. Wymień metody rozmnażania in vitro .
2. Co to są protoplasty, jak je pozyskujemy oraz do czego są one wykorzystywane.
3. Wyjaśnij pojęcia transformacja , rośliny transgeniczne, kalus, totipotencja.
4. Zasada działania bioreaktorów , do czego są wykorzystywane, podział bioreaktorów .
5. Co rozumiesz pod pojęciem ,,bank genów".
6. Jakie są metody przechowywania roślin w banku genów
|
1 Wymień metody rozmnażania in vitro . |
Grupa 1
1.Wyjasnić :
organogeneza pośrednia -
organogeneza bezpośrednia -
wyjasnij jaki związek ma pojecie z regeneracja roślin in vitro czy cos takiego
2.Narysuj i objasnij schemat który tłumaczy powiązanie regulatorów wzrostu a kierunku organogenezy
3.Embriogeneza somatyczna wyjaśnić pojecie
Zarodek somatyczny(klonalny) różni się od zarodka zygotycznego tym ze......
Zarodek somatyczny podobny jest do zarodka zygotycznego w tym ze......
4.Sztuczne nasiona stanowią:
-
-
-
-
Najczęściej stosowna w produkcji sztucznych nasion okrywa nasiena stanowi...... lub....substancja używana do stożkowania
5.Podaj na czy polega aklimatyzacja roślin z in vitro.
Jakie obejmuje etapy i z jakimi problemami się wiąże
Grupa 1
1.Metody transformacji genetycznej
-
-
Konstukt to-
2.Odpornosc na herbicydy polega na...
Najlepsza odporność na herbicyd..................... który hamuje działanie..................................
Modyfikacja polega na
-
-
Co to są geny reporterowe i jakie znasz ich rodzaje
3.Pierwszy GMO Wprowadzony do obrotu w USA był transgeniczny......................odmiany...............................
Opóźnienie dojrzewania uzyskane poprzez wprowadzenie.....
Inna metoda polega na wprowadzeniu...
Podaj inne przykłady poprawy cech jakościowych
-
-
-
4.RFCP czyli........................... polega na
-trawieniu....
-
-
-
Źródłem zróżnicowania struktury Dna i RFLP mogą byc.......
5.Enzymy restrykcyjne chronią przed................................W zależności od osi symetrii enzymy restrykcyjne
wytwarzają............................lub.............................. końce.
Można to przedstawic graficzne
ZESTAW 2
1. Pojęcia :
kallus -
biotransformacja-
organizmy transgeniczne -
totipotencja -
2. Wymienić 4 metody bezwektorowe.
-
-
-
-
Co to mikrowstrzeliwanie?
3. Co to
-polimorfizm
-markery
Rodzaje markerów
4. Rodzaje metod in vitro
5. Kultury protoplastów - co to protoplasty, wykorzystanie, pozyskiwanie
6. Co to bioreaktor, do czego stosowany, podział ze wzgl. na napowietrzanie
7. Co to banki genów, w jakich warunkach przechowujemy
8. Substraty PCR, ile cykli, w jakim czasie, trzy cykle podać i w jakiej temp zachodzą
9. Coś z genem Bt - koduje białko................................... które.............................. , wymienić dwie rośliny transgeniczne Bt i na jakie szkodniki odporne
10. Powierzchnia uprawy roślin transgenicznych wynosi.............................. . Wymienić trzy państwa, gdzie największa produkcja
POPRAWKA
1 porównaj PCR ilościowy i jakościowy
2 elektroforeza
3 enzymy restrykcyjne (tępe i lepkie końce)
4 odporność na herbicydy ( modyfikacja, działanie herbicydu )
5 bakterie agrobacterium tumefaciens co robi ( cos z transformacją)
6 biotransformacja ( etapy, rodzaje) 7 kultury merystemów
8 protoplasty ( otrzymywanie, wykorzystanie )
9 sztuczne nasiona (otrzymywanie, co to jest)
10 etapy aklimatyzacji roślin z kultur in vitro (przebieg mikrorozmnażania : 4 fazy )
Przykładowe pytania od zaocznych :
1. Wymień metody rozmnażania in vitro .
2. Co to są protoplasty, jak je pozyskujemy oraz do czego są one wykorzystywane.
3. Wyjaśnij pojęcia transformacja , rośliny transgeniczne, kalus, totipotencja.
4. Zasada działania bioreaktorów , do czego są wykorzystywane, podział bioreaktorów .
5. Co rozumiesz pod pojęciem ,,bank genów".
6. Jakie są metody przechowywania roślin w banku genów. PYTANIA
POMIESZANE Z TERMINU 05.06.06
1. Etapy rozwoju poinsecji w bioreaktorze, to jest konstrukt genetyczny?
2. Rodzaje trnsformacjii przykłady roślin zmienionych genetycznie, które zyskały odporność na szkodniki i choroby.
3. Dzięki zdolności roślin do ........................ przeprowadza się rozmnażanie in vitro.
4. Wymienić rodzaje in vitro.
5. Kultury protoplastów, co to, skąd się bierze i po co.
6. Sztuczne nasiona co to są i opisać powstawanie jednego rodzaju z nich.
7. Jakie są sposoby zatrzymania metabolizmu u wyhodowanych struktur roślinnych i były 3 podpunkty do uzupełnienia i podać jakie warunki trzeba spełnić żeby to zachodziłobezpiecznie dla rośliny.
8. Bioreaktor, eksplantat, zarodek klonalny i organogeneza pośrednia.
ODPOWIEDZI
Zestaw 2
1.Kallus
-roslinna tkanka regeneracyjna zabliźniająca zranienia glównie roślin drzewiastych powstaje w trakcie ukorzeniania sadzonek gojenia ran zrastania tkanek w miejscu szczepienia
Totipotencja
-jest to zdolność pojedynczej komórki do odtwarzania całego organizmu dzięki obecności w komórkach pełnej informacji genetycznej
Ogranizmy transgeniczne
-organizmy poddane transformacji tzw.posiadajace zmodyfikowany genom.
Powstały z takiej komórki która włącza do swego genomu fragment DNA skonstruowany za pomocą inżynierii genetycznej.Fragment ten może zawierać dowolna informacje i może zostać włączony w prawie każde miejsce genomu
Biotransformacja
-proces w wyniku którego dochodzi do modyfikacji grup funkcyjnych związków organicznych przez żywe komórki lub izolowanie z nich enzymy.
2.Mikrowstrzeliwanie
- metoda transformacji polegająca na wprowadzeniu z bardzo dużą prędkością rzędu kilkuset metrów/sekundę do komórek metali pokrytych DNA. Prędkość tę uzyskuje się w specjalnie skonstruowanych akceleratorach, czynnikiem przyśpieszającym ruch cząsteczek metali jest proch strzelniczy lub obecnie hel
4 metody bezwektorowe
makroiniekcja, mikroiniekcja, elektroporacja, mikrowstrzeliwanie- wykorzystuje się do wprowadzenia konstruktów DNA u roślin 1-liściennych
3. Marker
-wyznacznik, dowolna, genetycznie kontrolowana cecha fenotypowa lub też dowolna różnica genetyczna wykorzystywana dla ujawnienia polimorfizmu osobniczego
Polimorfizm- całokształt różnic występujących między poszczególnymi gatunkami, odmianami, osobnikami, a także komórkami organizmu, które potencjalnie mogą być ujawniane za pomocą odpowiednio dobranego systemu markerowego.
Rodzaje markerów molekularnych
-izoenzymy (polimorfizm białek, kodominowanie)
-markery DNA (polimorfizm DNA) RFLP,MAAP, AFLP, STMS, SCAR (STS)
- RFLP badanie polimorfizmu
4.Rodzaje metod in vitro
-Powstanie zarodków somatycznych kulturach tkanek i organów
-Różnicowanie pąków przybyszowych w kulturach kalusa
-Różnicow pąków przybysz. bez pośrednictwa tkanki kalusowej
-Rozwój pąków bocznych w kulturze merystemów wierzchołkowych -
-Rozwój pąków bocznych w kulturze fragmentów pędów i innych organów
-Kultury primordiów pędowych
5. Kultury protoplastów - co to protoplasty, wykorzystanie, pozyskiwanie
Pozyskiwanie protoplastów
-fragment tkanki (np. Liść), podajemy sterylizacji oraz usuwamy epidermę
-skrawki umieszcza się w mieszaninie enzymów macerujących ścianę komórkową
-degradacja dwuetapowa: -najpierw działają enzymy peptyno- a następnie celulityczne
-degradacja jednoetapowa: - stosuje się mieszaninę różnych enzymów o aktywności totalnie degradującej ściany
-ważny dodatek stabilizatorów osmotycznych ( o charakterze jonowym i niejonowym)
-mieszaninę filtruje się przez sita
-delikatnie wiruje się w zależności od zastosowania stabilizatora frakcję protoplastów zbiera się w osadzie lub na powierzchni płynu
-przemywa kilkakrotnie roztworem stabilizatorów osmotycznych lub pożywką
ostatecznie protoplasty poddaje się ocenie morfologicznej i jakościowej
Wykorzystanie protoplastów:
Jako system jednokom. pozbawiony ścian komórkowych i zdolny do ich odtwarzania, protoplasty stanowią doskonały model doświadczalny służący do badania szeregu procesów przebiegających na poziomie: bosyntezy ścian komórkowych - badania właściwości plazmolemmy, składu błon, ładunku receptorów błonowych, mechanizmu aktywnego, pobierania i transportu związków drobnocząsteczkowych -funkcjonowanie organelli ,badanie wpływu patogenów na roślinę ,źródła pozyskania mieszańców somatycznych ,doskonały materiał do biotransformacji. wpływ hormonów na morfogeneze ,badania czynników wpływających stymulująco bądź hamująco na podstawowe funkcje metaboliczne
Protoplast:
-stanowią unikalną populację jednokomórkowych jednostek odizolowanych od siebie.
-każdy zastosowany czynnik eksperymentalny dociera do wszystkich komórek jednakowo tj. w tym samym czasie i z jednakową częstotliwością.
- protoplasty są bardzo przydatne w badaniach czynników indukujących morfogenezę oraz badaniach mutacyjnych
6. Co to bioreaktor, do czego stosowany, podział ze wzgl. na napowietrzanie
Podział bioreak ze wzgledu na system napowietrzania pożywki:
- bioreaktor zaopatrzone w mieszadła magnetyczne typu rotacyjne bębny, wirujące filtry,
- bioreaktor w których powietrze jest wtłaczane często pod ciśnieniem poprzez system membran umieszczonych w dolnej strefie urządzenia
- zwykłe napowietrzanie, - dodatkowe kolumny( bąbelkowe napowietrzanie), - poprzez systemy sylikonowych lub polipropylenowych węży zaopatrzonych w liczne perforacje i mikropory,
- bioreaktor z równomiernym rozprowadzeniem powietrza z góry bez mieszania pożywki,
- podświetlane przewody rozprowadzające tlen
Zasada działania bioreaktorów - zagwarantowanie optimum warunków wzrostu i rozwoju komórką somatycznym w kierunku zainicjowania embriogenezy somatycznej poprzez regulację i kontrolę wewnętrzną czynników fizyko - chemicznych
Do czego stosowany to chodzi pewnie o zasadę działania
zagwarantowanie optimum warunków wzrostu i rozwoju komórką somatycznym w kierunku zainicjowania embriogenezy somatycznej poprzez regulację i kontrolę wewnętrzną czynników fizyko - chemicznych.
