Analiza instrumentalna - seminaria

Procedura walidacji:

- gdy ustawia się nową metodę oznaczania składnika

- wprowadzanie modyfikacji

- może być zlecona po kontroli jakości

Metody analityczne - czynności wykonywane żeby ocenić jakość lub ilość analitu obecnego w próbce

przygotowanie pomiar obróbka wyników

Walidacja - proces, którego celem jest doświadczalne udowodnienie, że metoda jest odpowiednia do postawionego celu, a wyniki są w pełni wiarygodne

etapy:

- określenie oczekiwań stawianych metodzie (specyfikacja wymagań)

- wyznaczenie doświadczalnie parametrów charakteryzujących metodę testowaną:

+ dokładność metody

+ precyzja

+ powtarzalność

+ odtwarzalność

+ odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna (precyzja pośrednia)

+ zakres liniowości met. zakres stosowalności

+ czułość metody

+ granice met. (wykrywalność i oznaczalność)

+ oszacowanie selektywności i stabilności metody

powtarzalność + odtwarzalność + odtwarz. wewnątrzlab. bezpośrednio związane z precyzją

- porównanie wyników z oczekiwaniami

- wniosek co do przydatności wyników raport walidacyjny

Wyznaczanie dokładności metody:

- obliczenie błędu względnego, bezwzględnego

- certyfikowany materiał odniesienia - zawiera dokładnie ten sam analit (y), który występuje w próbkach rzeczywistych, stężenie jest ściśle określone, ma bardzo zbliżoną lub identyczną z próbkami matrycę

- serostandardy - surowica upodobniona pod względem normy lub patologii do ludzkiej

- analiza materiału odniesienia

- próbka rzeczywista i porównanie z wynikami dla tej samej próbki, ale inną metodą (met. odniesienia, daje bardzo zbliżone wyniki do rzeczywistego)

- wyznaczenie odzysku analitu w % - Y_B (sygnał próbki badanej) dodanie analitu do próbki - Y_B+S Y_B+S-Y_B=Y_S z krzywej kalibracyjnej stężenie analitu (c_s) odzysk:
; metody dokładne: R=95-105%

Precyzja metody

- odchylenie standardowe, współczynnik zmienności

- jeśli odchylenie standardowe dla danej próbki przez tę samą osobę, z tymi samymi odczynnikami, na tym samym sprzęcie, wykalibrowanym jednokrotnie, w krótkich odstępach czasu jest małe = wysoka powtarzalność metody (precyzja metody w warunkach identycznych) próbka musi być stabilna

- jeśli wyniki uzyskane w jednym laboratorium przez dwie osoby (lub dwa sprzęty, dwie serie odczynników) są porównywalne = wysoka powtarzalność wewnątrzlaboratoryjna

- jeśli dwie placówki do oznaczania parametrów stosują tą samą metodę wyniki powinny być podobne = wysoka odtwarzalność

Do reszty parametrów niezbędne wykreślenie krzywej kalibracyjnej

Jeśli krzywą wyznacza się przez maksymalny zakres stężeń można określić liniowość

Zakres liniowości powinien pokrywać się z oczekiwanym zakresem oznaczeń

Nachylenie krzywej - miara czułości metody

czułość:

α - współczynnik kierunkowy prostej

Im metoda bardziej czuła, tym niższe stężenie można nią oznaczać i wykrywać (niższe granice oznaczalności i wykrywalności

Granica wykrywalności - najmniejsze stężenie lub ilość analitu w próbce wykrywane daną metodą (odróżnia sygnał dawany przez próbkę od dawanego przez próbę ślepą) Y_DL=Y_Ø+3SD_Ø

LOD= granica wykrywalności = DL

Jeśli w danej metodzie instrumentalnej można zarejestrować bazową linię szumów, to sygnał który daje próbka o stężeniu = LOD jest 3 razy większy od średniego poziomu szumów aparatury:
; S - sygnał, N - szum

Granica oznaczalności - najmniejsze stężenie lub ilość które można oznaczyć daną metodą z wymaganą dokładnością i precyzją

