LABORATORIUM Z BIOCHEMII

SPRAWOZDANIE

ĆWICZENIE nr 4

TEMAT: KWASY NUKLEINOWE

WYDZIAŁ: BIOTECHNOLOGII I NAUK O ŻYWIENIU CZŁOWIEKA

KIERUNEK: BIOTECHNOLOGIA

ROK AKADEMICKI: 2008/2009

DATA WYKONANIA ĆWICZENIA : 24.03.2009

DZIEŃ TYGODNIA : WTOREK

GODZINA : 12.15 - 16.00

SKŁAD GRUPY

IMIĘ I NAZWISKO	NUMER ALBUMU
Waldemar Guzek Michał Orzechowski Tomasz Piatrzak	144515 144570 144576

OCENA ZE SPRAWOZDANIA …………………

UWAGI PROWADZĄCEGO: …………………………………………….…..………………………………….………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………

1. Cel ćwiczenia

• Powtórzenie wiadomości dotyczących kwasów nukleinowych

• Metody wykrywania kwasów nukleinowych, analiza i wykazanie ich niektórych właściwości za pomocą metod laboratoryjnych.

2. Wstęp teoretyczny

Kwasy nukleinowe to związki organiczne, które są podstawowymi składnikami wszelkich komórek. Są one wielocząsteczkowymi polimerami nukleotydów, które składają się z zasady azotowej, składnika cukrowego ( rybozy lub deoksyrybozy ) oraz z kwasu fosforowego.

Rozróżnia się dwa rodzaje kwasów nukleinowych :

1. RNA - kwas rybonukleinowy zawierający cukier β-D-rybofuranozę

2. DNA - kwas deoksyrybonukleinowy zawierający cukier 2-deoksy-β-D-rybofuranozę

Połączenie składnika cukrowego i zasady azotowej nosi nazwę nukleozydu.

Zasady azotowe dzielimy na :

• Purynowe

Oto przykład podstawowych zasad purynowych :

• Pirymidynowe

Oto przykład podstawowych zasad pirymidynowych :

W nukleozydach wiązanie glikozydowe łączy C-1 pentozy z atomem N-1 zasady pirymidynowej lub atomem N-9 zasady purynowej.

Nukleozyd połączony wiązaniem estrowym z resztą kwasy ortofosforowego tworzy nukleotyd.

3. Część doświadczalna

1. Rozpuszczalność kwasów nukleinowych

Sposób wykonania :

• Do 0,5 ml 0,1 % roztworu RNA i DNA dodać kroplami

1N HCl. Następnie dodać roztwór NaOH.

• Do 1 ml 0,1 % roztworu RNA i DNA dodać podwójną objętość ( 2 ml ) 96% etanolu.

Obserwacje :

• Dla kwasu : Wytrącił się biały osad (duże zmętnienie roztworu)

• Po dodaniu zasady do roztworu kwasu nukleinowego i kwasu HCl obecny w nim osad uległ rozpuszczeniu.

• Dla alkoholu : Wytrącił się biały osad (duże zmętnienie roztworu)

Wnioski :

Kwasy nukleinowe rozpuszczają się w zasadach.

W reakcji z alkoholem niszczona jest ich struktura przestrzenna cząsteczki. Kwasy nukleinowe, dzięki zawartości reszt kwasu fosforowego, wykazują odczyn kwasowy. Rozpuszczają sie dobrze w środowisku zasadowym, trudniej w wodzie i rozcieńczonym kwasie octowym. W roztworach wodnych tworzą układy koloidalne, z których można je

wytrącić za pomocą czynników odwadniających. Znaczne obniżenie pH roztworu przez dodanie mocnych kwasów lub czynników odwadniających doprowadza do ich wytracenia z roztworu. Dwie nici DNA ulegają wyraźnemu rozdzieleniu po inkubacji w roztworach o

pH>12 i pH<2, ze względu na jonizacje zasad. Jonizacja powoduje zmianę właściwości tworzenia wiązań wodorowych przez zasady, co prowadzi do zaburzenia wiązań wodorowych pomiędzy A i T oraz C i G. Ponadto przy bardzo wysokim lub niskim pH powłoka hydratacyjna otaczająca cząsteczkę DNA ulega zaburzeniu, powodując destabilizacje nakładania sie par zasad. Traktowanie DNA kwasem prowadzi do depurynacji i depirymidyzacji - utraty zasad przez trawienie wiązania glikozydowego. Wiązanie fosfodiestrowe w miejscach pozbawionych zasad staje sie bardziej podatne na hydrolizę, co prowadzi do degradacji DNA.