A co to bioreaktor moze ktos wie to niech napisze
7. Co to banki genów, w jakich warunkach przechowujemy
Bank genów jest to miejsce przechowywania komórki tkanki zmodyfikowanej genetycznie , haloidy , rośliny użytkowe rzadkie lub ginące gatunki kolekcje ogrodów botanicznych lub arboretów , roślin transgenicznych przy pomocy procesów długo lub krotko terminowych
Przechowywanie materiału roślinnego
Krótkoterminowe przechowywanie materiału roślinnego w stosunkowo niskiej temp. Ok. 4°C, przy niskim natężeniu światła i na ubogich pożywkach.
Długoterminowo-
- w temp. 70°C (zamrażanie przemian metabolicznych, chociaż istnieje niebezpieczeństwo powolnego utleniania tłuszczów oraz wzrost ilości mikrokryształów lodu w komórkach
- w temp. ?196°C (temp. Ciekłego azotu) komórki przez wiele lat nie tracą żywotności
Przechowywanie komórek in vitro w bankach genów (zamrażanie)
-.wzrost wstępny
-krioprotekcja (krioprezerwacja)
-.zamrażanie
-przechowywanie właściwe (?196°C)
-odmrażanie
-przywrócenie właściwego tempa wzrostu komórek
Od Moni
1. Wymień metody rozmnażania in-vitro
-Powstanie zarodków somatycznych kulturach tkanek i organów -Różnicowanie pąków przybyszowych w kulturach kalusa -Różnicowanie pąków przybysz. bez pośrednictwa tkanki kalusowej-Rozwój pąków bocznych w kulturze merystemów wierzchołkowych -Rozwój pąków bocznych w kulturze fragmentów pędów i innych organów -Kultury primordiów pędowych.
2.
2. Co to są kultury protoplastów, jak je pozyskujemy i do czego wykorzystujemy?
Kultury protoplastów stanowią unikalną populację jednokomórkowych jednostek odizolowanych od siebie, pozbawionych ść. kom. I zdolnych do ich odtworzenia.
Pozyskiwania: - fragment tkanki podajemy sterylizacji oraz usuwamy epidermę - maceracja ść. kom. (jedno lub dwu etapowa) - dodajemy stabilizatory osmotyczne ( o charakterze jonowym i niejonowym) - mieszaninę filtruje oraz wirujemy - zebranie frakcji protoplastów -przemywa kilkakrotnie roztworem stabilizatorów osmotycznych lub pożywką - ostatecznie protoplasty poddaje się ocenie morfologicznej i jakościowej
Wykorzystanie: - badania nad bosyntezą ścian komórkowych - badania właściwości plazmolemy, składu błon itp. - funkcjonowanie organelli -badanie wpływu patogenów na roślinę -źródła pozyskania mieszańców somatycznych - doskonały materiał do biotransformacji - adania nad wpływ hormonów na morfogeneze - badania czynników wpływających stymulująco bądź hamująco na podstawowe funkcje
3.
3. Bioreaktor. eksplantat, organogeneza pośrednia.
Bioreaktor - użadenie służace da zapewnienia optymalnych warunków wzrostu i rozwoju kom. somatycznym w kierunku zainicjowania embiogenezy somatycznej.
Eksplantat - Fragment rośliny umieszczony na pożywce w celu uzyskania tk. kalusowej, rozmnożenia rośliny lub zregenerowania jej.
Organogeneza pośrednia - odtwazanie organu lub całej rośliny nie bezposrednio z eksplantatu, ale za pośrednicstwem tk. kalusowej powstałej na eksplantacie.
4.
4. Metody zabezpieczania genomu i jego reaktywacja.
Aby moc przechowywać genom należy posiadać miniumu jedna komórkę zawierająca pożądany mat. gen. Które uzyskuje się hodując na zubożonej pożywce, aby otrzymać małe i słabo zwakuolizowane komórki, które następnie poddaje się krioprotekcji, poczym zamraża. Przechowuje się je w temp. -196 C (temp. Ciekłego azotu) gdyż w takich warunkach przez wiele lat kom. nie traci żywotności. Aby je reaktywować należy je rozmrozić i zapewnić warunki przywracające właściwe tępo wzrostu.
5.
5. Sztuczne nasiona - to zarodki somatyczne poddane procesowi dehydratacji a nastepnie otoczkowane.
6.
6. Przykłady roślin transgenicznych: - kukurydza Bt., bawełna Bt, soja, rzepak, ziemniaki, pomidor, tytoń
7.
Rodzaje transgenezy i jej efektywność (chyba )
a) wektorowe - inaczej pośrednie, wprowadzanie mat. gen. za pomocą plazmidów, efektywnośc jest wysoka, ale metoda ta sprawdza się głównie u roślin jedno liściennych.
b) bezwektorowa (bezpośrednia) - mat. gen. wprowadzany jest za pomocą mikrowstrzeliwania, metoda wprawdzie jest skuteczna dla jedno i dwu liściennych, ale z racji częstych uszkodzeń mechanicznych czy nadmiaru kopi jest mało efektywna.
8.
Embriogeneza somatyczna na przykładzie poinsecji. (to jest gwiazda betlejemska)
* Faza proembriogenna ( inicjacja embriogenezy)
-kultura wstępna- eksplantant (merystem wierzchołkowy) pobrany z rośliny rosnącej w szklarni umieszczony na pożywce zestalonej agarem indukującej kalusowanie. Po 2-3 tygodniach kalus przenosi się na pożywkę płynną o tym samym składzie i umieszcza się na wytrząsarce.
-pasażowanie- po kolejnych 3 tyg agregaty komórek filtruje się a większe skupiska komórek osadzone na sitach przenosi ponownie na pożywkę zestaloną agarem, celem wyprodukowania tzw „ wtórnych kalusów” mających zdolność do zarodnikowania klonalnego
-pozyskiwanie inokulum wyjściowego - po 2 tyg szybko rosnącą masę poddaję się filtrowaniu na sitach i uzupełnia w 2\3 swieżą pożywką, otrzymana zawiesina stanowi suspensję wyjściową dla bioreaktora
* Kultury w bioreaktorach - pożywka płynna ( ściśle kontrolowane warunki wewnętrzne). Zarodki stopniowo osiągaja stadium globuli i dalej stadium serca. Barwa suspensji zmienia się z białawej na zielonkawo- brązową
*Konwersa embrionów w rośliny
-zarodki usuwa się z bioreaktorów, odsącza się na sita i umieszcza na szalkach Petriego na pożywce zestalonej pozbawionej auksyn -po 3 tyg. normalnie rozwijające się zarodki izolowane są od form dewiacyjnych i kalusujących -prawidłowo rozwijające się zarodki ponownie się umieszcza na pożywce o tym samym składzie i po 1-2 tyg zarodki kiełkują wytwarzając długi hypokotyl charakterystyczny dla poinsecji -po osiągnięciu 20 -25 mm eksplantaty przenosi sie do szklarni ( przeżywalność ok 90 %)
9.
Biblioteka genowa - to samo co bank genów.
10.
Hybrydyzacja somatyczna - polega na zlewaniu się protoplastów z czego powstaje sekcja heterokarjocytów (nowe kombinacje genetyczne) z których odtwarzamy całe rośliny o nowych właściwościach.
11.
Biotransformacja - to proces w wyniku którego dochodzi się do modyfikacji grup funkcyjnych związków organicznych przez żywe kom. lub wyizolowane z nich enzymy.
12.
Merystemy wierzchołkowe (primordiów pędowych)
1. Zakładamy je izolując z pąków wierzchołkowych merystemy z 3 zawiązkami( primordiami) liściowymi , umieszczamy je na pożywce płynnej, ważne jest: - skład pożywki(NAA•BAP), - cyrkulacja, - objętość płynu i tkanki, - temp, - intensywność naświetlenia, - częstotliwość
2. Po wstępnym okresie stabilizacji- intensywne namnażanie primordiów pedowych, które tworzą zielone eulorofilowe agregaty
3. Po wyłożeniu ich na pożywkę zestaloną z dodatkiem auksyny→ ukorzenianie→ regeneracja rośliny
Metoda znalazła zastosowanie w masowej produkcji wielu gat roślin 1 i 2 - liściennych oraz drzewiastych, ma bardzo wysoki współczynnik namnażania, porównywalny do embriogenezy somatycznej.
13.
Etapy klonowania in-vitro
I FAZA: 1.wybór rośliny matecznej, pobranie organu, dobór pożywki 2.stabilizacja kultury- uzyskanie zdolnego do regeneracji eksplantantu (pierwsze przyrosty tkanki kalusowej, rozwój pąków, pędów)
II FAZA: szereg pasaży tkanki kalusowej, paków przybyszowych, zarodków, wierzchołków, pędów - na świeża pożywkę
III FAZA:
-ukorzenienie eksplantatów -przygotowanie do wysadzenia w pobliżu lub do gruntu -przywrócenie autotroficzności -aklimatyzacja. Z chwila wysadzenia do gruntu proces mikrorozmnażan
Pytania od Prezesa
1 porownaj PCR ilosciowy i jakosciowy
2 elektroforeza
3 enzymy restrykcyjne (tepe i lepkie konce)
4 odpornosc na herbicydy ( modyfikacja, dzialanie herbicydu ) 5 bakterie agrobacterium tumefaciens co robi ( cos z transformacja)
6 biotransformacja ( etapy, rodzaje) 7 kultury merystemow
8 protoplasty ( otrzymywanie, wykorzystanie )
9 sztuczne nasiona (otrzymywanie, co to jest)
10 etapy aklimatyzacji roslin z kultur in vitro (przebieg mikrorozmnazania : 4 fazy )
Biotechnologia - termin wprowadzony pod koniec lat 50-tych XX wieku, oznacza konstruowanie nowych szczepów drobnoustrojów i linii komórkowych organizmów wyższych o niespotykanych dotąd walorach technologicznych. Biotechnologia znana dziś ze względu na osiągnięcia biologii molekularnej oraz inżynierii genetycznej towarzyszyła człowiekowi od zarania dziejów( procesy mikrobiologicznej fermentacji)
Biotransformacja - proces w wyniku którego dochodzi do modyfikacji grup funkcyjnych związków organicznych przez żywe komórki lub izolowanie z nich enzymy.
Organizmy transgeniczne - organizmy poddane transformacji tzn. posiadające zmodyfikowany genom. Powstały z takiej komórki, która włączyła do swego genomu fragment DNA skonstruowany za pomocą inżynierii genetycznej. Fragment ten może zawierać dowolna informację i może zostać włączony w prawie każdym miejscu genomu.
Okresy w biotechnologii:
- okres przedpasteurowski( od zarania ludzkości do poł XIXw) - era spontanicznych procesów fermentacyjnych w celu pozyskania ważnych procesów spożywczych: chleba, wina, piwa itd.
- okres przejściowy( II poł XIXw oraz pierwsze 40- lecie XXw) - tworzenie podstaw biotechnologii wielkoprzemysłowej, zapoczątkowanej przez L. Pasteura- era mikrobiologii z wykorzystaniem aseptycznych kultur drobnoustrojów. Opracowanie technologii produkcji kw mlekowego, cytrynowego, acetonu, butanolu oraz kultur drożdży
- era nowoczesnej biotechnologii - datowana do końca II wojny św tj od opracowania przemysłowej produkcji penicyliny w warunkach aseptycznych w bioreaktorach: * podokres 1 ( do roku 1970) - opracowano nowe technologie m in biosyntezy antybiotyków, aminokwasów, enzymów, oraz po raz pierwszy zastosowano biokatalizatory immobilizowane * podokres 2( od roku 1970 do dzisiaj) - praktyczne wykorzystanie genetyki i biologii molekularnej w biotechnologii. Narodziła się koncepcja manipulacji genami poza komórką. Opracowano szereg nowych biotechnologii m in produkcję insuliny, hormonów wzrostu itd.