S/N=10

kilka roztworów wzorcowych zawierających analit o bardzo niskich stężeniach, dla każdego sześciokrotny pomiar

współczynnik zmienności (CV%), na wykresie zależność między CV% a c_w

zwykle dla CV=10%=LOQ

zakres wykrywalności + zakres oznaczalności = zakres stosowalności

zakres liniowości = z. wykrywalności + z. oznaczalności + od c₀ do LOD

Jeśli w danej metodzie sygnał daje 1 związek - metoda idealnie selektywna = specyficzna; pozwala na dokładne i precyzyjne oznaczenie analitu w każdych warunkach; nie ma interferencji; im więcej możliwych interferencji, tym mniej selektywna metoda

Stabilność metody - zależy od stabilności odczynników i stabilności próbki

odczynniki powinny być stabilne przez conajmniej 48 h - zmiana nie większa niż 2%

Absorpcjometria

A = εcb

A = log I₀/I

T = I/I₀

A = -log T = log 1/T

Współczynnik k -współczynnik absorpcji - miano i wartość liczbowa zależy od jednostek w jakich wyrażone jest stężenie

Przy stężeniu mol/dm³ ε przyjmuje nazwę molowego współczynnika substancji, liczbowo równy absorpcji jaką wykazuje roztwór 1M w grubości warstwy 1 cm

Gdy stężenie wyrażone w g/dm³ przyjmuje nazwę właściwego współczynnika absorpcji (a) A = acb

A jaką wykazuje roztwór o c=1g/dm³ w grubości warstwy 1 cm

Oznaczanie stężenia składników w mieszaninie 2 i wieloskładnikowej

Interpretacja widm w podczerwieni

- widma oscylacyjno-rotacyjne

- informacja o konformacji strukturalnej

- można zaklasyfikować związek do klasy

- można porównać widmo próbki z widmem wzorcowym (widma biblioteczne)

- 2,5 - 25 µm

- liczba falowa: ilość fal o określonej długości, mieszczące się w 1 cm

[cm^-1]

im niższa energia, tym mniejsza
, im dłuższa λ, tym mniejsza

pasmo tym intensywniejsze im niższa wartość T na szczycie tego pasma (bo im ↑ A, tym ↓ T)

- wzrost energii oscylacji - promieniowanie podczerwone o odpowiedniej energii zwiększa amplitudę oscylacji

- nie wszystkie oscylacje są aktywne w IR, tylko te, które łączą się ze zmianą momentu dipolowego cząsteczki

cząsteczka H₂O - cząst. nieliniowa, złożona z 3 atomów (n=3), liczba drgań podstawowych: 3n-6=3

wszystkie drgania aktywne w IR

drgania: rozciągające symetryczne, rozciągające asymetryczne, deformacyjne wody nie stosuje się jako rozpuszczalnika kuwety z kryształów jonowych (halogeny metali alkalicznych)

rozpuszczalniki - rozpuszczalniki organiczne:

- czterochlorek węgla

- dwusiarczek węgla

- chloroform

f: stała siłowa wiązania

M_red: masy zredukowane atomów o masach m₁ i m₂

E_osc jest tym większa, im większa jest f i M_red mniejsza

drgania charakterystyczne - drgania słabo sprzężone z drganiami atomów tworzących wiązania sąsiednie, tzn. że wkład oscylacji danej grupy atomów w określone drganie jest dominujący (a pozostałej części cząsteczki znikomy); już w spoczynku charakteryzuje je wysoka E_osc

- drgania rozciągające wiązania wielokrotne (duża stała siłowa)

- drgania wiązań O-H, N-H, C-H, S-H (mała M_red)

Jeżeli w cząsteczce występują drgania charakterystyczne to pasma im odpowiadające pojawiają się przy bardzo wysokich wartościach liczb falowych

Drgania charakterystyczne dla określonego ugrupowania atomów występują w tym samym, wąskim przedziale częstości (przedział liczb falowych), niezależnie od struktury reszty cząsteczki częstości charakterystyczne/częstości grupowe; można zidentyfikować cząsteczki danego związku

