową wg. metody Laurella → pozwala na ilościowa ocenę poszczególnych białek; na płytkę wylewa się agar z przeciwciałami, do studzienek dodaje się badany płyn ustrojowy i poddaje elektroforezie. Linie precypitacyjne przyjmą kształt stożka (rakietki), którego wysokość jest wprost proporcjonalna do stężenia antygenu (które odczytamy z krzywej wzorcowej);
Elektroimmunodyfuzję (immunoelektroforeza przeciwprądowa) → w żelu agarowym wycina się dwie studzienki, do jednej wprowadza sie antygen, do drugiej przeciwciala i poddaje się elektroforezie (warunki dobrane tak, by reagenty wędrowały do siebie) - łuki precypitacyjne widoczne już po 30 minutach!
Immunoelektroforeza krzyżowa → metoda jak rakietkowa, tylko pozwala na wykrycie kilku antygenów (pierwszy etap - elektroforeza badanego materialu na żelu, czyli rozdzielenie antygenów; drugi etap - dolanie przeciwciał i prowadzenie elektroforezy w kierunku prostopadlym do poprzedniego; w strefie ekwiwalencji dla poszczególnych antygenów powstają łuki precypitacyjne o skztalcie stożków).
Aglutynacja - reakcja, w której dochodzi do zlepiania się elementów upostaciowanych (aglutynogenów, którymi mogą być komórki np. erytrocyty lub sztuczne nośniki antygenu, np. cząsteczki lateksu, bentonitu, polistyrenu) pod wpływem swoistych przeciwciał (aglutynin) skierowanych przeciwko antygenom znajdującym się na ich powierzchni (własnym lub obcym, uprzednio opłaszczonym na ich powierzchni).
Przeciwciała niekompletne → nie mają zdolności aglutynacyjnych (mały kąt rozwarcia regionu zawiasowego powoduje powstawanie wiązania monogamicznego, tylko z jednym antygenem).
Cząsteczki antygenu posiadające ładunek elektrostatyczny nie aglutynują.
Reakcja aglutynacji zachodzi dwuetapowo:
wiązanie aglutynogenu z aglutyniną (etap swoisty);
wypadanie z roztworu powstałych kompleksów w postaci dobrze widocznych agregatów (aglutynatów).
Warunkami optymalnymi są: pH 6.8-7.2, 0.15-molowy roztwór NaCl, temperatura pokojowa.
Reakcje aglutynacji można podzielić na dwa typy:
aglutynacja bezpośrednia (czynna) → przeciwciała reagują bezpośrednio z antygenami naturalnie występującymi na powierzchni komórek
metoda szkiełkowa - na szkiełku przedmiotowym umieszcza sie kroplę zawiesiny badanego antygenu i kroplę wstępnie zinaktywowanej surowicy zawierającej swoiste przeciwciała (aglutynaty tworzą na dnie kropli wyraźny strąt) → metoda stosowana do oznaczania grup krwi w zakresie układu AB0, lub w diagnostyce leptospirozy (odczyn Fletschera)
metoda probówkowa - metoda półilościowa; w szeregu probówek przygotowuje się kolejne rozcieńczenia badanej surowicy, do każdej dodaje się taką samą ilość aglutynogenu; miano przeciwciał podaje się jako odwrotność największego rozcieńczenia surowicy, przy którym wystąpiła jeszcze aglutynacja → metoda stosowana w diagnostyce duru brzusznego (odczyn Widala), duru plamistego (odczyn Weil-Felixa) czy brucelozy (odczyn Wrighta)
Biorąc pod uwagę rodzaj antygenu powierzchniowego, wyróżniamy trzy typy aglutynacji bakterii:
aglutynację H (rzęskową, obłoczkową) - u bakterii posiadających antygen rzęskowy H (bakterie zlepiają się rzęskami tworząc delikatny strąt ulegający rozbiciu przy wstrząsaniu);
aglutynację O (komórkową, grudkową) - związaną z obecnością antygenu somatycznego O (bakterie zlepiają się biegunami, aglutynaty tworzą zwarte grudki opadające na dno probówki);