1. Kwaśna hydroliza kwasów nukleinowych

Sposób wykonania :

Do 2,5 ml 1 % roztworu RNA i DNA dodać 2,5 ml 10% H₂SO₄. Następnie roztwór ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez około 1 godzinę.

Obserwacje :

Nie zaobserwowano żadnych widocznych zmian.

Wnioski :

• Kwasy nukleinowe ogrzewane z kwasami mineralnymi (takimi jak H₂SO₄ ) ulegają hydrolizie do wolnych zasad purynowych i nukleotydów pirymidynowych.

• Doświadczenie to jest wykorzystywane do uzyskania hydrolizatów kwasów nukleinowych.

2. Wykrywanie pentoz w hydrolizatach kwasowych

1. Reakcja Orcynowa

Sposób wykonania :

Do 6 probówek zawierających po 1 ml substratu ( substraty wyszczególnione w obserwacjach ) dodać po 1 ml odczynnika orcynolowego, a następnie umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 15 minut. Po wyjęciu z łaźni i ostudzeniu każdej próby dodać po 5 ml wody destylowanej.

Obserwacje :

• Dla hydrolizatu RNA : Roztwór o barwie zielonej.

• Dla hydrolizatu DNA : Roztwór o barwie zielonej.

• Dla 0,1 % roztworu RNA : Roztwór o barwie zielonej.

• Dla 0,1 % roztworu DNA : Roztwór o barwie zielonej.

• Dla 1 % roztwory rybozy : Roztwór o barwie zielonej.

• Dla 1% roztworu deoksyrybozy : Roztwór o barwie zielonej.

Wnioski :

• Każdy substrat wyszczególniony w obserwacjach zawiera w swej budowie wolną pentozę lub pentozę związaną w nukleozydach, o czym świadczy utworzenie przez każdego z nich zielonego kompleksu z orcyną.

Wolne pentozy oraz zwiazane w nukleozydach podczas ogrzewania ze stężonym HCl ulegają cyklizacji do furfuralu,

który w obecności jonów Fe3+ kondensuje z oryną, tworząc związek barwy zielonej.

1. Reakcja Dischego

Sposób wykonania :

Do 6 probówek zawierających po 1 ml substratu ( substraty wyszczególnione w obserwacjach ) dodać po 2 ml odczynnika difenyloaminowego. Wstawić na około 10 minut do wrzącej łaźni wodnej.

Obserwacje :

• Dla hydrolizatu RNA : Bezbarwny kolor roztworu nie zmienił się.

• Dla hydrolizatu DNA : Roztwór o barwie niebieskiej.

• Dla 0,1 % roztworu RNA : Bezbarwny kolor roztworu nie zmienił się.

• Dla 0,1 % roztworu DNA : Roztwór o barwie niebieskiej.

• Dla 1 % roztwory rybozy : Bezbarwny kolor roztworu nie zmienił się.

• Dla 1% roztworu deoksyrybozy : Roztwór o barwie niebieskiej.

Wnioski :

Niebieskie zabarwienie roztworu w reakcji Dischego świadczy o występowaniu w roztworze deoksyrybozy wolnej lub związanej z zasada purynową. DNA i deoksyryboza wolna oraz wiązania z zasadą purynową ulegają barwnej reakcji z difenyloaminą.

1. Wykrywanie kwasu fosforowego

Sposób wykonania :

0,5 ml hydrolizatu kwasu nukleinowego DNA zobojętnić roztworem amoniaku ( 3 krople stężonego roztworu). Następnie dodać 0,5 ml stężonego roztworu HNO₃ i 2 ml roztworu molibdenianu amonowego. Zawartość probówki ogrzać do wrzenia.