- C=O 1850-1540 cm^-1

- O-H 3700-3200 cm^-1

- CΞC 2260-2100 cm^-1

- CΞN 2260-2215 cm^-1

- C=C w ukł. aromatycznych

1626-1575 i 1525-1440 cm^-1

Zakres 3700-1500 - obszar grup funkcyjnych - stosunkowo mało pasm, pasma odpowiadające drganiom charakterystycznym

Zakres 1300-700 - obszar daktyloskopowy - układ pasm jest tak charakterystyczny jak odciski palców

Reguły interpretacji widm IR:

- poszukujemy pasma odpowiadającego grupie karbonylowej (1850-1540) zwykle najbardziej intensywne pasmo w widmie

- jeśli jest obecne, poszukujemy innych pasm związanych z grupami funkcyjnymi zawierającymi wiązania C=O:

+ kwasy karboksylowe: drgania rozciągające wiązanie O-H, bardzo szerokie pasmo z max przy ok 3000

+amidy: drgania rozciągające wiązania N-H (ok 3400) pasmo nie tak szerokie jak O-H; drgania rozciągające wiązanie C=O (1690-1630) = I pasmo amidowe; drgania deformujące wiązania N-H (1620-1540, w zależności od rzędowości) = II pasmo amidowe

+ estry: drgania rozciągające wiązania C-O (1260-1000)

+ aldehydy: drgania rozciągające wiązania C-H w grupie aldehydowej = 2 słabe pasma ok 2850 i 2750

- jeżeli w widmie nie ma pasma karbonylowego, ale występuje szerokie i intensywne pasmo przy ok 3400 (O-H) oraz pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym C-O alkohol

- obecność pasma odpowiadającego drganiom rozciągającym i deformacyjnym wiązań N-H: amina

- obecność pasm odpowiadającym drganiom rozciągającym wiązania C-O eter

- czy są wiązania podwójne i pierścienie aromatyczne

- czy są wiązania potrójne

- czy jest grupa nitrowa

- itd. ;P

Techniki fluorescencyjne w analizie zw. biologicznie czynnych

Fluorofor - część cząsteczki odpowiedzialna za fluorescencję, najczęściej grupa funkcyjna zdolna do absorpcji energii o określonej λ, a potem do emitowania innej λ (ściśle określonej). Ilość energii oraz λ emisji zależy od właściwości fluoroforu, ale również od środowiska chemicznego w jakim działa (pH, siły jonowe)

Fluorofory jako znaczniki - FITC, TRITC Cy5, hydroksykumaryna

Fluorofory wiążące się z kwasami nukleinowymi

Znaczniki fluorescencyjne - syntetyczne barwniki fluorescencyjne (fluorofory), charakteryzujące się dużą wydajnością kwantową fluorescencji, wykazujące reaktywność względem określonych grup (np. aminowej, tiolowej). Daje to możliwość znakowania niefluoryzujących związków (np. leków, białek, DNA) w celu ich detekcji

Sondy fluorescencyjne - lokalizują się w specyficznym rejonie biologicznym obiektu lub odpowiada na specyficzny czynnik stymulujący

- znaczniki fluorescencyjne - np. ANS, TNS

- fluoryzujące barwniki związane z oligonukleotydami, np. sondy hybrydyzujące do ilościowej PCR

- fluoryzujące barwniki związane z przeciwciałami

- słabo fluoryzujące barwniki, stające się fluoroforami o wysokiej φ gdy zwiążą się z określonymi docelowymi molekułami

- niefluoryzujące barwniki - przekształcenie we fluoryzujące na drodze enzymatycznej

- związki wchodzące w skład żywych organizmów - tryptofan, tyrozyna, fenyloalanina

Fluorescencyjne sondy molekularne - fragmenty genomowego DNA

Fluorescencyjne przeniesienie energii (FRET) - badanie struktury (np. białek) i dynamiki cząstek biologicznie czynnych, odległości między elementami; przeniesienie energii od wzbudzonego donora do niewzbudzonego akceptora energii

