SPRAWOZDANIE
Inżynieria genetyczna - Laboratorium
Ćwiczenie nr 2 i 3: Przygotowanie plazmidu pGEX-2T do klonowania: trawienie wektora enzymem restrykcyjnym BamHI, jego defosforylacja oraz elektroforeza preparatywna.
1. Procedura i metodyka
Przygotowano następujące roztwory do reakcji trawienia plazmidu enzymem restrykcyjnym BamHI:
Roztwór 1 - reakcja na jedno trawienie:
2 µl pGEX-2T (2 µg)
1 µl BamHI (10 U/µl, MBI Fermentas)
1,5 µl buforu BamHI+ (10x, MBI Fermentas) MIX
10,5 µl H2O
15 µl razem
Roztwór 2 - Kontrola:
2 µl pGEX-2T (2 µg)
1,5 µl buforu BamHI+ (10x, MBI Fermentas)
11,5 µl H2O
15 µl razem
c). MIX (na 7 trawień):
7 μl BamHI (10 U/ μl)
10,5 μl buforu BamHI+ (10x)
73,5 μl H2O
91 µl razem
Plazmidowe DNA było poddawane trawieniu przez 1 h w temperaturze 37°C (wraz z kontrolą)
Po reakcji trawienia przygotowano kolejne roztwory w celu poddania ich elektroforezie analitycznej w żelu agarozowym o stężeniu 0,8%, przygotowanym w buforze 1 x TBE, zawierającym bromek etydyny w stężeniu równym 0,4 µg/ml. Elektroforezę prowadzono przy stałym napięciu 70 V przez 63 min.
a) Roztwór 1 - próbka wektora do elektroforezy:
2 µl mieszaniny po trawieniu wektora pGEX-2T
8 µl TE
2 µl 6x bufor do próbek (6xSB)
12 µl razem
b) Roztwór 2 - Kontrola
2 µl próbki kontrolnej
8 µl TE
2 µl 6xSB
12 µl razem
Z przygotowanych tak roztworów pobrano następujące objętości do elektroforezy:
12 µl przygotowanej próbki trawionego wektora pGEX-2T
12 µl próbki kontrolnej
5 µl markera wagowego FastRulerTM DNA Ladder, Middle Range, (MBI Fermentas)
Po elektroforezie przystąpiono do defosforylacji plazmidu fosfatazą alkaliczną FastAPTM:
Do 13 µl mieszaniny reakcyjnej pozostałej po trawieniu plazmidu i analizie elektroforetycznej dodano 6 µl 1x buforu BamHI+, który otrzymano z rozcieńczenia buforu 10x, oraz 1 µl (1 U) enzymu. Defosforylację prowadzono w objętości końcowej 20 µl przez
30 min w temperaturze 37°C (w termomikserze).
Po zakończeniu defosforylacji do mieszaniny reakcyjnej dodano 6 µl buforu 6xSB do nanoszenia próbek na żel agarozowy.
Następnym etapem było poddanie zlinearyzowanych i defosforylowanych próbek elektroforezie preparatywnej w żelu agarozowym o stężeniu 0,8%, przygotowanym w 1xTBE, zawierającym bromek etydyny o stężeniu 0,4 µg/ml. Elektroforezę prowadzono przy stałym napięciu 92 V przez ok. 40min. W tym celu przygotowano następujący roztwór:
a) Roztwór 1 - próbka do elektroforezy preparatywnej
20 µl mieszaniny po defosforylacji
4 µl 4x buforu do nanoszenia próbek na żel agarozowy (6xSB)
24 µl razem
Na żel naniesiono po 24 µl każdej z przygotowanych próbek defosforylowanego wektora
pGEX-2T i 7 µl markera wagowego FastRulerTM DNA Ladder, Middle Range, (MBI Fermentas). Żel obserwowano w świetle UV przy dłuższej fali λ=365 nm.
ELUCJA DNA Z ŻELU AGAROZOWEGO (METODA GEL-OUT® A&A BIOTECHNOLOGY)
Zważono i opisano probówki Eppendorfa, do których przeniesiono wycięty skalpelem kawałek zawierający DNA z żelu po elektroforezie preparatywnej.
Zapisano masę żelu netto fragmentu wyciętego żelu.
Do probówki Eppendorfa ze skrawkiem żelu dodano 400 µl roztworu R7S.
Zawartość wymieszano i inkubowano w termomikserze Eppendorf w temperaturze 50°C, przy obrotach 500 rpm do momentu całkowitego rozpuszczenia agarozy (ok. 5min).
Następnie dodano 200 µl izopropanolu i dokładnie wymieszano.
Mieszaninę odwirowano i naniesiono na kolumnę do oczyszczania DNA; całość wirowano przez 30 s przy ok. 10000 rpm.
Kolumnę wyjęto z probówki, zlano przesącz i przełożono ją do czystej probówki Eppendorfa, po czym nałożono 600 µl roztworu do płukania A1.
Odwirowano całość przez 30 s przy ok. 10 000 rpm.
Przesącz ponownie odrzucono, a kolumnę przełożono do czystej probówki Eppendorfa po czym dodano 300 µl roztworu A1.
Odwirowano całość przez 2 min przy ok. 10000 rpm.