Zastosowanie współczesnej biotechnologii:
Produkcja żywności: - tradycyjne procesy fermentacyjne( produkcja pieczywa, produktów mlecznych), - nowe technologie mikrobiologii( witaminy, aminokwasy), - zastosowanie enzymów do wyrobów mleczarskich( kefiry, jogurty), - utrwalenie żywności( antyutleniacze)
Rolnictwo: - produkcja pasz( preparaty białkowe, witaminowe, kiszonki roślinne),- kultury komórkowe i tkankowe in vitro, - ochrona roślin( bioinsektycydy, antybiotyki), - lecznictwo zwierząt( szczepionki)
Ochrona środow: - oczyszczanie ścieków, filtry biologiczne, czynne osady
Co to są i na czym polegają biotransformacje roślin ?
Reakcje biotransformacji w różnych kulturach zawiesinowych. Zastosowanie: - do produkcji metabolitów wtórnych, - do biotransformacji egzogennych prekursorów w bardzo wartościowe, bądź pożądane produkty.
Typy reakcji biotransformacji: - utlenianie, redukcja, - hydroliza, - rozszczepienie wiązania C-C, - kondensacja, - izomeryzacja
Substraty: naturalne prekursory, - związki syntetyczne( ksenobiotyki), zw obce roślinie
Materiał stosowany: - izolowane enzymy, - zawiesiny komórkowe, agregaty komórek, - immobilizowane( unieruchamiane) enzymy i komórki
Lokalizacja procesu biotransf: - wytrząsanie kolby, - bioreaktory
Dane ilościowe: - na swiecie jest ok. 137 gat roślin leczniczych i aromatycznych wykorzystywanych do produkcji matabolitów wtórnych lub do biotransformacji prekursorów, - w Polsce tylko ok. 40 gat roślin ( zostało przebadanych)
Korzyści biotransf: - wysoka wydajność( często bliska 100%), - duża czystość produktu reakcji, - wysoka specyficzność reakcji, - możliwość zajścia reakcji w miejscach mało reaktywnych, - otrzymanie dużej ilości produktów występujących w małych ilościach w roślinie, - otrzymanie produktów o zwiększonej aktywności fermakologicznej lub zmniejszonej toksyczności
Biotransf z użyciem kultur zawiesinowych - jest to najprostszy model doświadczalny, nie ma dodatkowego etapu wiązania komórek z nośnikiem, komórki nie ulegają zmianom fizjologicznym
Czynniki regulujące reakcje biotransf: - rodzaj kultury( zawiesina, kultury organów np. korzeni), - stadium rozwojowe kultury i jej warunki, a zwłaszcza nadtlenianie, skład pożywki i jej pH, - struktura chemiczna substratu, jego stężenie, właściwości
Przykłady leków roślinnych:
OPIUM - otrzymany z gat maku pochodzącego z Azji Mniejszej, legendy o opium spisano już egipskimi hieroglifami, Homer w Odysei wspomina o leku który „uśmierza i żółć i gładzi pamięć wszelkiego zła”, opium zawdzięcza właściwości jednemu z 15 skł czynnych odkrytych w niedojrzałych makówkach tj: „ morfinie”, w II poł XIXw udało się zmodyfikować chemicznie morfinę otrzymując silniejszą w uśmierzaniu bólu- heroinę.
KOKAINA - pochodzi z liści kokainowego krzewu zwanego krasnodrzewem, liscie zawieraja 14 innych skł, wszystkie służą do produkcji leków znieczulających i innych syntetyków, liście kokainowe słyną jako środek stymulujący do nadludzkiej pracy dla andyjskich robotników i tragarzy, żuty z dodatkiem limy lub popiołu roślinnego powoduje uwalnianie się aktywnych substancji stymulujących układ nerwowy i prace mięśni, nie powoduje u Indian żujących liście uzależnienia jak w postaci czystej.
MARIHUANA - zwana haszyszem, otrzymywana z konopi indyjskich( haszysz - żywica z żeńskich kwiatów konopi)
CHININA - pochodzi z kory wiecznie zielonego drzewa chinowca, rosnącego na stokach Andów w Ameryce Płd., najlepszy środek na malarie na którą zapada co roku 100 mln ludzi, konkwistadorzy i jezuici przywieźli go z Europy w XVIIw, długo odrzucany i wyśmiewany, pod k XIX w o korze chinowca stało się głośno, wycięto prawie całą populacje tych drzew, roślinę uratował brytyjski kolekcjoner nasion który przesłał partie nasion do Europy, zakupił je rząd Holandii, obecnie produkuje się syntetyczna chininę - chociaż pewne szczepy zarodzce malarii stają się odporne na syntetyki w przeciwieństwie do naturalnego specyfiku
ASPIRYNA - pierwotnie otrzymywana z wierzby białej oraz z byliny wiązówki błotnej, już 2000 lat temu Dioskorides w swym dziele pisał o przeznaczeniu wierzby w leczeniu podagry, reumatyzmu, bólu zęba, głowy, w XIX w zidentyfikował czynny skł - kw salicylowy, a potem zmodyfikował do kw acetylosalicylowego, lista zastosowań jest niesłychanie długa i co roku dochodzą nowe
DISGENINA - odkryta w latach 40-tych XXw, substancja pochodzi z pochrzyny ?, rodzina leśnych pnączy, odkryta przez amerykańskich chemików, posłużyła do produkcji pierwszej tabletki antykoncepcyjnej, ten fakt zapoczątkował na świecie rewolucje seksualna
Opłacalność biotransformacji:
Kalkulacja kosztów: według szacunku przemysłowej produkcji metabolitów wtórnych na drodze kultur tkankowych jest opłacalna gdy cena kg produkcji przewyższa 1000$
Przykłady biotransf:
TAKSOL( cytostatyk) -diterpen, wyst w korze, igłach i korzeniach cisa. Kuracja dla jednego pacjenta wymagałaby ścięcia 3 dojrzałych okazów bardzo wolno rosnących drzew. Z tego względu syntezę taksolu prowadzi się w kulturach zawiesinowych. Planuje się izolowanie genów odpowiedzialnych za biosyntezę taksolu i przeniesienie ich do komórek szybko namnażajacych się.
Kastanospermina - izolowana z Castanospermum australe, hamuje proces glikozylacji białek, płaszcza wirusów, w tym HIV
Disgenina - steroid otrzymywany z Discoreadaltoidea, używany do produkcji leków , które konfigurują na liście najlepiej sprzedających się.
Winblastyna i winkrystyna- używane w terapii nowotworowej.- kuracja winblastyną daje trwałe wyleczenia u ponad 80 % chorych na ziarnice złośliwą. - winkrystyna daje ustanie objawów u 90 % dzieci cierpiących na ostre białaczki limfatyczne.
Rośliny zmodyfikowane genetycznie
Transgen- właściwy gen, przeniesiony do transformowanej rośliny. Nie ma on w genomie rośliny swojego odpowiednika w postaci allelu, stąd roślina transgeniczna jest heterozygotą.
Linia transgeniczna- samozapylone rośliny transgeniczne o nowym fenotypie dają potomstwo rozszczepiające się lub jednolite. Te ostatnie pochodzą z homozygoty i dają ustaloną linie transgeniczną.
Zmienność samaklonalna- rośliny powstałe z transgenicznej komórki i mogą wykazywać różne zmienione właściwości, co nazywamy zmiennością samoklonalną- dziedziczoną trwale w kolejnych pokoleniach.
Metody wprowadzania obcych genów:
-transformacja za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, A. rhizogenes (metoda wektorowa). Przydatna dla roślin 1-liściennych.
-transformacja bezpośrednia (metoda bezwektorowa)- mikrowstrzeliwanie. Przydatna dla roślin 1- i 2-liściennych.
*metoda pośrednia- stosuje się komórki bakterii - E. coli i A. tumefaciens jako biologiczne „pociski” do transformacji. Przydatna dla roślin 1- i 2-liściennych
*bezpośrednie transformowanie protoplastów za pomocą elektroporcji lub glikolu polietylenowego- PEG
Etapy transformacji wektorowej:
-kokultywacja- umieszczenie eksplantatów (fragmentów liści, korzeni, liści) w roztworze bakterii, - odpłukanie bakterii, - umieszczenie eksplantatów w pożywce z antybiotykiem w celu zabicia bakterii, - umieszczenie dalsze materiału roślinnego na pozywce - regeneracyjnej z odpowiednim czynniekiem selekcyjnym: antybiotykiem lub herbicydem, - regeneracja roslin jest możliwa najczęśćiej z pojedynczych transformowanych komórek we wczesnym etapie regeneracji. Przeprowadza się testy na aktywność genów reporterowych wprowadzonych dodatkowo do plazmoidów. Geny te są odpowiedzialne za kodowanie produktów które łatwo wykrywa się testami enzymatycznymi, histochemicznymi lub fluorymetrycznymi.
Mikrowstrzeliwanie:( zasady metody) - metoda transformacji polegająca na wprowadzeniu z bardzo dużą prędkością rzędu kilkuset metrów/sekundę do komórek metali pokrytych DNA. Prędkość tę uzyskuje się w specjalnie skonstruowanych akceleratorach, czynnikiem przyśpieszającym ruch cząsteczek metala jest proch strzelniczy lub obecnie hel.
Przydatność metody: rośliny 1-liścienne, nagonasienne, 2-liścienne trudne dotąd do stransformowania np. soja, fasola
Obieg transf:- niedojrzałe zarodki, - kalus enbriogeniczny z zarodków, - niedojrzałe kwiatostany, - zawiesina komórek
Wady metody: - niska wydajność transf ( mechaniczne uszkodzenia komórek, szok akustyczny), - odrywanie się metalu od DNA, - wprowadzenie do genomu roślinnego zbyt dużo kopii genów jednocześnie
Jak funkcjonują bioreakt? Zasada działania bioreakt - zagwarantowanie optimum warunków wzrostu i rozwoju komórką somatycznym w kierunku zainicjowania embriogenezy somatycznej poprzez regulację i kontrolę wewnętrzną czynników fizyko - chemicznych.