Zastosowanie sond fluorescencyjnych

- analiza ekspresji genów

- detekcja i oznaczanie białek DNA, RNA

- analiza przeżywalności komórek

- badanie proliferacji

- detekcja stresu oksydacyjnego

- analiza aktywności enzymów

- analiza struktur błon komórkowych

- jako indykatory pH (np. w kompartmentach komórkowych)

Jonoselektywne elektrody membranowe (ISE)

- potencjometria bezpośrednia w diagnostyce laboratoryjnej

- oznaczanie stężenia elektrolitów w płynach ustrojowych

- kationy: H, K, Ca, Mg, NH₄

- aniony: F, Cl, HCO₃

Ogniwo pomiarowe

- elektroda pomiarowa - potencjał elektrody zależy od aktywności jonu oznaczanego w roztworze badanym

- elektroda odniesienia - potencjał stały w warunkach pomiaru

SEM ogniwa zanurzonego w roztworze badanym zależy od aktywności (stężenia) jonów oznaczanych

Elektrody pomiarowe - ISE

cecha wspólna - obecność membrany selektywnie oddziałującej z oznaczanymi jonami, to oddziaływanie jest źródłem potencjału elektrycznego elektrody

Rozwiązania konstrukcyjne

wewnętrzna powierzchnia membrany styka się:

- z roztworem wewnętrznym (ciecz lub żel), w którym zanurzona jest elektroda wyprowadzająca (najczęściej chlorosrebrowa), zawiera on jony na które czuła jest dana ISE oraz jony, na które reaguje elektroda wyprowadzająca

- bezpośrednio z przewodem wyprowadzającym

- ze stałą warstwą pośrednią między membraną a przewodem wyprowadzającym

Zalety potencjometrii bezpośredniej z wykorzystaniem ISE

- szeroki zakres prostoliniowości

- bardzo niskie granice oznaczalności

- wysoka selektywność - umożliwia wykrycie jonu w środowisku wieloelektrolitowym

Podział ISE

- z membranami stałymi

- z membranami ciekłymi

- z membranami podwójnymi (enzymatyczne i gazowe)

Membrany stałe

- szkło o składzie warunkującym o czułości elektrody na określone kationy (K, H, Na, Li, NH₄)

- nieorganiczne sole (halogenki, siarczki) w formie monokryształów, sprasowanego materiału krystalicznego lub rozpuszczonego w obojętnej matrycy (żywica silikonowa)

+ fluorek lantanu - el. czuła na aniony F

+ halogenek srebra - Ag, Cl, I, Br

+ siarczek srebra - Ag, aniony siarczkowe

+ siarczek srebra + siarczki metali ciężkich - jw. i Pb, Hg, Cd

Membrany ciekłe

- obojętna chemicznie porowata matryca (PCV, octan celulozy, polietylen, żywica silikonowa, materiał ceramiczny) zwilżony rozpuszczalnikiem organicznym, zawierającym hydrofobowy związek oddziaływujący z oznaczanym jonem (kationit, anionit, związek kompleksujący, obojętny nośnik = jonofor) np. membrana z PCV impregnowana antybiotykiem walinomycyną = ISE na K⁺

walinomycyna - jonofor zdolny do selektywnego wiązania kationów K i przenoszenia ich przez błony biologiczne

Membrany podwójne

- enzymatyczne (na mocznik)

- gazowe (oznaczanie CO₂ fizycznie rozpuszczonego we krwi)

ISE do oznaczania mocznika w płynach ustrojowych

- elektroda szklana czuła na NH₄⁺, pokryta warstwą membrany zawierającą enzym ureazę

- pod wpływem ureazy zawarty w próbce mocznik ulega rozkładowi z wytworzeniem jonów NH₄⁺, których stężeniu odpowiada stężenie mocznika, a na które reaguje zmianą potencjału elektroda szklana

Elektroda do oznaczania CO₂ we krwi

- elektroda szklana, czuła na H⁺, umieszczona w zbiorniczku wypełnionym buforem o ściśle określonym pH

- dno stykające się z próbką stanowi membrana z teflonu lub polietylenu przepuszczalna dla CO₂

- gaz dyfunduje do wnętrza zbiornika z buforem, zmieniając jego pH, co rejestruje elektroda szklana

