Ćwiczenie 3: Elektroforeza białek w denaturującym żelu poliakrylamidowym

Część teoretyczna do kolokwium:

metody elektroforezy białek (elektroforeza natywna, w żelu denaturującym, ogniskowanie izoelektryczne, elektroforeza dwukierunkowa), zadania rachunkowe.

Materiały i odczynniki:

Preparaty z ekstraktów cytoplazmatycznych i jądrowych izolowane na ćwiczeniu 1

Preparaty z izolacji białek wiążących DNA (wszystkie frakcje) z ćwiczenia 2

Żel rozdzielający 12%

H2O	2.12 ml
1M Tris:HCl pH 8.8	2.63 ml
40% akrylamid	2.1 ml
20% SDS	35 l
10% APS	70 l
razem:	7 ml

Żel zagęszczający 6%, 2 ml:

H2O	1.47 ml
1M Tris:HCl pH 6.8	250 μl
40% akrylamid	254 μl
20% SDS	10 μl
10% APS	20 μl
razem:	2 ml
dodać TEMED	2 μl

Bufor obciążający 6x stężony:
60% glicerol; 300 mM Tris:HCl pH 6.8; 12 mM EDTA; 12% SDS; 864 mM 2-merkaptoetanol; 0.05% błękit bromofenolowy

Bufor do elektroforezy:
192 mM glicyna; 0.1% SDS; 25 mM Tris:HCl pH 8.3

Markery białkowe „prestained”(Fermentas)

Barwnik do żelu:

0,25 g Coomassie Blue R; 45 ml H₂O; 45 ml metanolu; 10 ml kwasu octowego 99.9%

Odbarwiacz do żelu:

750 ml H₂O; 150 ml metanolu; 100 ml kwasu octowego 99.9%

WYKONANIE:

Przygotowanie żelu i prób do elektroforezy

Uwaga! Niespolimeryzowany akrylamid jest trujący - należy bezwzględnie używać rękawiczek (obu!) i nie rozlewać roztworów.

1. Wylewanie żelu

1. Złożyć szyby - jedna zawierająca odstępniki, druga gładka - spiąć klipsami
   i zamocować na podstawce. Włożyć grzebień
   i zaznaczyć pisakiem granicę żelu rozdzielającego
   na 0.5 cm od dolnej granicy grzebienia.
   

2. Przygotować wg. instrukcji 7 ml 12% żelu żelu poliakrylamidowego bez dodatku TEMED. Przenieść do osobnej probówki 1 ml roztworu, dodać 2 μl TEMED, wylać przy pomocy pipety automatycznej (1000 μl) pomiędzy szyby. Odczekać aż spolimeryzuje.

3. 
   Do pozostałej mieszaniny dodać 4 μl TEMED, od razu wylać pomiędzy szyby
   do zaznaczonego poziomu. Na powierzchnię niespolimeryzowanego żelu nanieść bardzo ostrożnie 1 ml H₂O. Pozostawić do spolimeryzowania.

4. Przygotować 2 ml żelu zagęszczającego wg. instrukcji, bez dodatku TEMED. Po spolimeryzowaniu żelu rozdzielającego, wylać wodę i wysuszyć szyby bibułą. Do przygotowanego żelu dodać 2 μl TEMED, od razu wylać pomiędzy szyby do utworzenia menisku wypukłego, włożyć delikatnie grzebień tak, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza. Pozostawić do spolimeryzowania.

prawidłowo wylany żel

2. Przygotowanie preparatów (w czasie oczekiwania na spolimeryzowanie żelu)

WSZYSTKIE PROBÓWKI MUSZĄ BYĆ PODPISANE!

Podpisać probówki numerami 1-7. Z preparatów EC (ekstrakt cytoplazmatyczny) i EJ (ekstrakt jądrowy) pobrać po 20 μg białka (obliczyć na podstawie oznaczonych stężeń) do osobnych ependorfów (nr 1 i 2). Jeżeli brak preparatów własnych, należy poprosić o odpowiednią ilość ekstraktu u prowadzącego ćwiczenia. Preparat EC uzupełnić 1 M NaCl tak, aby końcowe stężenie NaCl wynosiło 0,2 M, w razie potrzeby dodać 0.2 M NaCl (objętość końcowa = 15 l). Preparat EJ uzupełnić wodą i 0.2 M NaCl do takich samych warunków. Do osadu białkowego z ćw. 2 dodać
15 l H₂O (nr 3).