Obserwacje :

Po kilkuminutowym przebywaniu probówki z badanym roztworem we wrzącej łaźni wodnej z roztworu wytrącił się żółty osad.

Wnioski :

Wytrącenie się żółtego osadu (fosfomolibdenianu amonowego) świadczy o występowaniu w roztworze kwasu fosforowego.

2. Wykrywanie zasad purynowych

Sposób wykonania :

Do 1 ml hydrolizatu kwasu nukleinowego RNA dodać 6 kropli stężonego amoniaku i 3 ml amoniakalnego roztworu wodorotlenku srebra.

Obserwacje :

Po dodaniu amoniakalnego roztworu wodorotlenku srebra wytrącił się biały, mętny osad.

Wnioski :

Wytrącenie się białego osadu (soli srebrowych puryn) świadczy o występowaniu w roztworze zasad purynowych.

3. Oznaczanie zawartości zasad purynowych metodą spektrofotometryczną

Kwasy nukleinowe jak i produkty ich rozkładu pochłaniają promieniowanie ultrafioletowe w obszarze 250-280 nm dzięki występowaniu w ich cząsteczkach pierścieni aromatycznych. Fakt ten jest wykorzystywany do ilościowego oznaczania tych związków.

Sposób wykonania :

Do 5 g kostki bulionowej dodać około 75 ml wody destylowanej, gotować we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut, a następnie przestudzeniu przesączyć do kolby miarowej o pojemności 100 ml przez gazę młyńską i uzupełnić wodą destylowaną do kreski. Po wymieszaniu roztwór jeszcze raz przesączyć przez sączek bibułowy.

Badany roztwór należy rozcieńczyć 20-krotnie roztworem 0,1N HCl.

Pomiary wykonujemy przy dwóch długościach fali:

-dla adeniny 262nm i 290nm

-dla guaniny 249nm i 290nm

W celu wyeliminowania wpływu zanieczyszczeń (występowaniu białek i związków niskocząstgeczkowych) na badaną próbę, pomiary są dokonywane dla długości fali maksymalnego pochłaniania i 290 nm (graniczna wartość długości promieni UV-C. Wywiera silne działanie fotochemiczne i cechuje się najbardziej szkodliwym działaniem biologicznym. Wywierają silne działanie bakteriobójcze. Niszczy strukturę cząsteczkową zanieczyszczeń występujących w badanym roztworze).

Obliczenia :

Uzyskane pomiary przedstawiam w tabeli :

Tabela 1. Różnice ekstynkcji oraz stężenie adeniny i guaniny w kostkach bulionowych.

	Nazwa produktu	ΔE(262 - 290)	ΔE(249 - 290)
1	Knorr „Rosół drobiowy”	0,188	0,172
2	Knorr „Bulion cielęcy”	0,246	0,211
3	Winiary „Bulion wołowy”	0,138	0,118
4	Kucharek „Rosół wołowy”	0,149	0,282
5	Winiary „Rosół drobiowy”	0,474	0,360
6	Knorr „Rosół wołowy”	0,187	0,177
7	Knorr „Bulion grzybowy”	0,209	0,139

Mając podaną absorbancję roztworów wzorcowych adeniny i guaniny o stężeniu 10 μg/ml :

• Dla adeniny ΔE_{(262 - 290)} = 0,900

• Dla guaniny ΔE_{(249 - 290)} = 0,457

Obliczam stężenie zasad purynowych w analizowanych kostkach bulionowych.

Przykładowe obliczenia dla bulionu numer 1.

Stężenia adeniny :

10 μg/ml ------- ΔE_{(262 - 290)} = 0,900

x μg/ml ------- ΔE_{(262 - 290)} = 0,188

x = 2,09 μg/ml

Dla guaniny :

10 μg/ml ------- ΔE_{(249 - 290)} = 0,457

y μg/ml ------- ΔE_{(249 - 290)} = 0,172

y = 3,76 μg/ml

Tabela 2: Zawartość zasad purynowych w kostkach bulionowych.