aglutynację Vi - związaną z obecnością antygenu powierzchniowego Vi (bakterie przylegają do siebie całą powierzchnią, aglutynaty osadzają się na dnie i bocznych sciankach probówki)
aglutynacja pośrednia (bierna) -> przeciwciała reagują z antygenem rozpuszczalnym, uprzednio opłaszczonym na nośniku (erytrocyty, cząsteczki lateksu, betonitu)
(aglutynacja bierna odwrócona -> cząsteczki nośnika opłaszcza się przeciwciałami, co pozwala na wykrycie antygenu w badanym materiale)
odczyn lateksowy - cząsteczki lateksu opłaszczone danym antygenem inkubuje sie z badaną surowicą i ocenia wystąpienie aglutynacji -> metoda stosowana do wykrywania czynnika reumatoidalnego (RF) przy diagnozowaniu reumatoidalnego zapalenia stawów, do wykrywania obecności antystreptolizyny O w diagnozowaniu trwających i przebytych chorób paciorkowcowych
(test w wersji odwróconej wykorzystywany jest do wykrywania obecności białka C-reaktywnego CRP w surowicy)
odczyn hemaglutynacji - zjawisko aglutynacji erytrocytów opłaszczonych uprzednio danym antygenem, w obecności swoistych przeciwciał skierowanych przeciwko temu antygenowi (erytrocyty będące nośnikiem nie powinny same reagować z badana surowicą, dlatego stosujemy erytrocyty barana, lub ludzkie grupy 0 Rh-); oceniamy makroskopowo wystąpienie aglutynacji (dno płytki równomiernie pokryte krwinkami - wynik dodatni; na dnie zbity "guziczek" z erytrocytów - wynik ujemny)
odczyn hamowania hemaglutynacji - jest odmianą odczynu hemaglutynacji, w którym przed dodaniem do surowicy opłaszczonych antygenem erytrocytów, surowicę inkubujemy z badanym materiałem, w którym poszukujemy tego antygenu (jeśli znajduje się on w próbie badanej, to zwiąże on przeciwciała, i po dodaniu erytrocytów nie zajdzie reakcja hemaglutynacji - wynik dodatni)
odczyn antyglobulinowy Coombsa - służy do wykrywania przeciwciał niekompletnych, prowadzi się go w dwóch wariantach:
odczyn bezpośredni - pozwala wykryć obecność przeciwciał niekompletnych opłaszczonych in vivo na erytrocytach (do zawiesiny erytrocytów dodaje sie bezpośrednio przeciwciała antyglobulinowe, np. przy wykrywaniu obecności przeciwciał anty-D układu Rh w chorobie hemolitycznej noworodków)
odczyn pośredni - pozwala wykryć obecność przeciwciał niekompletnych w surowicy (po opłaszczeniu erytrocytów wzorcowych badana surowicą, dodajemy przeciwciała antyglobulinowe, np. przy wykrywaniu obecności przeciwciał anty-D układu Rh w surowicy matki w przypadku podejrzenia konfliktu serologicznego)
Odczyn pośredni jest także wykorzystywany w teście Waalera-Rosego, do wykrywania obecności w surowicy czynnika reumatoidalnego RF (klasy IgM). W teście wykorzystuje sie erytrocyty barana opłaszczone przeciwciałami króliczymi skierowanymi przeciwko erytrocytom barana (do opłaszczania stosuje się surowicę króliczą o stężeniu czterokrotnie mniejszym niz stężenie wywołujące aglutynację tych krwinek). Następnie inkubuje sie je z kolejnymi rozcieńczeniami uprzednio zinaktywowanej surowicy badanej. Ponieważ w surowicach ludzkich znajdują się naturalne przeciwciala skierowane przeciwko białkom surowicy królika, aglutynacja może zajść nawet w przypadku nieobecności czynnika RF. Przyjęto, iż wynik dodatni to taki, w którym aglutynacja erytrocytów barana występuje przy rozcieńczeniu surowicy badanej 160x lub więcej.