Komputerowej kontroli podlegają następujące parametry: - dozowanie świeżej pożywki, - kontrola ilości namnażanych komórek, - temp( z dokładnością do 0,1◦), - szybkość rotacji pozywki( przemiszczania się suspensji w bioreaktorze) zwykle 50 rpm, ponizej komórki sedymentuja i zamierają, pH sygnału aktywowania pompy perystaltyczne wtłaczające sterylny roztwór kwasu lub zasady, - poziom tlenu regulowany droga dodatkowego dotlenienia lub zmiany szybkości rotacji pożywki (poziom tlenu mierzy elektroda tlenowa), -potencjał redox, - stężenie CO2
Podział bioreak ze względu na system napowietrzania pożywki:
- bior zaopatrzone w mieszadła magnetyczne typu rotacyjne bębny, wirujące filtry, - bior w których powietrze jest wtłaczane często pod ciśnieniem poprzez system membran umieszczonych w dolnej strefie urzadzienia, - zwykłe napowietrzanie, - dodatkowe kolumny( bąbelkowe napowietrzanie), - poprzez systemy sylikonowych lub polipropylenowych węży zaopatrzonych w liczne perforacje i mikropory, - bior z równomiernym rozprowadzeniem powietrza z góry bez mieszania zawartości pożywki, - podświetlane przewody rozprowadzające tlen
Rozmnażanie wegetatywne in vitro( = rozmn klonalne, mikrorozmnażanie, masowe rozmn)
Rozmnażanie wegetatywne in vitro:
1.Powstanie zarodków somatycznych kulturach tkanek i organów
2.Różnicowanie pąków przybyszowych w kulturach kalusa
3.Różnicow pąków przybysz. bez pośrednictwa tkanki kalusowej
4. Rozwój pąków bocznych w kulturze merystemów wierzchołkowych
5.Rozwój pąków bocznych w kulturze fragmentów pędów i innych organów
6. Kultury primordiów pędowych
Rozmnażanie wege in vitro realizuje się poprzez:
1.Organy przysposobione do rozmnażania wegetatywnego (skrócone pędy)-bulwy, cebule, kłącza
2.Sadzonki-odciete części rośliny
3.Odkłady
4.Transplantacje: - szczepienie, - podkładki, - okulizacja
Dezynfekcja i traktowanie wstępne:
1.przemycie eksplantantu woda bieżącą przez1-2 godz. często z dodatkiem detergentów
2.sterylizacja powierzchniowa 70%-etanol-30 sek. ; 80%-etanol-5 min.(pąki drzew)
3.dezynfekcja właściwa:
-podchloryn wapnia lub sodu 2-10%- 5-20 min.
-HgCl2 0,2- 1,0% 3-10 min.
- chloroamina 0,2- 1,0% 5-10 min.
4.przemywanie 3-6- krotne sterylną wodą
Pożywka (Murashige i Skooga)
1.nieroganiczne sole (mikro i makroskl.)
2.witaminy
3.organiczny N
4.regulatory wzrostu
5.żródło energii i węgla + wyciąg: z mleczka kokosowego, kukurydzianego, wyciąg z drożdży, bielma itd.
Warunki zewnętrzne:
-światło
-temp.ok.25"C
-źródło węgla (sacharoza)
-witaminy
- wielkość eksplantatu
AUKSYNY:
-stymulują podziały kom.w kierunku tworzenia się tkanki kalusowej
-wpływają na organogenezę kalusa
-stymulują powstawanie tkanki embriogennej →zarodki somatyczne
-indukują merystemy korzeni przybyszowych na pędach
- stymulują syntezę etylenu (efekt niepożądany) i starzenie się kultur
CYTOKININY:
-pobudzają podziały kom. brak cytokinin zwiększa poliploidalność jąder
-wpływają na różnicowanie się ksylemu i lignifikację komórek
-stymulują wyrastanie pędów bocznych
-hamują indukcję, wzrost i rozwój korzeni
-redukują długość pędów
-opóźniają starzenie
-likwidują zjawisko dominacji wierzchołkowej
- "odmładzają" i zwiększają wigor eksplantantów- rejuwenalizacja drzew i krzewów, ukorzenianie pędów
-niskie dawki cytokininy +auksyna stymulują rozwój tkanki embriogennej→ zarodki somatyczne
GIBERELINA: (GA 3)
-pobudza wydłużanie międzywęźli pędów
-przyspiesza wzrost merystemów
-stymuluje proliferację pędów bocznych
-hamuje ukorzenianie pędów
-hamuje indukcję embriogenezy somatycznej
-stymuluje kiełkowanie dojrzałych zarodków
ABA: (kwas abscysynowy)
-inhibitor wzrostu
-stymuluje tworzenie kalusa
-współdziała z cytokininą i auksyną w dojrzewaniu zarodków somatycznych
-inicjuje embriogenezę
-pozytywnie wpływa na dojrzewanie i kiełkowanie sztucznych nasion
-inicjuje rozwój minibulw
-zwiększa żywotność protoplastów i ich dzielenie się
ETYLEN:
-hamuje podziały kom. i morfogenezę
-wprowadza komórki w stan spoczynku
-hamuje embriogenezę somatyczną
-wywołuje objawy starzenia się eksplantantów (żółknięcie i opadanie liści), epinastię i deformację organów
-wpływa na zanik wigoru
-stymuluje ukorzenianie sadzonek
Zdolności regeneracyjne roślin:
RESTYTUCJA - uzyskanie rośliny z np. .liścia innej rośliny, powstała z różnych organów rośliny matecznej
TOTIPOTENCJA - powstanie rośliny z 1 komórki
PRZEBIEG MIKROROZMNAŻANIA:
I FAZA:
1.wybór rośliny matecznej, pobranie organu, dobór pożywki 2.stabilizacja kultury- uzyskanie zdolnego do regeneracji eksplantantu (pierwsze przyrosty tkanki kalusowej, rozwój pąków, pędów)
II FAZA: szereg pasaży tkanki kalusowej, paków przybyszowych, zarodków, wierzchołków, pędów - na świeża pożywkę
III FAZA:
-ukorzenienie eksplantatów
-przygotowanie do wysadzenia w pobliżu lub do gruntu
-przywrócenie autotroficzności
-aklimatyzacja
Z chwila wysadzenia do gruntu proces mikrorozmnażania jest zakończony
Zdolności morfogenetyczne kom roslinnych:
- kom. roślinne są totipotentne czyli maja zdolność do dzielenia się oraz odtwarzania poszczególnych organów i całego organizmu z pojedynczej kom. rośl.
Ujawnienie pełnej totipotencji może nastąpić drogą organogenezy bezpośredniej i pośredniej
*ORG.BEZPOŚREDNIA
-pierwotny eksplantat -(roślina) organ
- pierwotny eksplantat- zarodek somatyczny-organ (roślina)
*ORG.POŚREDNIA
- pierw ekspl.- kalus (zarodek, zawiązki korzenia, pędu)- organ (roślina)
Najbardziej przydatne do rozwoju w kulturze in-vitro są eksplantaty zawierające kom merystemów wierzchołkowych, bocznych
i interkalarnych, potem w kolejności kom.kambialne, floem, okolnica i promienie rdzeniowe.
U nasiennych regeneracja następuje łatwiej u dwuliściennych niż jednoliść. a najtrudniej u nagonasiennych. U każdego gatunku można wybrać fragment rośliny dający dobre efekty.
Jeśli zregenerowany organ powstał z grupy kom. niejednorodnych genetycznie to otrzymamy CHIMERĘ.
Bodźcem wyzwalającym odróżnianie w kulturach in vitro jest odizolowanie kom. i tkanek od rośliny matecznej oraz wpływ regulatorów wzrostu zastosowanych w pożywce.
KULTURA KALUSA
Zastosowanie:
-materiał wyjściowy do otrzymywania zawiesin komórkowych i protoplastów
-szeroko wykorzystany do mikrorozmnażania i transformacji
-do pozyskiwania na skale masową zarodków somatycznych
-do biotransformacji i pozyskiwania metabolitów wtórnych
-do badań podstawowych nad morfologią i strukturą komórki
Geneza:
-w tworzeniu kalusa mogą brać udział wszystkie tkanki eksplantatu
-mogą tez brać udział tylko nieliczne tkanki np. kom. miękiszowe rdzenia łodygi lub kambium wiązkowe
BUDOWA TKANKI KALUSOWEJ
-początkowo są to niezróżnicowane kom. parenchymatyczne o różnym kształcie i wielkości
-po pewnym czasie trwania kultury kalus wykazuje heterogeniczność i obok kom. parenchymatycznych powstają nieregularne formacje tk. przewodzących, centra merystematyczne
-kalus może mieć strukturę luźna i łatwo się rozpadać lub bardzo zwartą
-barwa może być zróżnicowana od białej, żółtej, pomara. przez różne odcienie zieleni
-analizy cytologiczne kalusa wykazują na wielką różnorodność genetyczną kom.-od diploidalności do poliploidalności
KULTURA PĄKÓW PRZYBYSZOWYCH:
-w różnych częściach roślin z mniej lub bardziej dojrzałych tkanek mogą powstawać wierzchołki pędów zwane przybyszowymi .Tworzą się one na różnych organach roślin (korzeniach, łodygach, liściach)
W łodygach i liściach pąki przybyszowe powstają z epidermy i subepidermy. Eksplantaty korzenia wytwarzają pąki przybyszowe w korze pierwotnej, a z budowy wtórnej tworzą pąki w sąsiedztwie albo w obrębie floemu wtórnego.
Kierunek organogenezy eksplantatów pierwotnych a wiec tworzenie pędów korzeni przybyszowych lub zarodków somatycznych zależy nie tylko od rodzaju wzajemnych proporcji zastosowanych auksyn i cytokinin ale również od rodzaju tkanki, gatunku rośliny i kondycji kultury.Metoda wykorzystywana do rozmnażania roślin cebulowych.
Embriogeneza somatyczna - jest procesem biologicznym, podczas którego formują się zarodki z komórek wegetatywnych, wyzwolenie potencjału do tworzenia się zarodka w pojedynczej kom lub ich grupie nazywane jest indukcja embriogeniczności.
Budowa zarodka somatycznego: - istnieje wiele wspólnych cech w formowaniu zarodków somatycznych i zygotycznych, a poszczególne stadia rozwoju zarodków( globularne, serca) sa podobne lub wręcz identyczne, - zarodki mają wyraźne zaznaczoną biegunową strukturę typu pęd- korzeń. Efektem końcowym embriogenezy somatycznej jest kompletna roślina z wykształconym jednym liscieniem(1-liścienne) lub dwoma liścieniami( 2-liścienne), a także epikotylem i korzonkiem zarodnikowym.
Zastosowanie: - metoda ta może znaleźć istotne zastosowanie w nasiennictwie i szkółkarstwie, ze względu na niezwykle wysoki współczynnik rozmnażania, - przykładowo w Cyclamen persicum do 40 tys sztuk zarodków w 1 litrze pożywki w czasie 10 tyg, - metoda znalazła zast do produkcji drzew leśnych głównie iglastych, roślin ozdobnych i warzywnych.
Izolowane merystemy
Alternatywne sposoby prowadzenia kultur merystemów:
1. Wielokrotny podział roślin które rozwinęły się z merystemów na „ sadzonki węzłowe” - metoda przydatna w wielkotowarowym systemie uprawy roslin ozdobnych, sadowniczych oraz Asparagus officinalis i Solanum tuberosum, zapewnia ciągłą produkcję mikrosadzonek identycznych z genotypem rośliny matecznej. Szczególna odmianą tej metody jest indukowanie organów spichrzowych np. mikrobulwek lub mikrokłączy u Alstromeria, Cymbidium, Gloriosa na pędzie uzyskanym z merystemu. Pożywki nie zawierają lub zawierają śladowe ilości substancji wzrostowych co zapobiega zmienności somaklonalnej.
2. Pobudzenie pojedynczego merystemu do podziału - poliferacja tk merystematycznej w której powstają liczne pąki i pędy na drodze organogenezy bezpośredniej( bez stadium kalusa), - duże wierzchołki pędów ( merystem wierzchołkowy, zawiązki liści i powierzchniowo usytuowane paki boczne) wkłada się na pozywkę z dodatkiem cytokinin o wysokim stężeniu co powoduje rozwój tzw wieloroślinek. Ponowne pasaże wieloroślinek gwarantuje w krótkim czasie uzyskanie tysięcy roślin potomnych, - wykorzystywana do propagacji m in Dianthus, Chrysantemum, Rosa multiflora, oraz drzew Malus czy Prunus.