- CO₂+2H₂OH⁺+HCO₃^-

Selektywność ISE

- nie są idealnie selektywne - na wartość ich potencjału może wpływać obecność innych jonów w roztworze badanym

- miarą selektywności ISE jest wartość współczynnika selektywności K, określany względem konkretnego jonu interferującego

- im niższa wartość K, tym ISE bardziej selektywna

- współczynnik K informuje ile razy stężenie jonu interferującego musi być wyższe od stężenia jonu oznaczanego, aby spowodować 100% błąd oznaczenia, tzn. by potencjał wywołany przez jon interferujący był równy potencjałowi wywołanemu przez jon oznaczany, np. K=0,0001 oznacza, że stężenie jonu int. musi być 10000 razy wyższe od oznaczanego by wytworzyć taki sam potencjał elektrody

Potencjał ISE

Wzór Nernsta

E: potencjał elektrody

E₀: potencjał normalny elektrody

z: wartościowość jonu

+ dla kationów, - dla anionów

Czułość ISE

- informuje w jakim kierunku i o ile zmieni się potencjał ISE (=SEM ogniwa) jeśli stężenie oznaczanego jonu wzrośnie 10 razy

- dla kationów wzrost SEM o S

- dla anionów spadek SEM o S

- im większa bezwzględna wartość S, tym ISE bardziej czuła

- czułość ISE zmniejsza się ze wzrostem wartościowości jonu:

z=1: S=0,059 V=59 mV

z=2: S=0,059/2 V=29,5 mV

- teoretyczna wartość S niemal zawsze różni się od wartości rzeczywistej, której miarą jest nachylenie charakterystyki ISE

- charakterystyka ISE: wykres zależności SEM ogniwa pomiar zestawionego z testowaną ISE i elektrody odniesienia od stężenia oznaczanego jonu (logc lub pc) = krzywa kalibracyjna ISE

- równanie prostej opisuje prostoliniowy odcinek krzywej kalibracyjnej

A: potencjał formalny ISE wyznaczany względem elektrody odniesienia, stała dla danego ogniwa, pomiar obejmuje potencjał normalny ISE i potencjał elektrody odniesienia

- dla kationów: wzrost stężenia powoduje wzrost SEM ogniwa pomiarowego

- dla anionów: wzrost stężenia powoduje spadek SEM

- wzrost stężenia = wzrost wartości logc, ale spadek wartości pc

Biosensory = bioczujniki = czujniki biologiczne

- miniaturowe (skala mikro lub nano) przyrządy stosowane w analityce medycznej, biotechnologii, ochronie środowiska, w celu wykrywania lub oznaczania ilościowego określonych substancji w badanych materiałach (np. metabolitów w płynach ustrojowych)

Budowa i zasada działania

- reakcja analitu z warstwą receptorową generuje sygnał, który zostaje przekształcony przez element przetwarzający biosensora na sygnał analityczny (najczęściej elektryczny) podlegający wzmocnieniu i rejestracji

- na podstawie wielkości zarejestrowanego sygnału wnioskujemy o stężeniu analitu w próbce badanej

Zalety biosensorów:

- wysoka selektywność

- wysoka czułość

- szybkość i prostota oznaczania

Warstwa receptorowa = materiał aktywny biologicznie odpowiadający za selektywność biosensora

- immobilizowany enzym

- przeciwciała monoklonalne

- żywe mikroorganizmy (cell biochip)

- organelle komórkowe

- tkanki roślinne i zwierzęce

Ze względu na sposób przekształcania sygnału

- potencjometryczne

- amperometryczne

- optoelektroniczne (optyczne)

- tranzystorowe

- termistorowe (opornik półprzewodnikowy)

- piezoelektryczne

Biosensory enzymatyczne

- bardzo wysoka selektywność w stosunku do substratu

- procedura immobilizacji na powierzchni sensora musi gwarantować utrzymanie wysokiej aktywności biologicznej enzymu

Metody immobilizacji

- chemiczne (kowalencyjne) lub fizyczne związanie bezpośrednio z powierzchnią sensora