Odczyn wiązania dopełniacza - kompleksy immunologiczne antygen-przeciwciało (IgG lub IgM) mają zdolność wiązania dopełniacza. Jeśli kompleks związany ejst z erytrocytem, powoduje to jego lizę (hemoliza immunologiczna) - początkowo mętna zawiesina krwinek staje się klarowna o intensywnie czerwonym kolorze. Metodę tę stosuje sie w diagnostyce wielu zakażeń bakteryjnych, grzybiczych i wirusowych. Przed wykonaiem odczynu należy przygotować:
zinaktywowaną surowicę badaną,
przeciwciała antyerytrocytarne (amboceptor, którym z reguły jest surowica królika uodpornionego erytrocytami barana),
opłaszczone przeciwciałami antyerytrocytarnymi erytrocyty barana (do opłaszczenia stosuje się 2 jednostki hemolityczne amboceptora),
dopełniacz (źródlem ktorego jest surowica świnki morskiej).
Odczyn wykonuje się dwuetapowo:
inkubacja surowicy badanej ze znanym antygenem (lub odwrotnie) i dodanie dopełniacza (jeśli w surowicy obecne jest szukane przeciwciało, powstanie kompleks immunologiczny i zwiąże dopełniacz; jeśli nie, dopełniacz pozostanie w roztworze)
dodanie układu wskaźnikowego - opłaszczonych erytrocytów barana (jeśli uprzednio dopełniacz został związany, to nie nastąpi hemoliza krwinek - wynik dodatni)
Aktywność hemolityczna dopełniacza (CH50) oznaczana jest przez ustalenie ilości surowicy wywołującej 50-procentową lizę opłaszczonych erytrocytów barana.
Odczyn antystreptolizyny O (ASO) - antystreptolizyna O jest przeciwciałem wytwarzanym w organizmie w odpowiedzi na zakażenie paciorkowcami beta-hemolizującymi grupy A; jest swoiście skierowana przeciwko streptolizynie O (SO). Zasada oznaczania poziomu ASO w surowicy oparta jest na hamowaniu przez antystreptolizynę zjawiska hemolizy erytrocytów zachodzacej pod wpływem SO:
do probówek dodaje się kolejne rozcieńczenia badanej surowicy i roztwór streptolizyny o stałym stężeniu
do każdej probowki dodaje się zawiesinę erytrocytów królika i inkubuje (jeśli erytrocyty nie uległy hemolizie - wynik dodatni)
Wynik podaje się w jednostkach międzynarodowych jako miano surowicy (odwrotność największego rozcieńczenia surowicy, przy którym hemoliza jeszcze nie wystąpiła) - miano do 200 j.m. przyjmuje sie za prawidłowe; podwyższone świadczy o przebytych chorobach paciorkowcowych, choć u 5-10% ludzi zdrowych również stwierdza się podwyższone miano.
Poziom antystreptolizyny mozna też ocenić stosując odczyn lateksowy (do badanej surowicy dodaje się kroplę odczynnika lateksowego (zawiesina cząstek lateksu opłaszczonych oczyszczona streptolizyną O) -> wystąpienie aglutynacji świadczy o obecności ASO w mianie wyższym niż 200 j.m.