3. W ramach tej techniki obiecująca jest metoda „ powiększania” lub „ rozszerzania” merystemów - praktykuje się wykładanie merystemów na pożywkę zawierającą retandanty( paklobutrazol, acymidol, diaminozyd, etylen lub etafon), - w efekcie merystem powiększa się 56-krotnie , po czym może być powtórnie podzielony i po kolejnych subkulturach przeniesiony na pozywkę bez substancji wzrostowych, na którego z każdego eksplantatu rozwiną się rośliny
4. poliferacja tk merystematycznej drogą regeneracji czyli organogenezy pośredniej poprzez stadium kalusa, rozwijające się pąki i pędy, - izolowane merystemy wykładane są na pozywki z dodatkiem dużych ilości auksyn przez co uzyskuje się efekt namnożenia kalusa, w tk kalusa pojawiają się centra merystematyczne z których dopiero masowo rozwijają się pęd i rośliny, - wadą jest duża tendencja do zmienności somaklonalnej
Kultura pędów bocznych( pachwinowych)
Inicjalnymi eksplantatami w tej metodzie mikrorozmnażania mogą być: - merystemy pąków wierzchołkowych lub bocznych, - wierzchołki pedów, - pąki kwiatowe( boczne), - fragmenty pędów z węzłem, parą liści i pąków bocznych, - wierzchołki mogą być izolowane z zarodków somatycznych. Wymienione eksplantaty zawierają: merystem, 2-3 zawiązki liści, oraz kilka paczków bocznych osadzonych w „ kątach liści”, inaczej nazywana sadzonkowaniem in vitro
Procedura postępowania
- po wyłożeniu na pożywkę nie zawierającą substancji wzrostowych paki nie krzewią się, rozwijają się w pojedynczą roślinkę.
Za pomocą tej metody rutynowo namnaża się wiele gat: Nephrolepis, Arhidiaceae, Spatiphyllum.
Tempo mikrorozmnażania:
1roslina mateczna→ daje 3-krotny wzrost co 4 tyg lub 6- krotny wzrost co 6 tyg→ milion roślin potomnych rocznie
Kultury primordiów pędowych
1. Zakładamy je izolując z pąków wierzchołkowych merystemy z 3 zawiązkami( primordiami) liściowymi , umieszczamy je na pożywce płynnej, ważne jest: - skład pożywki(NAA•BAP), - cyrkulacja, - objętość płynu i tkanki, - temp, - intensywność naświetlenia, - częstotliwość
2. Po wstępnym okresie stabilizacji- intensywne namnażanie primordiów pedowych, które tworzą zielone eulorofilowe agregaty
3. Po wyłożeniu ich na pożywkę zestaloną z dodatkiem auksyny→ ukorzenianie→ regeneracja rośliny
Metoda znalazła zastosowanie w masowej produkcji wielu gat roślin 1 i 2 - liściennych oraz drzewiastych, ma bardzo wysoki współczynnik namnażania, porównywalny do embriogenezy somatycznej.
Produkcja roślin in vitro na świecie
Rozmnażanie wegetatywne in vitro znalazłą zastosowanie przede wszystkim w produkcji takich roslin, które trudno się rozmnaża za pomocą tradycyjnych metod in vivo( rośliny ozdobne, drzewa leśne, odm heterozygotyczne) oraz rośliny elitarne o dużej wartości jednostkowej.
Morfologia i fizjologia aklimatyzowanych roślin:
1. Kutikula pozbawiona wosku, brak ochrony przed transpiracją
2. Nie funkcjonujace aparaty szparkowe( brak reakcji na ABA)
3. Asymilacja CO2 bardzo niska w przybliżeniu 2,6 mg•dm-3h-1( dorosłe rosliny ok. 10 mg CO2) Czasami bilans (-) przewaga oddychania
4. Zawartość chlorofilu spada
5. Często eksplantaty są nie ukorzenione, stąd dodatkowo problem indukcji rizogenezy
Okres fotosyntetycznej aklimatyzacji trwa ok. 4 tyg
Ukorzenianie: - stanowi 35-75% wszystkich kosztów mikrorozmnażania: * cecha gatunkowa, * dopuszczalne traktowanie regulatorami wzrostu( ex-vitro), * poza słojem np. IBA, NAA, * istotna wielkość eksplantatu, * rodzaj podłoża( mineralne)
Przygotowanie do samodzielnego wzrostu
-in vitro: pożywka ukorzeniająca, po właściwym ukorzenieniu uchylić zamknięte naczynia, usunąć agar,doodać fungicydy, umieścić w stałym podłożu (mineralne ,gleba)
-ex vitro: ukorzenianie poza szkłem (subst. stymulujące ukorzenianie), umieścić w stałym podłożu (mineralne, gleba)
CZYNNIKI KORZYSTNE
-wysoka wilgotność
-cieniowanie
-właściwy fotoperiod
-ogrzewanie podłoży
↓
po rozwinięciu nowych liści
-wyłączenie ogrzewania
-stopniowa redukcja wilgotności
-zwiększenie natężenia światła słonecznego
Podłoże mineralne np.Vernikulit, pianka poliuretanowa, perlit, wełna mineralna, kostki torfopodobne
Zalety:
-sterylne, wolne od patogenów
-ułatwia ukorzenianie dzięki specjalnej strukturze porowato-fibrylnej
-nie zawiera subst. odżywczych tj. zanieczyszczeń organicznych
-sprasowane w bryłach lub kostkach ułatwia transport roślin
-gwarantuje dogodną migrację i dyfuzję gazów
-zapewnia optymalną dystrybucję H2O
Warunki fotoautotroficzne
-wysokie nat. światła
-wysokie stężenie CO2
Zalety hodowli autotroficznej
1.namnażanie roślin jest 2 razy szybsze
2.można zredukować lub wyeliminować subst .wzrostowe
3.spada wilgotność poniżej 100% co hamuje m.in. syntezę etylenu, poprawia to wigor roślin, normalnie funkcjonują aparaty szparkowe
4.przy braku cukru spada % infekcji bakteryjnej i grzybowej
5.można prowadzić hodowlę w dużych pojemnikach-spadek kosztów
6.łatwa aklimatyzacja roślin przy wsadzaniu do gruntu
Korzyści z klonowania in vitro
- mikrorozmnażanie może być kontynuowane przez cały rok
-umożliwia powrót do formy juwenilnej
-ułatwia prace hodowlane (pozyskanie nowych odmian, skracanie cyklu hodowlanego, namnażanie genotypów niestabilnych-chimer)
-zastępuje szczepienie bądź okulizację
-umożliwia przechowywanie ogromnej ilości materiału namnożeniowego na stosunkowo małej pow.
-ułatwia fitosanitarne przemieszczanie się roślin między różnymi krajami
-dostarcza materiał wolny od mikroorg .patogenicznych
-przy doborze właściwej metody klonowania obniża koszty produkcji roślin
-gwarantuje stabilność genetyczną
Kultury protoplastów - stanowią unikalną populację jednokomórkowych jednostek odizolowanych od siebie.
-każdy zastosowany czynnik eksperymentalny dociera do wszystkich komórek jednakowo tj. w tym samym czasie i z jednakową częstotliwością.
-protoplasty są bardzo przydatne w badaniach czynników indukujących morfogenezę oraz badaniach mutacyjnych
Wykorzystanie protoplastów
Jako system jednokom. pozbawiony ścian komórkowych i zdolny do ich odtwarzania, protoplasty stanowią doskonały model doświadczalny służący do badania szeregu procesów przebiegających na poziomie:
- bosyntezy ścian komórkowych
- badania właściwości plazmolemy, składu błon, ładunku receptorów błonowych, mechanizmu aktywnego, pobierania i transportu związków drobnocząsteczkowych
-funkcjonowanie organelli
-badanie wpływu patogenów na roślinę
-źródła pozyskania mieszańców somatycznych
- doskonały materiał do biotransformacji
-wpływ hormonów na morfogeneze
- badania czynników wpływających stymulująco bądź hamująco na podstawowe funkcje metaboliczne
Pozyskiwanie protoplastów:
-fragment tkanki (np. Liść), podajemy sterylizacji oraz usuwamy epidermę
-skrawki umieszcza się w mieszaninie enzymów macerujących ścianę komórkową ( istotny czas inkubacji, temp, pH)
-degradacja dwuetapowa: -najpierw działają enzymy peptyno- a następnie celulityczne
-degradacja jednoetapowa: - stosuje się mieszaninę różnych enzymów o aktywności totalnie degradującej ściany
-ważny dodatek stabilizatorów osmotycznych ( o charakterze jonowym i niejonowym)
-mieszaninę filtruje się przez sita
-delikatnie wiruje się
-w zależności od zastosowania stabilizatora frakcję protoplastów zbiera się w osadzie lub na powierzchni płynu
-przemywa kilkakrotnie roztworem stabilizatorów osmotycznych lub pożywką
- ostatecznie protoplasty poddaje się ocenie morfologicznej i jakościowej
Fuzja protoplastów:
Zlanie protoplastów ułatwiają tzw. stymulatory które mogą być różnego pochodzenia:
- natury fizycznej: wirowanie, impulsy elektryczne, elektroforeza
- natury chemicznej: glikol polietylenowy, alkohol poliwinylowy, lektyny, wysokie stężenie jonów wapnia o silne alkalicznym pH
Somatyczna hybrydyzacja protoplastów polega na:
Fuzja protoplastów
↓
sekcja heterokariocytów
↓
hodowla mieszańców (krzyż. wsteczne)
↓
pełna regeneracja roślin ( nowa jakość)
Wydajność fuzji 30%
Heterokariony 10-40%
Selekcja heterokariocytów
Do czynników identyfikujących i selekcjonujących należą:
- barwienie różnymi barwnikami „ przyżyciowymi” np: rodamina B- fluorescencyjna
-okresowe stosowanie różnych inhibitorów metabolicznych
-analiza izoenzymatyczna
-stosowanie różnych markerów cytochemicznych i molekularnych
Kontrola zdrowotności kultur
Metody eliminowania wirusów:
-Chemioterapia- stosowanie związków, które włączają sie w metabolizm wirusa i hamują jego namnażanie ( antymetabolity) również antybiotykoterapia
-Termoterapia- działanie podwyższoną temperaturą ( ok 3 tyg w temp. 35-40C ) na roślinę w celu inaktywacji wirusów
-Izolowanie merystemów wierzchołkowych z roślin poddanych uprzednio termoterapii
Kontrola zdrowotności namnożonego materiału.
-testowanie biologiczne
-testy sereologiczne ( gotowe przeciwciało zawarte w surowicy łączy się z wirusem zawartym w ekstrakcie z rośliny)
-analiza pod mikroskopem elektronowym i fluorescencyjnym
-testy enzymoimmunologiczne- ELISA
-metody molekularne( hybrydyzacja kwasów nukleinowych wirusa i znakowanej sondy)
Jak funkcjonują bioreaktory?
Zasada funkcjonowania bioreaktorów:
-zagwarantowanie optimum war. wzrostu i rozwoju kom somatycznych w kierunku zainicjowania embriogenezy somatycznej poprzez regulację i kontrolę wewnętrznych czynników fizyko-chemicznych.
Komputerowej kontroli podlegają następujące parametry:
-dozowanie świeżej pożywki
-kontrola namnażanych komórek
-temp
- szybkość rotacji pozywki( przemieszczanie się suspensji w bioreaktorze), zwykle 50 rpm, poniżej komórki sedymentują i zamierają
-pH - sygnał uaktywnia pompy perystatycznej wtłaczającej sterylny roztwór kwasu lub zasady
-poziom tlenu
-potencjał redox
-stężenie CO2
Zbyt gwałtowne dostarczanie O2 może spowodować lizę komórek i stres mechanicznego urazu.