Pobrać 20 μg (lub 15 l) preparatu EC/EJ-NZ (do probówki nr 4) i dopełnić 0.2 M NaCl do 15 μl. Ze wszystkich frakcji pobrać po 20 μl preparatów kolejno do probówek: 5 (F1), 6 (F2) i 7 (F3).

Do preparatów 1, 2 i 4 dodać po 3 μl LB 6x, do preparatów 5-7 dodać po 4 μl buforu LB 6x.

Wszystkie próby (1-7) gotować 3 min. w termobloku (99⁰C), zwirować krótko (przycisk „short”)
na maksymalnych obrotach, przenieść do nowych probówek, podpisanych tak samo: 1-7.

3. Elektroforeza preparatów białkowych

-Przygotowanie buforu do elektroforezy:
Do cylindra o pojemności 1000 ml wlać 200 ml buforu do elektroforezy stężonego 5x
i dopełnić do 1000 ml.

Złożyć żele (2 lub 4 żele do jednego aparatu) wg. instrukcji:

a. Wszystkie kieszonki podkreślić pisakiem i podpisać kolejno: X, X, X (puste kieszonki), M, 1, 2...7 X, X, X, X.. Szyby ułożyć dłuższą częścią na zewnątrz:

b. Rozpiąć stelaż i wstawić całość do stelaża:

c. Po wstawieniu szyb zamknąć stelaż przytrzymując szyby od góry i całość włożyć do naczynia:

Wlać bufor do elektroforezy do wewnętrznej części pomiędzy szyby, aż do samej góry
i do zewnętrznej części - do poziomu zaznaczonych ścieżek (tak, aby nie zamazać napisów).

-Nanoszenie preparatów:

Do ścieżki oznaczonej literą M nanieść marker masy (5 μl). Do następnych ścieżek nanosić kolejno preparaty: 1-7 (w całości).

Elektroforezę prowadzić pod napięciem 100 V przez 15 min., następnie zwiększyć napięcie
do 200 V (maksymalne natężenie prądu nie może przekraczać 300 mA). Czas trwania elektroforezy - do przejścia barwnika do końca żelu (40-50 min.).

4. Wybarwianie żelu

1. Po skończonej elektroforezie, aparat rozłożyć, wyjąć szyby i rozdzielić je, posługując się łopatką (uwaga, nie uszkodzić żelu). Zaznaczyć żel.

2. Łopatką odciąć żel zagęszczający i korek, żel ostrożnie przenieść do przygotowanego pudełeczka i zalać barwnikiem (barwnik zawiera metanol, dlatego należy pracować
   pod wyciągiem).

3. Żel postawić na kołysce i barwić 30 min.

4. Ostrożnie zlać barwnik do butelki, a żel zalać odbarwiaczem (również pod wyciągiem).

5. Pozostawić na kołysce do odbarwienia tła.

6. Przez dwa kolejne dni po jednej osobie z grupy przychodzi rano (koniecznie trzeba się umówić) do pracowni. Zużyty odbarwiacz należy zlać do butelki z węglem aktywnym (regeneracja), na żele należy nalać nową porcję odbarwiacza.

5. Sprawozdanie

1. Należy skrótowo opisać wylewanie żelu i przygotowanie buforu do elektroforezy.

2. Dokładnie (wraz ze wszystkimi obliczeniami) opisać przygotowanie prób do elektroforezy
   z zaznaczeniem, o jaki preparat chodzi (nie tylko skrót).

3. Opisać, który preparat (łącznie z nr probówki) znajduje się w której kieszonce.

4. Zdjęcie żelu (dostarczone po odbarwieniu tła) musi być podpisane:

1. Marker ma być opisany obok żelu, masami cząsteczkowymi białek (zgodnie
   z instrukcją).

2. Każda kieszonka powinna być podpisana numerem, a numery opisane w legendzie pod spodem rysunku.

5. We wnioskach należy opisać, w których preparatach widoczne są białka w postaci prążków
   (w preparatach z ekstraktów cytoplazmatycznych i jądrowych powinno ich być dużo,
   o różnych masach), w których nie. Spróbować zanalizować dlaczego. (należy sięgnąć do wyników oznaczeń białek z poprzedniego ćwiczenia. Jeśli we frakcjach
   z chromatografii są widoczne białka, opisać ich przybliżone masy (wg markera). Dla przykładu pokazuję zdjęcie z elektroforezy samych histonów (z Internetu www.biochemj.org/bj/322/0281/bj3220281.htm)

---