Metody immunologiczne z zastosowaniem znaczników - polegają na wyznakowaniu jednego ze składników reakcji antygen-przeciwciało; ze względu na użyty znacznik, wyróżniamy:
metody fluorymetryczne (FIA) - znacznikami są fluorochromy fluoryzujace w świetle o krótkiej fali (izotiocyjanian fluoresceiny FITC emitujący światło zielone lub izotiocyjanian rodaminy B RITC emitujący światlo czerwone); ze względu na środowisko reakcji, wyróżniamy:
metody homogenne - przeprowadzane w środowisku płynnym; badany materiał inkubowany jest z przeciwciałami znakowanymi fluorochromem i mierzy się stopień wygasania fluorescencji w porównaniu do wyjściowej w miarę łączenia się przeciwciał z poszukiwanym antygenem
metody heterogenne - jeden ze składników związany jest z fazą stałą (np. powierzchnią probówki polistyrenowej); po reakcji odpłukuje sie supernatant i mierzy fluorescencję kompleksu związanego z fazą stałą; wyróżniamy:
metody kompetycyjne - do przeciwciała związanego z fazą stałą dodaje sie równocześnie antygen badany i homologiczny antygen znakowany fluorochromem, które konkuruja o przeciwciała (natężenie fluorescencji będzie odwrotnie proporcjonalne do zawartości antygenu w próbie)
metody pośrednie - antygen związany z fazą stałą inkubujemy z badaną surowicą (tworzą się kompleksy antygen-przeciwciało), po czym dodajemy wyznakowane fluorochromem przeciwciała homologiczne do tych poszukiwanych (im wyższe ich stężenie w badanym materiale, tym mniej przeciwciał wyznakowanych zwiąże się z antygenem)
metody kanapkowe - przeciwciała związane z fazą stałą inkubujemy z badanym antygenem, po czym dodajemy znakowane fluorochromem przeciwciała, które "dołączają się" do powstałych kompleksów (natężenie fluorescencji wprost proporcjonalne do zawartości antygenu)
metody radioimmunologiczne (RIA) - znacznikami są pierwiastki promieniotwórcze (najczęściej izotop 125J); wyróżniamy:
metodę kompetycyjną - przeciwciała inkubuje się z badanym antygenem w obecności homologicznego antygenu znakowanego izotopem, które wspólzawodniczą; ocenia się radioaktywność roztworu (wolny antygen) i kompleksu, oraz porównuje z krzywą kalibracyjną -> stosuje się do oznaczania stężenia hormonów i białek związanych z nowotworami
metoda bezpośrednia (Farra) - znakowany antygen inkubujemy z badanym materiałem, w którym poszukujemy przeciwciał; utworzony kompleks wytrąca się z roztowru np. siarczanem amonu i mierzy radioaktywność związana z osadem -> stosuje się do oznaczania poziomu przeciwciał anty-DNA
metoda immunoradiometryczna (IRMA) - powierzchnię probówek pokrywa się nieznakowanymi przeciwciałami, dodaje badany materiał z poszukiwanym antygenem; po opłukaniu dodaje się przeciwciała znakowane i mierzy radioaktywność związaną ze ścianką probówki; dla IgE opracowano:
test RAST (Radioallergosorbent Test) - służy do oceny stężenia przeciwciał IgE skierowanych przeciwko danemu antygenowi (alergen związany z nośnikiem inkubowany jest z badana surowicą, po opłukaniu dodaje się przeciwciała anty-IgE znakowane jodem i ocenia radioaktywność, porównując z próbkami kontrolnymi)
test RIST (Radioimmunosorbent Test) - służy do oceny całkowitego stężenia immunoglobuliny (nośnik opłaszczony nieznakowanymi anty-IgE inkubujemy z IgE, a po przepłukaniu dodajemy znakowane jodem anty-IgE, które dołącza do powstałych kompleksów); metoda stosowana do oceny poziomu IgG, stosując zamiast anty-IgE znakowane jodem białko A.
metody immunoenzymatyczne (EIA) - znacznikami są enzymy, a produkty reakcji przeprowadzanych przez nie są barwne, co oceniamy spektrofluorymetrycznie; enzymy nie mogą wystepować w płynach biologicznych (stosuje się więc peroksydazę chrzanową HRP, fosfatazę alkaliczną AP, oksydazę glukozową GO); wiązane są one z białkiem (antygenem lub przeciwciałem) za pomocą aldehydu glutarowego; substratami dla reakcji jest H2O2 (redukowany do wody) i chromagen, przekształcany w barwny związek (stosowane chromageny: ortofenylenodwuamina, O-dwuanizydyna, kwas 5-aminosalicylowy i p-nitrofenylofosforan sodowy). Odczyn może być prowadzony metodą bezpośrednią (badany materiał inkubować ze znakowanym przeciwciałem, H2O2 i chromagenem) lub pośrednią (inkubacja materiału badanego z nieznakowanymi przeciwciałami, następnie ze znakowanymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko gammaglobulinie)
test ELISA - stosowany w diagnostyce chorób zakaźnych i pasożytniczych; powierzchnię dołków mikropłytki oplaszcza sie antygenem, po opłukaniu dodaje się badaną surowicę w kolejnych rozcieńczeniach - po kolejnym przepłukaniu dodaje się przeciwciała skierowane przeciwko immunoglobulinie, płytkę opłukać i dodać H2O2 i chromagen -> porównać z krzywą kalibracyjną.