- fizyczne lub chemiczne unieruchomienie w inertnej matrycy (np. białkowej, żelowej, polimerowej)

Użyteczny czas życia warstwy enzymatycznej zależy od odporności enzymu i matrycy, w której jest immobilizowany

Biosensory mikrobiologiczne

- wykorzystują naturalną aktywność biokatalityczną żywych komórek bakterii (zawartych w nich enzymów)

- bakterie fizycznie wiązane z powierzchnią sensora przez unieruchomienie za pomocą mikroporowatej membrany, przepuszczalnej dla oznaczanych związków

- duża czułość

- mała selektywność (komórki zawierają wiele różnych enzymów = źródło interferencji)

- długi czas odpowiedzi

- wrażliwość na obecność w analizowanej próbce związków wpływających na szybkość metabolizmu komórek bakterii = możliwość wykorzystywania do oznaczania trucizn i mutagenów

Biosensory tkankowe

- cienki plaster tkanki lub izolowane organelle komórkowe umieszczone na końcówce sensora i zabezpieczone porowatą membraną

- lepsza selektywność w porównaniu z biosensorami bakteryjnymi

- dłuższy czas życia niż biosensory enzymatyczne

- długi czas odpowiedzi

Immunosensory

- oparte na selektywnym oddziaływaniu przeciwciała z antygenem z wytworzeniem stabilnego termodynamicznie kompleksu (specyficzność detekcji)

- jako warstwę receptorową biosensora można wykorzystać oba składniki kompleksu

- zwykle pośredni typ detekcji, wymagający zastosowania znaczników (np. fluorescencyjnych), umożliwiających śledzenie reakcji wiązania analitu z receptorem

Biosensory z przetwornikami potencjometrycznymi

- warstwa receptorowa to immobilizowany enzym

- przetworniki ISE czułe na jony, których stężenie w próbce zmienia się w wyniku reakcji enzymatycznej (często elektroda szklana)

Biosensory do oznaczania mocznika

mocznik+H₂Oamoniak+CO₂

- warstwa receptorowa: immobilizowana ureaza

- przetworniki:

ISE czuła na jony amonowe lub wodorowe (zmiany pH)

elektroda gazowa czuła na CO₂ lub amoniak

czuły na jony wodorowe tranzystor polowy ISFET

Chromatografia

- parametry retencji

- ocena sprawności kolumny chromatograficznej

Współczynnik podziału - decyduje o szybkości zatrzymywania substancji w kolumnie

lub

Parametry retencji

t_r - całkowity czas retencji

t₀ - zerowy (martwy) czas retencji

t'_r - zredukowany czas retencji

t'_r=t_r-t₀

W_b - szerokość piku u podstawy

h - wysokość piku

V_r=t_rF

F - objętościowa prędkość przepływu fazy ruchomej przez kolumnę [ml/min]

Parametry do oceny sprawności i selektywności kolumny

H - wysokość równoważna półce teoretycznej (WRPT) - im mniejsza tym lepiej

N - liczba półek teoretycznych - im wyższa tym lepiej

N_ef - liczba półek teoretycznych efektywna

Sprawność kolumny = N∙100/L liczba półek przypadających na 1 metr kolumny

R_s - zdolność rozdzielcza - optymalna wartość >1,2

A- składnik eluowany jako pierwszy

B- składnik eluowany jako drugi

Analiza ilościowa w chromatografii kolumnowej

Chromatografia jest jedną z niewielu metod analitycznych, które umożliwiają wykonanie analizy jakościowej i ilościowej złożonych mieszanin w jednym procesie

O ilości substancji w mieszaninie można wnioskować na podstawie wielkości piku, bo wysokość (h) lub częściej powierzchnia piku (S) są proporcjonalne do ilości oznaczanego składnika

S=h∙W_1/2 lub S=0,5h∙W_b

S=AUP (area under peak)

Współczynnik korekcyjny względny (f)

- pozwala na skorygowanie błędu że równe masy różnych substancji nie zawsze dają jednakowe pole powierzchni piku (błąd wynikający np. z różnic we wskazaniach detektora)