Ze względu na sposób napowietrzania bioreaktora dzielimy na:
-bioreaktory zaopatrzone w mieszadła magnetyczne ( typu rotacyjne bębny, wirujące filtry)
-bioreaktory do których powietrze jest wtłaczane często pod ciśnieniem, poprzez system membran umieszczonych w dolnej strefie urządzenia
-bioreaktory z równomiernym wprowadzaniem powietrza od góry
- zwykłe napowietrzanie
- dodatkowe kolumny( bąbelkowe napowietrzanie)
- poprzez system silikonowych lub polipropylenowych węży zaopatrzonych w liczne perforacje lub mokropory
Problemy związane z powiększaniem skali kultur
- przygotowanie inokultur
- metoda inkubacji, transfer do bioreaktora i odbiór namnożonego materiału
- stres mechaniczny związany z mieszaniem pożywki
- wprowadzenie światła do bioreaktora
- problem zachowania podobieństw o charakterze fizycznym i biologicznym
Embriogeneza somatyczna w bioreaktorach.
Modelowy system indukowania embriogenezy somatycznej w bioreaktorze- na przykładzie poinsecji (Gwiazda betlejemska-Euphorbia pucherina)
Etapy:
* Faza proembriogenna ( inicjacja embriogenezy)
-kultura wstępna- eksplantant (merystem wierzchołkowy) pobrany z rośliny rosnącej w szklarni umieszczony na pożywce zestalonej agarem indukującej kalusowanie. Po 2-3 tygodniach kalus przenosi się na pożywkę płynną o tym samym składzie i umieszcza się na wytrząsarce
-pasażowanie- po kolejnych 3 tyg agregaty komórek filtruje się a większe skupiska komórek osadzone na sitach przenosi ponownie na pożywkę zestaloną agarem, celem wyprodukowania tzw „ wtórnych kalusów” mających zdolność do zarodnikowania klonalnego
-pozyskiwanie inokulum wyjściowego - po 2 tyg szybko rosnącą masę poddaję się filtrowaniu na sitach i uzupełnia w 2\3 swieżą pożywką, otrzymana zawiesina stanowi suspensję wyjściową dla bioreaktora
* Kultury w bioreaktorach - pożywka płynna ( ściśle kontrolowane warunki wewnętrzne). Zarodki stopniowo osiągaja stadium globuli i dalej stadium serca. Barwa suspensji zmienia się z białawej na zielonkawo- brązową
*Konwersa embrionów w rośliny
-zarodki usuwa się z bioreaktorów, odsącza się na sita i umieszcza na szalkach Petriego na pożywce zestalonej pozbawionej auksyn- MS +0,05 mg BAP
-po 3 tyg. normalnie rozwijające się zarodki izolowane są od form dewiacyjnych i kalusujących
-prawidłowo rozwijające się zarodki ponownie się umieszcza na pożywce o tym samym składzie i po 1-2 tyg zarodki kiełkują wytwarzając długi hypokotyl charakterystyczny dla poinsecji
-po osiągnięciu 20 -25 mm eksplantaty przenosi sie do szklarni ( przeżywalność ok 90 %)
Efektywność stymulowania embriogenezy somatycznej w bioreaktorach dla poinsecji.
Wydajność- teoretycznie można otrzymać 100 tyś. zarodków z 1 litra suspensji -czas ok 3 miesiące
ztuczne nasiona:
-pozbawione otoczki zarodki somatyczne poddane procedurze wysuszenia
-otoczkowanie zarodków poddane desykacji
-uwodnienie zarodki ( merystemy wierzchołkowe) otoczone kapsułą z żelu
- uwodnione zarodki zanurzone w płynnym żelu
Otoczkowanie nasion:
-unieruchomienie fragmentu tkanki
-zminimalizowanie funkcji życiowych
-ochrona przed niekorzystnymi czynnikami środowiska
-ochrona przed utlenieniem i desykacja (odwodnienie)
-ochrona przed uszkodzeniem mechanicznym podczas siewu i transportu
-wprowadzenie regulatorów, mikroflory, pestycydów
- możliwość wprowadzenia do otoczek hydrofilnych dodatkowych otoczek hydrofobowych
Etapy wytwarzania sztucznych nasion:
-roślina macierzysta
-eksplantat
-indukcja i proliferacja kalusa embriogennego
-namnożenie komórek w zawiesinie embriogennej.
-synchronizacja stadiów embiogenezy i hartowanie zarodków.
-filtrowanie
-suszenie
-otoczkowanie
-wysiew nasion in-vivo lub in-vitro
Rodzaje hydrożeli:
-otoczki polisocharydowe-najważniejsze ze wszystkich
-organiczne żele (poliakryloamidowe)
-żele białkowe (żelatyna, polimer glutaraldehydowy lub formaldehydowy)
Pochodzenie chemiczne wiązań żelifikujących !!!!!
-żele powstają poprzez krzyżowe wiązanie jonowe odpowiednio naładowanych polimerów np. Alginian, chitozan, karaginian
-żele powstałe zimnej lub gorącej polimeryzacji (agar, agaroza, karaginian).
-żele powstałe drogą chemicznej reakcji (poliakrylamian, formaldehyd).
Otoczki agarowe
Agar- polisacharyd ekstrahowany z różnych gatunków czerwonych wodorostów
Procedura pozyskiwania:
- 2-4% agar rozpuszcza się w soli fiajologicznej w temp. 100C, a następnie schładza do 50C
- dodaje się materiał roślinny (zarodki lub merystemy) zawieszone w soli fizjologicznej
- po zestaleniu tnie się żel lub otacza fazą hydrofobową np. olejem
- można ciepły agar wraz z komórkami wkraplać do oleju silikonowego lub sojowego, umieścić na mieszadle magnetycznym i po stężeniu oddziela się kuleczki (zawierające materiał roślinny) droga wirowania
Otoczki agarozowe
Agaroza- naturalny czynnik żelifikujący otrzymany z agaru pozbawionego grup estrowo-siarczanowych
Procedura pozyskiwania:
-agaroza 2-4% w temp. 35*C dobrze się rozpuszcza a jednocześnie żelifikuje
-przygotowany już roztwór wraz z komórkami dodajemy wkraplając do oleju roślinnego umieszczonego na mieszadle, całość oziębiamy i wirujemy
Otoczki alginianowe
* Alginiany otrzymywane są z olbrzymich brązowych alg morskich Macrocystis i Laminaria drogą ekstrachowania zasadą sodową. Otrzymywany kwas alginianowy składa się z jednostki M ( kwas manuroniowy ) oraz jednostki G ( kwas gulurioniowy )
* Kiedy jony Na+ zastąpimy jonami dwuwartościowymi np. Ca2+ ,Ba2+ , Si2+, Zn2+ lub Al3+ tworzy się sieć polimerowa pomiędzy jonami. Powstają wiązania krzyżowe pomiędzy grupami karboksylowymi, a molekułami polisacharodowymi. Proces jest termo niezależny i bardzo dobrze w strukturę żelu dopasowuje się wapń.
Procedura pozyskania
-suspensje komórek miesza się w temp. pokojowej ze sterylnym roztworem
alginianu sodu 2-3%
-następnie mieszaninę tę wkrapla się do roztworu chlorku wapnia (50-300 mM CaCl2)
-perełki o określonej średnicy (0,5-5 mm) utwardzają się przez kilkanaście minut do kilku godzin
- powleka się je dodatkową warstwą hydrofobową
- na etapie kiełkowania zarodków, otoczki rozpuszcza się w EDTA lub buforze cytrynianowym ( fosforanowym )
Kiełkowanie i konwersja
Kiełkowanie- zdolność do formowania korzonka zarodkowego
Konwersja- równoczesny rozwój korzonka zarodkowego i merystemu pędu, z wytworzeniem rośliny o fenotypie właściwym dla danego gatunku
Otoczki karaginianowe
Otrzymywane z komórek czerwonych wodorostów typu Chondrus, Euchemia, Gigartina...
Procedura pozyskiwania
- 2-5% roztwór karaginianu ogrzewa się do temp. 45°C, a po schłodzeniu miesza się w/w roztwór z suspensją komórek
- następnie wkrapla się zawiesinę w karaginianie komórki do roztworu KCl (kąpiel utwardzająca)
perełki (2-4 mm) otrzymuje się w KCl przez 1-5 godz.
- najczęściej stosowane
Inne
-celuloza i jej pochodne
-chitozan
-żelifikujące gumy
-pektyny
-podwójne otoczkowanie np. alginiany/ pektyniany , karaginian/ chitozan lub -algininian/ chitozan
-najnowsze otoczki hydrofobowe
-Tulanox, Elwox
-Bio- kapsuły! (osłonki zaindukowane wokół zarodka somatycznego imitujące okrywę nasienną z kutikulą
Efektywność maszyny do otoczkowania
-500000 sztucznych nasion o średnicy 80 ul dziennie
maszyna otoczkuje zarodki somatyczne: pomidorów, bawełny, petunii, ogórka, sałaty, papryki, tytoniu, melona, zbóż.
-Stopień konwersji 8-90% i zależy od gatunku rośliny i warunków kiełkowania. W warunkach polowych dla sztucznych nasion M. media (lucerna) A. gravedens (seler) czy D. carota (marchew) wynosi 50-80%
Embriogeneza somatyczna, sztuczna nasion dla drzew i krzewów
Formy drzewiaste
Forma dojrzała --x→ forma juwenilna(młodociana)
Zdrewniała → zielna
rejuwenalizacja
→
”odmłodzenie”
stymulacja wigoru
Uratowano wiele roślin reliktowych, np. tysiącletnie cyprysy
Rodzaje nasion:
-Ortodoks- genotypy, które można poddawać wysuszeniu
-Rekakacitrant ?- genotypy bardzo wrażliwe na wysuszenia (nie tolerują)
Etapy wytwarzania sztucznych nasion
-Uzyskanie i namnażanie materiału wyjściowego
-Dojrzewanie i hartowanie (przygotowanie materiału do suszenia i otoczkowania) GA3 , ABA zapewniają prawidłowy rozwój zarodka, odporność na dehydratację oraz zapobiegają przedwczesnemu kiełkowaniu. hartowanie polega na osuszeniu i lekkim schłodzeniu
-Odwodnienie- eksykator lub glikol polietylenowy
-Otoczkowanie- otoczka pełni rolę „sztucznego bielma„ a dodatkowo osłonka hydrofobowa „okrywę nasienna”
-Wysiew- w zależności od typu sztucznych nasion, przenosi się je do warunków in vitro w celu dalszego przechowywania lub wysiewu do gruntu in vivo
Problemy technologii sztucznych nasion
-indukcja zarodków somatycznych (dodatek różnych substancji m. in. Aminokwasów)
-faza dojrzewania zarodków i konwersji → podstawa ABA
-problem O2
-wysychanie otoczek
-stopniowe uwodnienie nasion!
-koszty produkcji
próby tworzenia Bio- kapsuł
Ze względu na fazę wdrożeniową na dzień dzisiejszy namnaża się przez sztuczne nasiona: hybrydy ryżu, geranium, europejskie odm. ogórka , gerberę, kawę, lucerne.