Techniki immunomorfologiczne - pozwalają wykryc obecność przeciwciała lub antygenu związanego bezposrednio z komórka lub tkanką. Biorąc pod uwagę przebieg reakcji, wyróżniamy metody bezpośrednie i pośrednie; biorąc za kryterium rodzaj użytego znacznika, wyrózniamy:
techniki immunofluorescencyjne (IMF) - stosuje sie barwniki FITC lub RITC; oprocz reakcji bezpośredniej i pośredniej, prowadzona jest też dwubarwna reakcja immunofluorescencji (wykorzystuje sie fluorochromy emitujące światło o różnych barwach, dzieki czemu można równocześnie ocenić obecnośc dwóch różnych antygenów w preparacie → jedne przeciwciała będą znakowane FITC, a drugie RITC)
techniki immunoenzymatyczne (EIA) - stosowanymi chromagenami zazwyczaj są tetrachlorowodorek dwuaminobenzydyny (DAB, przekształca się w ciemnobrązowy nierozpuszczalny produkt) lub 3-amino-9-etylokarbazol (AEC, przekształca sie w nierozpuszczalny produkt barwy czerwonej). Do najczęściej stosowanych odmian pośrednich reakcji immunoenzymatycznych należą:
reakcja peroksydaza-antyperoksydaza (PAP) - po wstepnej inkubacji materiału badanego ze swoistymi przeciwciałami, do kompleksu antygen-przeciwciało dołącza się kompleks PAP za pomocą mostka (nieznakowanych przeciwciał o powinowactwie zarówno do przeciwciała pierwotnego jak i kompleksu enzym-antyenzym); dodanie H2O2 i chromagenu i ocena spektrometryczna
reakcja fosfataza alkaliczna-antyfosfataza alkaliczna (APAAP) - zasada metody jak wyżej, lecz z zastosowaniem kompleksu APAAP; do substratu należy dodać lewamizol dla zahamowania aktywności fosfatazy endogennej
reakcja przy użyciu układu biotyna-awidyna - utworzenie kompleksu antygen-przeciwciało (pierwotne); reakcja kompleksu z przeciwciałem wtórnym biotynylowanym (skierowanym przeciwko immunoglobulinie); reakcja powstałego kompleksu z kompleksem awidyna-biotynylowana peroksydaza (ABC - Avidin-Biotynylated peroxidase Complex), mającej zdolność przyłączania się do biotyny przeciwciała wtórnego.
Odmianą tej reakcji jest LAB (Labelled Avidin-Biotin), gdzie z biotynylowanym przeciwcialem wtórnym wiąże się wyznakowana enzymem awidyna.
Test cytotoksyczny - zasada tego testu oparta jest na zjawisku niszczenia komórek docelowych w obecności swoistych przeciwciał i dopełniacza; reakcja przebiega w dwóch fazach: związanie przeciwciał z antygenami obecnymi na powierzchni komórek, oraz przyłączenie dopełniacza i uszkodzenie błony, co prowadzi do śmierci komórki.
Wynik reakcji oceniamy:
metodą morfologiczną - dodając barwnik koloidalny (eozynę Y lub błękit trypanu), wychwytywany tylko przez komórki martwe;
metodą izotopową - przed wykonaniem właściwego testu, komórki docelowe należy wyznakować izotopem chromu 51Cr; po reakcji z przeciwciałami komórki martwe uwalniają chrom do środowiska -> oceniamy radioaktywność supernatantu.