Znów przesącz odrzucono, wkładając kolumnę do czystej probówki i inkubując ją przez 3 min
w temperaturze pokojowej.
Podpisano probówkę Eppendorfa z kolumną i nałożono na nią 10 µl buforu TE całkowicie pokrywając złoże.
Odwirowano całość przez 1 min przy ok. 10000 rpm.
Tak otrzymaną mieszaninę przechowywano w temperaturze -20°C.
2. Wyniki i obserwacje
Roztwory do elektroforezy analitycznej przygotowane były inaczej niż podane w instrukcji, ponieważ dysponowano buforem 6xSB, zamiast 5xSB. Stąd, aby bufor 6x rozcieńczyć do stężenia 1x, zaplanowano skład:
2 µl mieszaniny po trawieniu wektora pGEX-2T
8 µl TE (zamiast 6 µl)
2 µl 6x bufor do próbek (6xSB)
12 µl razem
W ten sposób, w końcowej objętości 12 µl znajdowało się 2 µl buforu 6x (6x rozcieńczony). Te same proporcje zastosowano w próbce kontrolnej. Jednak podczas nanoszenia kontroli na żel, popełniono błąd, przez co zastosowana objętość próbki kontrolnej wynosiła 9,4 µl.
Mix na 7 trawień przygotowano, dodając składniki w odpowiedniej kolejności: 73,5 μl H2O + 10,5 μl buforu BamHI+ (10x) + 7 μl BamHI (10 U/ μl), aby stworzyć odpowiednie warunki.
Przygotowanie próbki do naniesienia na żel preparatywny również przebiegło inaczej, niż podane w instrukcji. Do 20 µl mieszaniny po defosforylacji dodano 4 µl (V1) 6x stężonego roztworu SB. Wynika to z poniższych równań:
Wycięty fragment żelu był mniejszy, niż z początku przewidywano. Prążek rozwarstwił się na kilka mniejszych, najprawdopodobniej przez zaniedbanie dezaktywacji enzymu defosforylującego. Do dalszej analizy wycięto fragment znajdujący się najniżej w żelu.
Na etapie elucji DNA, osuszoną kolumnę umieszczono w probówce Eppendorfa i nałożono na nią
10 µl buforu TE zamiast 30 µl. Zastosowana ilość wystarczyła, aby całkowicie pokryć złoże.
M K 1 2 3 4 5
Analiza elektroforetyczna wektora pGEX-2T trawionego enzymem restrykcyjnym BamHI
M - marker
K - kontrola
1-5 - próbki
Waga czystej probówki Eppendorf: 0,984 g
Waga probówki Eppendorf wraz z DNA: 1,052 g
Stąd waga samego DNA (netto): 0,068 g
3. Wnioski
Elektroforeza analityczna pozwoliła nam stwierdzić, czy reakcje trawienia zaszły i czy otrzymaliśmy pożądane produkty. Każda z próbek wygenerowała pojedyncze pasmo na żelu - oznacza to, że DNA plazmidowe zostało przecięte w jednym miejscu, charakterystycznym dla enzymu BamHI (miejsce restrykcyjne).
Pasmo właściwe dla kontroli znajduje się niżej, niż pozostałe - świadczy to innej konformacji DNA
w tej próbce. Kontrola pozbawiona była enzymu restrykcyjnego, w związku z tym plazmid nie został przecięty i pozostał w swej superhelikalnej formie. Formy superzwinięte DNA w żelu agarozowym poruszają się szybciej, niż liniowe. Dodatkowo, kontrola ukazała jeszcze jedno pasmo powyżej innych. Możliwe, że jest to inna forma plazmidu.
Bufor SB użyty do elektroforezy zawierał 100 mM EDTA w celu dezaktywacji enzymu restrykcyjnego, 20% fikol w celu zagęszczenia próbki oraz 0,25% błękit bromofenolowy i 0,25% ksylenocyjanol - indykatory, dzięki którym próbka była widoczna.
Porównując próbki 1-5 z markerem, otrzymano w przybliżeniu długość DNA charakterystyczną dla plazmidu pGEX-2T (4948 bp). Reakcja trawienia zaszła prawidłowo.
Po ligacji, jednym z możliwych produktów mógł być samozligowany wektor. W celu uniknięcia tego faktu zastosowano enzym fosfatazę alkaliczną FastAP™. Defosforylowany został koniec 5', dzięki czemu końce wektora nie mogły połączyć się ze sobą.
Wycięty skalpelem fragment żelu agarozowego z próbką DNA potraktowano 400 µl roztworu R7S. Pomaga on przy topieniu agarozy, a DNA lepiej adsorbuje się na złożu krzemionkowym. Dodany później izopropanol umożliwił strącenie DNA. Podczas elucji użyto również roztworu A1, zawierającego rozpuszczalniki organiczne, który posłużył do przepłukania DNA. Nałożony na kolumnę, w celu pokrycia złoża, bufor TE - z racji niskiej siły jonowej - spowodował desorpcję DNA ze złoża. Otrzymany przesącz, wg. założeń, zawierał zlinearyzowany, defosforylowany i oczyszczony plazmid pGEX-2T gotowy do klonowania obcego DNA.
Wojciech Ślęczek 168560
Maciej Duda 168516
5000 bp
2000 bp
850 bp
400 bp
100 bp
Wyszukiwarka