Potencjalne korzyści
-szybkie namnażanie pożądanej linii
-gwarancja genetycznej jednorodności roślin
-bezpośrednie transplantowanie tkanki do gleby
-dostarczanie i namnażanie zmiennych (niestałych) genotypów, takich jak rośliny transgeniczne o wysokiej niestabilności genetycznej
-dostarczenie sterylnych linii
-redukcja kosztów związanych z wegetatywnym namnażaniem linii elitarnych
-możliwość masowej produkcji tkanki embriogennej z komórek poddanych inżynierii genetycznej
Banki genów
Przechowywanie materiału roślinnego
Krótkoterminowe przechowywanie materiału roślinnego w stosunkowo niskiej temp. Ok. 4°C, przy niskim natężeniu światła i na ubogich pożywkach.
Długoterminowo-
- w temp. 70°C (zamrażanie przemian metabolicznych, chociaż istnieje niebezpieczeństwo powolnego utleniania tłuszczów oraz wzrost ilości mikrokryształów lodu w komórkach
- w temp. -196°C (temp. Ciekłego azotu) komórki przez wiele lat nie tracą żywotności
Przechowywanie komórek in vitro w bankach genów (zamrażanie)
Proces wieloetapowy, który obejmuje etapy:
1.wzrost wstępny
kultury prowadzi się w pożywkach o obniżonym potencjale chemiczny, wody (sacharoza, mannitol, glukoza) oraz przy niskiej zawartości azotu (komórki są małe i słabo zwakuolizowane)
2.krioprotekcja (krioprezerwacja)
przed zamrożeniem usuwa się nadmiar wody z komórek i przestrzeni międzykomórkowych. Uzyskuje się ten efekt nasączając tkanki roztworem gliceryny, sacharozy, dwufenylosulfanianem DMSO, aminokwasem proliną lub glikolem plietylenowym. Możliwe jest łączenie kriopretaktantów w formie 2 lub 3 składników.
3.zamrażanie
a) zamrażanie metodą konwencjonalną
-zamrażanie wstępne (0-40°C) optymalne tempo schładzania 0,5-2 C/min. (zależy od stopnia odwodnienia struktury i krystalizacji, wody w krioprotektancie)
-zamrażanie trwałe w cikłym azocie
b) metoda odwodnienia
-struktury roślinneulegają odwodnieniu (dehydratacji) w temp. pokojowej
-zamrażanie w ciekłym azocie
c) metoda witryfikacji
-umieszczenie tkanki w silnie stężonym roztworze krioprotektantów (odciąganie wody do przestrzeni międzykomórkowych i do roztworu)
-zamrażanie w ciekłym azocie
4.przechowywanie właściwe (-196°C)
5.odmrażanie
6.przywrócenie właściwego tempa wzrostu komórek
Krioprezerwacja zapewnia zachowanie stabilności genetycznej materiału na bardzo długi okres czasu stad z powodzeniem stosowana jest do przechowywania tkanek roślinnych, sztucznych nasion.
Schemat zamrażania komórek w ciekłym azocie
Komórki roślinne
↓
Pożywka adaptacyjna
↓
Mieszanina kriochronna
↓
Zamrażanie
Wieloetapowe Jednoetapowe
Przechowywanie
↓
Rozmrażanie
Przeżywalność zakonserwowanego materiału zależy od:
-tolerancji na dehydratację i działanie skoncentrowanych roztworów odwadniających
-odporność na zamrażanie protoplastu (cecha uwarunkowana genetycznie)
-stopnia uwodnienia i wielkości zamrożonej struktury
Banki genów
Holandia, Francja, Anglia, Belgia
Polska- Leśny Bank Genów w Kostrzycy od 1995 r.
Ex- situ (poza naturalnym środowiskiem) →banki genów
In- situ (poza naturalnym ekosystemem)
In vitro (w szkle)
Zachowanie zasobów genowych in vitro
-techniki kultur in vitro umożliwiają mikrorozmnażanie i średnio- lub długoterminowe przechowywanie materiału roślinnego w bankach genów roślinnych
-izolowanie komórki, tkanki zmodyfikowane genetycznie, haploidy, rośliny użytkowe, rzadkie lub ginące gatunki, kolekcje ogrodów botanicznych lub arboretów, roślin transgenicznych przechowywane są w:
*warunkach powolnego wzrostu
*warunkach kriogenicznych
*w postaci sztucznych nasion
prof. Broda
Biotechnologia
-tworzenie określonych produktów przez wykorzystanie procesów biologicznych
Hodowla roślin Biotechnologia
współczesna w hodowli roślin
Biotechnologia - techniki kultur in vitro
klasyczna - genetyka molekularna,
(hodowla roślin istnieje już od tysięcy lat) inżynieria genetyczna
Hodowla roślin. W cyklu hodowlanym wprowadza się nowe oraz doskonali już istniejące cechy użytkowe tworząc odmiany w gatunkach roślin uprawnych.
Rośliny nabierają nowych właściwości przez trwałą zmianę składu genetycznego.
Genetyka- nauka o dziedziczności i zmienności organizmów żywych
Badanie fenotypu → genomu (genotypu) (genetyka molekularna, inżyniria genetyczna)
Genomika- nauka o molekularnych badaniach genetycznych
Badanie genomu (zbiór informacji genetycznej) → fenotypu
Rośliny transgeneniczne- rzepak, kukurydza, soja, bawełna
Naukowe podstawy hodowli roślin
1800 r. - prace T. A. Knighta, krzyżowanie roslin groch I pszenicy
1840 r. - Louis de Vilma wprowadza nową metodę selekcji indywidualnej, stosowaną do dnia dzisiejszego
1866 r. - Grzegorz Mendel badania nad dziedziczeniem cech grochu, praca pt. „Versuche uber Pflanzen- hybriden”
Prawa Mendla- ponowne ich odkrycie w 1900- Tschemark, de vries, Correns
1900 r. - De Vries- mutacje
USA- kolekcjonowanie genotypów roślin uprawnych
1910 r. - pierwsze prace nad heterozją kukurydzy
- prawo Hardy-ego- Weineberga
prawo czystości Johanensena
1920 r. - Muller i Stader- indukcja mutacji promieniami X
- chromosomowa teoria dziedziczenia Morgana
- zmiana ploidalności za pomocą kolchicyny
1950 r. - wykorzystanie zjawiska heterozji i powszechna uprawa
1960 r. - odkrycie mechanizmu regulacji działania genów ( Jackob i Monod)
kultury in vitro
kultury protoplastów
uwodnienie totipotencji pojedynczej komórki roślinnej
wyhodowanie półkarłowych pszenic
1970 r. - kultury pylników- uzyskanie haploidów
embriogeneza somatyczna z protoplastów
pierwsze doświadczenie z selekcjonowaniem DNA
1980 r. - zastosowanie metod biotechnologii
udowodnienie, że przeniesione pozageneratywnie geny u roślin ulegają dziedziczeniu zgodnie z prawami Mendla
1990 r. - transforowanie roślin
Kultury in vitro
To hodowla komórek i tkanek roślinnych na sztucznych pżywkach w warunkach sterylnych.
Regeneracja roślin na drodze organogenezy lub embriogenezy somatycznej
1.Mikrowstrzeliwanie- rozmnażanie klonalne
2.kultury zarodków
3.kultury roślin haploidalnych
Haploid- roślina zawierająca w swoich komórkach somatycznych gametyczną liczbe chromosomów
Sposoby uzyskiwania roślin haploidalnych
-eliminacja chromosomów w zarodkach powstających w wyniku krzyżowań między gatunkami i między rodzajami
-androgeneza - sporoficzny rozwój gametofitu męskiego
*kultury pylnikowe
*kultury izolowanch mikrospor
-gynogeneza- sporoficzny rozwój z haploidalnych komórek woreczka zalążkowego
*kultury niezapłodnionych zalążkó i zalążni
*kultury zapłodnionych zalążków i zalążni
Uzyskiwanie zmienności genetycznej
Mutacje Rekombinacje i segregacje
-kultury merystemowe
- transformowanie obcego DNA
-kultury kalusa
-mieszańce płciowe
-kultury protoplastów
-mieszańce somatyczne
- haploidy
(-) androgeneza
(-) gynogeneza
Utrzymanie zmienności gamet i rozmnażania roślin
-Kultura merystemów i pąków przybyszowych
-Kultury kalusowe
Kultury komórki
-Kultury protoplastów
Zalety wynikające ze stosowania technik kultur in vitro w pracach genetyczno- hodowlanych
-Dysponowanie ogromnymi liczebnościami genotypów na bardzo małych powierzchniach
-Uzyskanie efektów selekcji w krótkim czasie
-Możliwości bardzo precyzyjnej kontroli czynników dotyczących działania mutagetagenami, warunków selekcji i wzrostu
Diagnostyka molekularna
Porównanie markerów molekularnych z markerami morfologicznymi
- przy pomocy markerów molekularnych, genotypy roślin mogą być określane w całym okresie wzrostu i rozwoju rośliny, na poziomie tkankowym i komórkowym w przypadku markerów morfologicznych, genotypy określane są tylko na poziomie całych roślin i często dopiero w stanie dojrzałej rośliny.
- w wielu gatunkach roślin występuje naturalna zmienność alleli w większości loci markerów molekularnych. A zatem w badaniach genetycznych można wykorzystać naturalną zmienność w istniejących populacjach bez konieczności zmienności wymaganej często dla loci morfologicznych
- zmienność izoenzymów i markerów DNA wykazuje zwykle neutralność fenotypową podczas gdy markery morfologiczne powodują zmienność fenotypowa często niepożądana w populacjach hodowlanych
- allele niektórych typów loci molekularnych (np. izoenzymy, RLFP) wykazują kodominujący charakter dziedziczenia. Dominujący charakter dziedziczenia cech morfologicznych uniemożliwia rozróżnienie wszystkich genotypów
- niepożądane działania epistatyczne występujące często pomiędzy loci kodującymi morfologiczne cechy mogą limitować liczbę segregującuch markerów możliwych do obserwacji w jednej segregującej populacji. Większość markerów molekularnyc pozbawiona jest tego typu oddziaływań tak więc liczba loci, jaką można obserwować w jednej populacji jest teoretycznie ograniczona.
Diagnostyka oparta o markery (znaczniki, własności)
-Diagnostyka oparta o markery morfologiczne (monogeniczne dziedziczenie)
-Diagnostyka molekularna oparta o markery genetyczne
Wynik diagnostyczny powstaje na podstawie
-Oceny polimorfizmu fragmentów restrykcyjnych (RFLP)
-Określenie długości badanego fragmentu DNA
-Wykrycie delecji, insercji, mutacji punktowych
-Określenie sekwencji badanego fragmentu DNA
Diagnostyka oparta na amplifikacji DNA
Łańcuchowe reakcje polimerazy PCR
Stadia reakcji:
1.denaturacja DNA, w temp. od 95°C w wyniku której powstają jednoniciowe cząsteczki DNA
2.przyłączanie starterów do jednoniciowej cząsteczki DNA w miejscach komplementarnych do homologii starterów ich długości itp.
3.synteza nowych nici DNA w temp. od 72°C
Rodzaje markerów molekularnych
-izoenzymy (polimorfizm białek, kodominowanie)
markery DNA (polimorfizm DNA) RFLP,MAAP, AFLP, STMS, SCAR (STS)
- RFLP badanie polimorfizmu
Diagnostyka oparta na hybrydyzacji z sondami molekularnymi
-hybrydyzacja punktowa DNA lub RNA, unieruchomienie w temp. 80°C lub promieniowanie UV, inkubacja z sondami
-metoda Sontherna hybrydyzacja DNA-DNA
-metoda Northen hybrydyzacja RNA-DNA
-hybrydyzacja in situ.