Najczęściej test cytotoksyczny wykonuje się w modyfikacji opracowanej przez Terasaki i McClellenda (test mikrolimfocytotoksyczny):
płytkę z zagłębieniami wypełniamy olejem parafinowym
pod parafinę wprowadzamy surowicę anty-HLA o znanej swoistości i zawiesinę badanych limfocytów (w celu okreslenia antygenów zgodności tkankowej grupy II stosujemy limfocyty B, a czas inkubacji winien byc dwa razy dłuższy)
dodajemy dopełniacz, a po inkubacji barwnik i oceniamy pod mikroskopem
ponizej 25% komórek martwych - wynik ujemny (nieobecny antygen)
26-45% komórek martwych - wynik watpliwy
>45% - wynik dodatni (antygen zgodności tkankowej obecny)
Metody izolacji komórek immunologicznie czynnych - najczęściej izoluje się limfocyty T, limfocyty B, monocyty, komórki NK, granulocyty; proces składa się z dwóch etapów:
otrzymanie z tkanki zawiesiny komórkowej, zawierającej różne populacje :
z płynów ustrojowych - krew obwodową pobiera się na heparynę, cytrynian sodu lub EDTA (wersenian sodu) i poddaje sedymentacji; uzyskany nadsącz zawiera leukocyty z niewielką domieszką erytrocytów;
z tkanek litych - rozdrabniamy tkanke mechanicznie by uwolnic komórki ze zrębu łącznotkankowego, po czym trawimy tkankę enzymami (kolagenazą, DNA-zą); zawiesinę komórek oddzielamy od tkanki przesiewając przez odpowiednie filtry.
wyizolowanie z otrzymanej zawiesiny określonej populacji komórek:
wirowanie na gradientach gęstości: najczęściej stosowanym gradientem jest mieszanina Ficoll-Uropolina (Ficoll → hydrofilny polimer cukrozy; Uropolina → rozpuszczalnik) wykorzystywany do izolacji limfocytów (a takze do 15% monocytów i 5% granulocytów) z płynów ustrojowych czy komórek nowotworowych od limfoidalnych (równiez rozdzielane w roztworze surowicy cielęcej); stosowany jest też gradient Percollu (koloidalna krzemionka pokryta poliwinylopyrolidonem, rozcieńczacna roztworem NaCl) mający zastosowanie do rozdziału limfocytów T od B, izolacji komórek NK oraz do izolacji monocytów i granulocytów; przez wirowanie w gradiencie Gradisolu G (wodny roztwór Uropoliny i Dekstranu) uzyskujemy interfazę górną (zawierającą oczyszczone limfocyty) i interfazę dolną (neutrofile);
metody adherencyjne: oparte na zdolności przylegania niektórych komórek do szkła lub plastiku; zawiesine komórek inkubuje się w kolumnach wypełnionych np. watą nylonową, bo czym wypłukuje się komórki nie zaadsorbowane; aby uzyskać komórki zaadsorbowane, przepłukujemy roztworem surowicy cielęcej (FCS);
eliminacja komórek na drodze szoku osmotycznego: ma na celu usunięcie z mieszaniny erytrocytów przez dodanie wody destylowanej lub chlorku amonu;
metody z zastosowaniem immunoadsorbentów: podczas inkubacji zawiesiny komórek z immunoadsorbentem następuje wiązanie się do opłaszczonych cząsteczek nośnika jedynie tych komórek, których antygeny reagują z danymi przeciwciałami; stosowana do izolacji poszczególnych subpopulacji limfocytów;
metoda izolacji magnetycznej: paramagnetyczne cząstki polistyrenu (Dynabeads) opłaszczane są przeciwciałami i inkubuje z zawiesina komórek; komórki związane "wyciąga się" za pomoca magnesu
metoda z wykorzystaniem zjawiska fagocytozy: dodając do zawiesiny komórek karbonylku zelaza, komórki fagocytujące możemy oddzielić za pomocą magnesu;
tworzenie rozet: oparta na spontanicznym zjawisku wiązania się erytrocytów barana z limfocytami T poprzez antygen CD2; utworzone rozetki wirujemy na gradiencie.