	Nazwa produktu	Zawartość adeniny [ mg/g ]	Zawartość guaniny [ mg/g ]
1	Knorr „Rosół drobiowy”	0,836	1,504
2	Knorr „Bulion cielęcy”	1,092	1,848
3	Winiary „Bulion wołowy”	0,612	1,032
4	Kucharek „Rosół wołowy”	0,664	2,468
5	Winiary „Rosół drobiowy”	2,108	3,12
6	Knorr „Rosół wołowy”	0,832	1,548
7	Knorr „Bulion grzybowy”	0,928	1,216

Przykładowe obliczenia dla bulionu numer 1 (dla adeniny)

1. 2,09 μg/ml mnożymy razy 20 z powodu 20-krotnego rozcieńczenia próby.

2,09*20=41,8 μg/ml

2. 41,8 μg/ml mnożymy razy 100 ponieważ przesącz bulionu umieściliśmy w kolbie o pojemności 100 ml

41,8*100=41800 μg/ml

3. 4180 μg/ml dzielimy przez 5g ponieważ do przygotowania surowca do pomiaru spektrofotometrycznego wzięliśmy dokładnie tyle bulionu.

4180/5=836 μg/g

4. 836 μg / 1g dzielimy przez 1000 z powodu zmiany jednostki z μg na mg.

836/100=0,836 mg/g

Uzyskaliśmy zawartość 0,836 mg adeniny w 1 g bulionu.

Wnioski :

• Badane przez nas buliony na zajęciach laboratoryjnych są prawie dwukrotnie bardziej bogate w guaninę niż w adeninę.

• Kwasy nukleinowe są obecne w produktach żywnościowych

• Bulionem o najmniejszej zawartości adeniny i guaniny jest „Bulion wołowy” Winiary (odpowiednio 0,612 mg/g i 1,032mg/g), a o największej zawartości jest „Rosół drobiowy” również firmy Winiary ( adenina-2,108 mg/g i guanina-3,12 mg/g)

2. Oznaczenie zawartości DNA metodą difenyloaminową

Sposób wykonania :

10 g tkanki zwierzęcej ( wątroba) i 0,5 g mleczu z ryb zhomogenizować z 50 ml 10% kwasu trójchlorooctowego (ekstrahuje on niskocząsteczkowe związki kwasorozpuszczalne-nukleotydy, aminokwasy, estry fosforanowe) . Zważyć uzyskany produkt wraz z naczyniem (m₁) . Homogenat odwirować. Supernatant (nukleotydy, aminokwasy, estry fosforanowe) usunąć, a do osadu ( zawierający białka, polisacharydy i kwasy nukleinowe) dodać 30 ml 0,6 M roztworu kwasu nadchlorowego i ogrzewać mieszaninę przez około 15 minut w łaźni wodnej ( o temperaturze 90⁰ C ) stale mieszając-ogrzewanie z roztworem HClO₄ powoduje oddzielanie kwasów nukleinowych od białek, ulegają one hydrolizie do związków kwasorozpuszczalnych i przechodzą do roztworu. Po ostudzeniu i zważeniu produktu wraz z naczyniem (m₂) odwirować osad zawierający białko i polisacharydy, a supernatant zawierający kwasy nukleinowe przenieść ilościowo do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Zawartość kolby uzupełnić kwasem nadchlorowym do kreski. Dokładnie wymieszać.

Następnie przygotować próby zawierające :

• 1ml ekstraktu kwasów nukleinowych i 1 ml wody destylowanej ( próba badana)

• 1ml wzorcowego DNA ( o stężeniu 200 μg/ml) i 1 ml wody destylowanej ( próba wzorcowa )

• 2 ml wody destylowanej ( próba odczynnikowa),

a następnie do każdej dodać po 4 ml odczynnika difenyloaminowego. Wszystkie próby wstawić jednocześnie do wrzącej łaźni wodnej i inkubować w ciągu 10 min. Po tym czasie próby ochłodzić i zmierzyć absorbancję prób badanych i wzorcowej wobec próby odczynnikowej na spektrokolorymetrze przy długości fali 600 nm.

Tabela 3: Pomiar absorbancji dla próby wzorcowej, próby z wątrobą i próby z mleczem śledzia.