- współczynnik korekcyjny - liczba przez którą trzeba pomnożyć S związku i, aby skorygowana wartość powierzchni była wprost proporcjonalna do masy związku

- wartość współczynnika korekcyjnego można zaczerpnąć z literatury lub wyznaczyć empirycznie

- jak nie ma możliwości wyznaczenia f, wtedy dla wszystkich związków f=1

Wyznaczanie f

- jako substancję porównawczą przyjmuje się główny składnik badanej próby, jego f=1

- sporządzamy mieszaninę wzorcową złożoną z równych mas wszystkich składników (i) analizowanej próbki

- f wyznacza się ze wzoru:
, gdzie S_w - S piku oznaczanego składnika, S_i - S piku wzorca

Współczynnik korekcji charakterystyczny dla substancji (stf)

- substancją porównawczą jest benzen, dla którego stf=1

S_i∙stf - skorygowana wartość powierzchni piku odpowiadającej masie substancji i

Istota chromatograficznej analizy ilościowej - porównanie wielkości piku oznaczanego składnika (i) z wielkością piku odpowiadającą znanej ilości tego składnika w postaci substancji wzorcowej (w)

Metody

- normalizacji wewnętrznej

- wzorca zewnętrznego (krzywa kalibracji)

- wzorca wewnętrznego

+ wzorcem analizowana substancja

+ wzorcem substancja nieobecna w próbie analizowanej

często wzorzec = standard

Normalizacja wewnętrzna

- na chromatogramie muszą znajdować się piki odpowiadające wszystkim składnikom obecnym w próbce

- mierzy się powierzchnie wszystkich pików i sumuje suma=100%

- znając pole powierzchni piku oznaczanego składnika można obliczyć jego % zawartość w próbce

Metoda kalibracji bezwzględnej

- nie wszystkie składniki obecne w próbce są zaznaczone w postaci pików

- dla badanego składnika sporządza się 3-5 roztworów wzorcowych o różnych stężeniach, wzorzec musi odpowiadać składnikowi oznaczanemu

- kilka razy wykonuje się analizę chromatograficzną tych roztworów i oblicza średnią powierzchnię pików

- sporządzenie krzywej kalibracji, prosta regresji, równanie regresji

Metoda wzorca wewnętrznego - gdy wzorcem substancja nieobecna

- stosuje się wzorzec zbliżony strukturalnie do związku obecnego w próbce, warunkiem jest rozdzielenie się wzorca i analizowanego składnika (i) podczas rozdziału chromatograficznego

- przygotowuje się roztwór kalibracyjny zawierający mniej więcej równe ilości wzorca oznaczanego składnika (wi) oraz wzorca wewnętrznego (ww) roztwór posłuży do wyznaczenia współczynnika odpowiedzi (rf)

- do dokładnie znanej ilości próby badanej dodaje się wzorca wewnętrznego w takiej samej ilości jak w roztworze kalibracyjnym

Wyznaczenie współczynnika odpowiedzi i obliczenie stężenia oznaczanego składnika w próbce

- współczynnik odpowiedzi dla roztworu kalibracyjnego:

- opisując tę zależność dla próbki badanej:

Metoda wzorca wewnętrznego gdy wzorcem jest analizowana substancja

- wykonuje się dwa chromatogramy:

1 - badana próbka

2 - badana próbka do której dodano ściśle określoną ilość wzorca, będącego jednocześnie analizowaną substancją

- przyrost odpowiedzi detektowanej dla analizowanego składnika jest proporcjonalny do ilości dodanego wzorca

- mierzy się powierzchnię piku analit-wzorzec (A) oraz innego analizowanego składnika (B), w próbce bez dodanego wzorca i próbce z dodatkiem wzorca

- dla próbki bez dodanego wzorca:

- dla próbki z dodatkiem wzorca:

Chromatografia powinowactwa (AC)

- rodzaj chromatografii adsorpcyjnej, wykorzystującej wzajemne powinowactwo substancji rozpuszczonej w fazie ruchomej i liganda unieruchomionego na nierozpuszczalnym nośniku