Ocena fenotypu: metody różnicowania poszczególnych subpopulacji limfocytów oparta jest na identyfikacji antygenów różnicowania CD (Cluster Differentiation), np. CD2, CD3 (limfocyty T), CD4 (limfocyty T pomocnicze), CD8 (limfocyty T supresorowo-cytotoksyczne), CD19 (limfocyty B). Fenotyp komórek oceniamy techniką immunofluorescencji stosując przeciwciała anty-CD.
Metody oceny czynnościowej komórek układu immunologicznego:
test transformacji blastycznej: pozwala okreslić ogólny stan czynnosciowy limfocytów oraz wykryć ogólne defekty układu immunologicznego zależne od wad jego komórek; transformacja blastyczna to zjawisko polegające na przechodzeniu limfocytów dojrzałych w formy niedojrzale pod wpływem stymulacji swoistej (antygeny np. oczyszczona tuberkulina PPD, anatoksyna tężcowa, anatoksyna błonicza, LPS bakteryjny, surowice antylimfocytarne i antyimmunoglobulinowe) lub nieswoistej (czynniki mitogenne, czyli lektyny np. fitohemaglutynina PHA, konkanawalina A czy mitogen szkarłatki PWM); ocene transformacji blastycznej można przeprowadzić:
metodą morfologiczną (barwiąc metodą Pappenheima; w preparacie nie stymulowanym indeks blastyczny nie powinien przekroczyć 7%);
metodą izotopową (opartą na pomiarze inkorporacji do kwasów nukleinowych radioaktywnie znakowanej tymidyny lub białek, np. leucyny).
metody oceny sprawności czynnościowej fagocytów:
ocena adherencji fagocytów -> stosując kolumny wypełnione watą nylonową; po odpłukaniu komórek nie adherujących, dodaje sie barwnik MTT, który przekształcany jest przez komórki w pochodną - farmazan barwy niebieskiej;
badanie migracji fagocytów → prowadzone może byc w komorach Boydena (składajacych się z dwóch przedziałów oddzielonych filtrem; w górnej części kommory umieszcza sie zawiesinę badanych komórek, natomiast w dolnej części czynnik chemotaktyczny; błonę filtru wybarwia się i bada mikroskopowo) lub na płytce w żelu agarowym (wycina sie 3 studzienki: w środkowej umieszcza się zawiesinę komórek, a w studzienkach po obu jej stronach → płyn hodowlany i czynnik chemotaktyczny; po wybarwieniu metodą Pappenheima wyznaczamy indeks chemotaktyczny, czyli stosunek migracji w kierunku czynnika chemotaktycznego do migracji swobodnej w kierunku płynu hodowlanego);
badanie fagocytozy → do probówki dodaje sie zawiesinę badanych komórek i zawiesinę cząstek fagocytowanych w stosunku 1:6, a po odwirowaniu i wybarwieniem barwnikiem Giemza oblicza się indeks fagocytarny (stosunek liczby cząstek sfagocytowanych do komórek fagocytujących); można również znakować cząstki fagocytowane fluoresceiną lub pierwisatkiem promieniotwórczym i dokonać odczytu odpowiednio spektrofluorymetrycznego lub radioizotopowego;
ocena metabolizmu wewnątrzkomórkowego fagocytów → można albo dokonać oceny wybuchu tlenowego (spektrofluorymetrycznie oceniając redukcję cytochromu C przez produkowany podczas przemian bakteriobojczych anion ponadtlenkowy), albo wykonać test pochłaniania i redukcji NBT (błękitu nitrotetrazoliowego, który łatwo dostaje się do komórek podczas fagocytozy i ulega redukcji w fagolizosomach do nierozpuszczalnego farmazanu barwy ciemnogranatowej).