	Próba odczynnikowa zawierająca 200 μg/ml DNA E600	Próba dla wątroby E600	Próba dla śledzia E600
Pomiar 1	0,155	0,39	0,495
Pomiar 2	0,24	0,425	0,5
Wynik średni	0,2025	0,41	0,49

Obliczenia :

Absorbancja próby zerowej

200 μg/ml DNA-----E₆₀₀= 0,202

1. Zawartość DNA w badanej próbie

1. Dla tkanki zwierzęcej ( wątroby )

200 μg / ml ----- 0,202

x μg / ml ----- 0,41

x = 405,94 μg/1 ml

- 405,94 μg/1 ml dzielimy przez 1000 z powodu zmiany jednostki z μg na mg.

405,95/1000=0,450595 mg/ 1 ml

- 0,40594 mg/1 ml mnożymy razy 50 ponieważ supernatant zawierający DNA umieściliśmy w kolbie o pojemności

50 ml

0,40594*50=20,297 mg/ml

- 20,297 mg/ml dzielimy przez 10g ponieważ do ekstrakcji użyliśmy taka ilość tkanki zwierzęcej

20,297/10=2,0297 mg/1 g

- 2,0297 mg/1 g tkanki mnożymy przez 100, gdyż mamy za zadanie uzyskać ilość mg DNA na 100 g tkanki.

2,0297*100=202,97 mg DNA w 100 g tkanki

Uzyskaliśmy wynik 202,97 mg DNA w 100 g tkanki zwierzęcej ( wątroby).

2. Dla mleczu rybnego ( śledź )

200 μg / ml ----- 0,202

x μg / ml ----- 0,49

x = 485,15 μg/1 ml

- 485,15 μg / 1 ml dzielimy przez 1000 z powodu zmiany jednostki z μg na mg

485,15/1000 = 0,48515 mg/1 ml

- 0,48515 mg / 1 ml mnożymy razy ponieważ supernatant zawierający DNA umieściliśmy w kolbie o pojemności

50 ml

0,48515*50 = 24,2575 mg/ml

- 24,2575 mg dzielimy przez 0,5g ponieważ do ekstrakcji użyliśmy taka ilość tkanki zwierzęcej

24,2575/0,5 = 48,515 mg/1 g

- 48,515 mg/1 g tkanki mnożymy przez 100 gdyż mamy za zadanie uzyskać ilość mg DNA na 100 g tkanki.

48,515*100 = 4851,5 mg DNA w 100 g tkanki

Uzyskaliśmy wynik 4851,5 mg DNA w 100 g mleczu z ryb ( śledzia ).

Wnioski :

Mlecz śledzia jest ponad 24 razy bardziej bogaty w kwasy nukleinowe (4851,5 mg DNA w 100 g tkanki) aniżeli tkanka wątrobowa (202,97 mg DNA w 100 g tkanki).

4. Podsumowanie

Kwasy nukleinowe są wielocząsteczkowymi polimerami nukleotydów, które składają się z zasady azotowej, składnika cukrowego ( rybozy lub deoksyrybozy ) oraz z reszty kwasu fosforowego.

Wykazywanie obecności kwasów nukleinowych opiera się na charakterystycznych reakcjach ich składników, uwalnianych w wyniku hydrolizy.

Reakcja orcynowa pozwala nam określić czy w danym roztworze znajduję się cukier o pięciu węglach (pentoza), natomiast reakcja Dischego służy odróżnieniu rybozy od deoksyrybozy a tym samym RNA od DNA.

Obecność kwasu fosforowego ( który jesteśmy w stanie wykryć w reakcji strącenia żółtego fosfomolibdenianu amonowego) nadaje kwasom nukleinowym kwaśny charakter. Dzięki temu wolne kwasy nukleinowe dobrze rozpuszczają się w środowisku zasadowym, a słabo w wodzie, rozcieńczonych kwasach i alkoholu.

Kwasy nukleinowe za pomocą metody spektrofotometrycznej czy metody difenyloaminowej możemy wykryć w produktach spożywczych i w tkankach organizmów żywych.

---