- efekt: specyficzne i odwracalne związanie obu elementów bez utraty ich aktywności

- zastosowanie: izolacja i oczyszczanie wielu biologicznie aktywnych molekuł (białka, kwasy nukleinowe)

Zalety

- bardzo wysoka specyficzność

- bardzo wysoki stopień czystości izolowanych cząstek

- silne zatężenie izolowanych cząstek

- brak ograniczeń co do objętości i stężenia próbki

Wady

- trudności w uzyskaniu odpowiedniego liganda

- często konieczność samodzielnego przygotowania złoża

- nietrwałość pewnych ligandów

Typy oddziaływań

- enzym-substrat

- enzym-inhibitor

- enzym-koenzym

- hormon-receptor (lub białko transportujące)

- przeciwciało-antygen

- przeciwciało z grupy IgG-dopełniacz

- kwasy nukleinowe-białka (polimerazy, histony)

- komplementarne odcinki kwasów nukleinowych

- lektyny-glikoproteiny, polisacharydy

- jony metali-białka (poprzez reszty His, Cys, Tyr i Trp)

- barwniki-białka

Nie ma znaczenia którą cząstkę danej pary weźmiemy jako ligand

Strategie rozdziału:

AC-positive mode - z ligandem łączy się cząsteczka nas interesująca (izolacja, oczyszczanie)

AC-negative mode - z ligandem łączą się zanieczyszczenia

Przygotowanie kolumny

biosorbent = nośnik + ligand wiązanie kowalencyjne

Nośnik (matryca)

- obojętny fizycznie i chemicznie (niska adsorpcja niespecyficzna)

- stabilny w stosowanych warunkach rozdziału chromatograficznego (odporny na niskie i wysokie pH, obecność detergentów itp.)

- duża powierzchnia wiązania liganda (porowatość)

agaroza, celuloza, dekstran, poliakrylamid

Przygotowanie biosorbenta

- aktywacja nośnika - derywatyzacja grup funkcyjnych nośnika celem umożliwienia kowalencyjnego związania liganda

- przyłączenie cząsteczek liganda w sposób warunkujący zachowanie jego aktywności bilogicznej

Odczynniki aktywujące:

dla ligandów z grupą aminową:

- bromocyjan (CNBr)

- kwas 6-aminoheksanowy

- nadjodan

dla ligandów z grupą OH:

- tiole (najczęściej glutation)

Sposób wiązania ligandów

- białka: grupy aminowe, karboksylowe (reszty Glu, Asp), sulfhydrynowe (reszty Cys), hydroksylowe (reszty Tyr, Ser, Thr)

- kwasy nukleinowe: grupy enolowe zasad azotowych, reszty fosforanowe

- cukry lub reszty cukrowe glikoprotein: grupy hydroksylowe

Grupa dystansowa

dla niskocząsteczkowych ligandów (koenzymy, hormony) = lepsze wiązanie, eliminacja efektów sterycznych

Ligandy monospecyficzne

- wiążą się tylko z jednym konkretnym związkiem

- przykłady: antygeny, przeciwciała, hormony, receptory, enzymy

Ligandy grupowospecyficzne

- wiążą się z określoną grupą związku docelowego

- awidyna (postać monomeryczna) lub jej pochodne: biotyna, biotynylowane przeciwciała

- heparyna: białka osocza, enzymy, czynniki krzepnięcia, czynniki wzrostu, proteazy, lipazy, cytokiny

- lektyny: glikoproteiny i inne glukokoniugaty

α

ΔY

Δc

Y

c

CV%

c

Y_Ø

Y_DL

Y_QL

Y_max

c₀

LOD

LOQ

c_max

zakres wykrywalności metody

zakres oznaczalności metody

stężenie analitu poniżej granicy wykrywalności

stężenie analitu poniżej granicy oznaczalności

górna granica liniowości metody

substancja oznaczana

element przetwarzający (sensor, czujnik)

sygnał

rejestracja i przetwarzanie sygnału

biologiczny element detekcyjny (receptor) => biosensor

t₀

t'_r

t_r

W_1/2

W_b

t (min)

h

h_1/2

---