ocena produkcji cytokin: dokonywana przez ocenę wpływu cytokin na komórki testowe wrażliwe na ich działanie; do kolejnych dołków na płytce hodowlanej dodaje się zawiesine limfocytów T zależnych od Il-2 oraz badany płyn w kolejnych rozcieńczeniach, do hodowli dodaje się znakowaną trytem tymidynę i określa proliferacje komórek testowych na podstawie inkorporacji znakowanej tymidyny;
oznaczanie aktywności cytotoksycznej komórek: ogólna zasadą tych testów jest inkubacja komórek atakujących (efektorowych) z atakowanymi (docelowymi), a następnie ocena liczby uszkodzonych komórek:
metodą morfologiczną - dodając błękit trypanu wychwytywany jedynie przez komórki martwe, i dokonując pomiaru spektrofotometrycznego;
metodą izotopową - przed inkubacją znakuje sie komórki docelowe izotopem chromu, a po reakcji ocenia się radioaktywność supernatantu
Szczegółowe warunki przeprowadzania testu zależy od rodzaju badanych komórek efektorowych, np.:
komórki K - przeprowadza sie test ADCC (antibody dependent cellular cytotoxicity), w którym komórki docelowe (erytrocyty ludzkie/baranie lub komórki nowotworowe) muszą byc dodatkowo wstępnie opłaszczone przeciwciałami IgG3;
makrofagi, neutrofile - należy najpierw przeprowadzić inkubację komórek efektorowych z zawiesiną zabitych bakterii;
komórki NK - jako komórki testowe stosuje się komórki linii ludzkiej białaczki erytroleukemicznej K 562.
Cytofluorymetria przepływowa - słuzy do wieloparametrowej oceny komórek znajdujacych się w zawiesinie, które są kierowane do kanału w strumieniu cieczy formowanym siłami hydrodynamicznymi (warunki przepływu dobrane tak, by komorki przepływały pojedynczo). Wiązka światła (niebieskie lub ultrafioletowe) oswietla komórki i wzbudza fluorescencje, jeśli były one wyznakowane znacznikami fluorescencyjnymi. Detektory odbierają światło ugięte, rozproszone i fluorescencyjne. Każda komórka może mieć zmierzone takie parametry jak ugięcie światla na jej brzegach, rozproszenie swiatła na jej strukturach wewnątrzkomórkowych czy natężenie fluorescencji, którego źródłem moze być:
autofluorescencja - stosunkowo wysoka w komórkach martwych
sondy - służące do pomiarów zawartości DNA i RNA w komórce (stosuje się jako barwniki różową fikoerytrynę, fioletową fikocyjaninę i zieloną allofikocyjaninę; do oznaczania DNA stosowany jest jodek propydyny)
Cytometria przepływowa jest najszybszą metodą służącą do oceny immunofenotypu komórek (umożliwia jakościwą ocenę antygenową).
Cytometr mierzy takie wartości jak:
Forward Scatter FSC → względną wielkość komórek
Side Scatter SSC → ziarnistość
FLX → intensywność fluorescencji
Ocena stanu układu immunologicznego pacjenta in vivo:
odczyn tuberkulinowy Mantoux - polega na śródskornym wstrzyknięciu roztworu tuberkuliny i obserwacji reakcji skórnej (wynik dodatni to naciek o średnicy powyżej 7mm - świadczy o braku istotnych zaburzeń w odporności komórkowej pacjenta);
próby skórne - z zastosowaniem roztworów danych alergenów:
metoda skaryfikacyjna - na naskórku umieszcza się kroplę alergenu i skaryfikuje igłą, ale tak by nie spowodować krwawienia (wynik dodatni gdy bąbel przekracza 2mm, a rumień 5mm);
metoda śródskórna - roztwór alergenu wstrzykujemy śródskórnie a wynik oceniamy po 15 min (reakcja natychmiastowa) i 24 godzinach (reakcja późna); metoda ta polecana jest przy testowaniu alergenów pokarmowych.
próby prowokacyjne - bezpośrednia ekspozycja pacjenta na alergen:
próba nosowa - roztwór umieszcza sie na błonie sluzowej jamy nosowej i ocenia zmiany miejscowe (obrzęk, zblednięcie) i reakcje obronne (kichanie, swędzenie)
próba oskrzelowa - roztwór podaje się drogą wziewną i ocenia się maksymalną objętość wydechową sekundową (FEV1); próbę ocenia się jako dodatnią, gdy wziewanie alergenu powoduje spadek FEV1 o conajmniej 20%.
10