PTL- loci cech ilościowych
Inżynieria genetyczna
Genetyka molekularna i technika rekombinacji DNA przyczyniły się do opracowania metod pozwalających na uzyskanie nowej zmienności droga transformacji
Transformacja genetyczna - jest to proces przenoszenia obcych fragmentów DNA (genów) do genomu biorcy i stabilna ich integracje w tym genomie (przenoszenie genów bez względu na ich oddalenie fitogenetyczne)
Etapy uzyskiwania roślin transgenicznych
1.wyizolowanie i sklonowanie genu przeznaczonego do transformacji
2.opracowanie metody wprowadzenia genu do komórek roślinnych
3.ustalenie metodyki regeneracji transformowanych komórek kompletnie wykształcone rośliny
4.określenie sposobu sprawdzenia integracji i ekspresji wprowadzonego genu
5.zbadanie stabilności transformowanego genu w następnych pokoleniach roślin i określenie sposobu dziedziczenia nabytej cechy
Konstrukt stosowany w transformacji składa się z :
-gen strukturalny (cecha)
-gen markerowy ( selekcyjny) np. aro A, odporność na glyfosad lub npt H, odporność na neomycyne i kanamycyne oraz reporterowy (wizualizujący) np. GUS, β glukuronidaza ,
-promotor i terminator, sekwencje regulacyjne ( promotor poprzedzający gen strukturalny jest odpowiedzialny za inicjację transkrypcji, a terminator za jej ukończenie)
Metody transformacji:
-wektorowe , bakterie z rodzaju Rhizobium- Agrobaterium fumefaciens plazmid Ti oraz Agrobacterium rhizogenes , plazmid Ri
System Agrobacterium wykorzystuje się do roślin 2-liściennych
bezwektorowe , makroiniekcja, mikroiniekcja, elektroporacja, mikrowstrzeliwanie- wykorzystuje się do wprowadzenia konstruktów DNA u roślin 1-liściennych
wektor binarny- układ 2 plazmidów
wektor monarny - 1 plazmid
Skuteczna transformacja nie oznacza stabilnej ekspresji
-problemem technologii roślin transgenicznych jest niestabilność ekspresji wprowadzonych genów
-wprowadzone geny: nie ulęgają ekspresji, bardzo słaba ekspresja zanika w kolejnych pokoleniach
Dlaczego tak się dzieje???
„wyciszenie genów”- poznano powierzchownie
-przypadkowe miejsce integracji obcych genów w transkrypcyjnie nieaktywne obszary genomu wyklucza z reguły możliwość transkrypcji (rejony chromosomów zwane heterochromatyną)
-modyfikacja obcego DNA przez metylacje, której ulega cytozyna, prowadzi to do zablokowania trankrypcji
-trandezaktywacja ( kosupresja) polega na wyciszaniu transkrypcji genu homologicznego za pomoca transformacji
Gen męskiej sterylności- PGS
Geny rybonukleaz
RN-aza T1 (z Aspergillus oryzae)
BARNAZA ( z Bacillus amyliquefaciens)
PROMOTOR TA- 29 gen rozkładający komórki tapetum
-gen odpornosci na herbicydy
Bosta - gen Bor acetylotransferazy (ze Steptomyces hygroscopicus)
RESTORERY- transformanty z inhibitorem Barnazy - Bostor
Wykorzystanie roślin transgenicznych w hodowli
Metody transformowania roślin umożliwiają na drodze pozageneratywnej wprowadzenie następujących cech :
1.odporność na szkodniki i choroby wirusowe, bakteryjne i grzybowe
2.odporność na herbicydy
3.modyfikacje cech użytkowych roślin
-ingerencja w metabolizm związany z dojrzewaniem
-modyfikowanie spektrum barw kwiatów
-zmiany w metabolizmie węglowodanów i tłuszczów
-rośliny transgeniczne jako bioreaktory do syntezy białek: alfa- amylazy, beta- glukozydazy, peroksydaza ligniny - białka przemysłowe oraz źródło przeciwciał i szczepionek
-rośliny transgeniczne mogą służyć do biodegradacji plastiku
Obecnie wprowadzane są geny warunkujące cechy jakościowe o prostym, jedno- lub kilkugenowym sposobie dziedziczenia .
Biotechno konstruowanie nowych szczepów drobnoustrojów i linii komórkowych organizmów wyższych o niespotykanych dotąd walorach technologicznych. Biotechnologia znana dziś ze względu na osiągnięcia biologii molekularnej oraz inżynierii genetycznej towarzyszyła człowiekowi od zarania dziejów( procesy mikrobiologicznej fermentacji) Biotransfor- proces w wyniku którego dochodzi do modyfikacji grup funkcyjnych związków organicznych przez żywe komórki lub izolowanie z nich enzymy. Organizmy transgeniczne -poddane transformacji tzn. posiadające zmodyfikowany genom. Powstały z takiej komórki, która włączyła do swego genomu fragment DNA skonstruowany za pomocą inżynierii genetycznej. Fragment ten może zawierać dowolna informację i może zostać włączony w prawie każdym miejscu genomu. Zastosow biotech Produkcja żywności: - tradycyjne procesy fermentacyjne( produkcja pieczywa, produktów mlecznych), - nowe technologie mikrobiologii( witaminy, aminokwasy), - zastosowanie enzymów do wyrobów mleczarskich( kefiry, jogurty), - utrwalenie żywności( antyutleniacze)Rolnictwo: - produkcja pasz( preparaty białkowe, witaminowe, kiszonki roślinne),- kultury komórkowe i tkankowe in vitro, - ochrona roślin( bioinsektycydy, antybiotyki), - lecznictwo zwierząt( szczepionki)Ochrona środow: - oczyszczanie ścieków, filtry biologiczne, czynne osady Co to biotransformacje roślin ?Reakcje biotransformacji w różnych kulturach zawiesinowych. Zastosowanie: - do produkcji metabolitów wtórnych, - do biotransformacji egzogennych prekursorów w bardzo wartościowe, bądź pożądane produkty. Typy reakcji biotransform - utlenianie, redukcja, - hydroliza, - rozszczepienie wiązania C-C, - kondensacja, - izomeryzacja Substraty: naturalne prekursory, - związki syntetyczne( ksenobiotyki), zw obce roślinie Materiał stosowany: - izolowane enzymy, - zawiesiny komórkowe, agregaty komórek, - immobilizowane( unieruchamiane) enzymy i komórki Lokalizacja procesu biotransf: - wytrząsanie kolby, - bioreaktory Daneilościowe: - na swiecie jest ok. 137 gat roślin leczniczych i aromatycznych wykorzystywanych do produkcji matabolitów wtórnych lub do biotransformacji prekursorów, - w Polsce tylko ok. 40 gat roślin ( zostało przebadanych) Korzyści biotransf: - wysoka wydajność( często bliska 100%), - duża czystość produktu reakcji, - wysoka specyficzność reakcji, - możliwość zajścia reakcji w miejscach mało reaktywnych, - otrzymanie dużej ilości produktów występujących w małych ilościach w roślinie, - otrzymanie produktów o zwiększonej aktywności fermakologicznej lub zmniejszonej toksyczności Biotransf z użyciem kultur zawiesinowych - jest to najprostszy model doświadczalny, nie ma dodatkowego etapu wiązania komórek z nośnikiem, komórki nie ulegają zmianom fizjologicznymCzynniki regulujące reakcje biotransf: - rodzaj kultury( zawiesina, kultury organów np. korzeni), - stadium rozwojowe kultury i jej warunki, a zwłaszcza nadtlenianie, skład pożywki i jej pH, - struktura chemiczna substratu, jego stężenie, właściwości Leki roślinne Opium. Kokaina z liści kokainowego krzewu zwanego krasnodrzewem, liscie zawieraja 14 innych skł, wszystkie służą do produkcji leków znieczulających i innych syntetyków, liście kokainowe słyną jako środek stymulujący do nadludzkiej pracy dla andyjskich robotników i tragarzy, żuty z dodatkiem limy lub popiołu roślinnego powoduje uwalnianie się aktywnych substancji stymulujących układ nerwowy i prace mięśni, nie powoduje u Indian żujących liście uzależnienia jak w postaci czystej. Marichuana, Chinina Aspiryna Disgenina Kastanospermina - izolowana z Castanospermum australe, hamuje proces glikozylacji białek, płaszcza wirusów, w tym HIV Disgenina - steroid otrzymywany z Discoreadaltoidea, używany do produkcji leków , które konfigurują na liście najlepiej sprzedających się. Winblastyna i winkrystyna- używane w terapii nowotworowej.- kuracja winblastyną daje trwałe wyleczenia u ponad 80 % chorych na ziarnice złośliwą. - winkrystyna daje ustanie objawów u 90 % dzieci cierpiących na ostre białaczki limfatyczne.Rośliny zmodyfikowane genetycznie Transgen- właściwy gen, przeniesiony do transformowanej rośliny. Nie ma on w genomie rośliny swojego odpowiednika w postaci allelu, stąd roślina transgeniczna jest heterozygotą. Linia transgeniczna- samozapylone rośliny transgeniczne o nowym fenotypie dają potomstwo rozszczepiające się lub jednolite. Te ostatnie pochodzą z homozygoty i dają ustaloną linie transgeniczną. Zmienność samaklonalna- rośliny powstałe z transgenicznej komórki i mogą wykazywać różne zmienione właściwości, co nazywamy zmiennością samoklonalną- dziedziczoną trwale w kolejnych pokoleniach. Metody wprowadzania obcych genów: transformacja za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, A. rhizogenes (metoda wektorowa). Przydatna dla roślin 1-liściennych. -transformacja bezpośrednia (metoda bezwektorowa)- mikrowstrzeliwanie. Przydatna dla roślin 1- i 2-liściennych. *metoda pośrednia- stosuje się komórki bakterii - E. coli i A. tumefaciens jako biologiczne „pociski” do transformacji. Przydatna dla roślin 1- i 2-liściennych *bezpośrednie transformowanie protoplastów za pomocą elektroporcji lub glikolu polietylenowego- PEG Etapy transforma wektorowej: -kokultywacja- umieszczenie eksplantatów (fragmentów liści, korzeni, liści) w roztworze bakterii, - odpłukanie bakterii, - umieszczenie eksplantatów w pożywce z antybiotykiem w celu zabicia bakterii, - umieszczenie dalsze materiału roślinnego na pożywce - regeneracyjnej z odpowiednim czynnikiem selekcyjnym: antybiotykiem lub herbicydem, - regeneracja roślin jest możliwa najczęściej z pojedynczych transformowanych komórek we wczesnym etapie regeneracji. Przeprowadza się testy na aktywność genów reporterowych wprowadzonych dodatkowo do plazmodiów. Geny te są odpowiedzialne za kodowanie produktów które łatwo wykrywa się testami enzymatycznymi, histochemicznymi lub fluorymetrycznymi. Mikrowstrzeliwanie:( zasady metody) - metoda transformacji polegająca na wprowadzeniu z bardzo dużą prędkością rzędu kilkuset metrów/sekundę do komórek metali pokrytych DNA. Prędkość tę uzyskuje się w specjalnie skonstruowanych akceleratorach, czynnikiem przyśpieszającym ruch cząsteczek metala jest proch strzelniczy lub obecnie hel. Przydatność metody: rośliny 1-liścienne, nagonasienne, 2-liścienne trudne dotąd do stransformowania np. soja, fasola Obieg transf:- niedojrzałe zarodki, - kalus enbriogeniczny z zarodków, - niedojrzałe kwiatostany, - zawiesina komórek Wady metody: - niska wydajność transf ( mechaniczne uszkodzenia komórek, szok akustyczny), - odrywanie się metalu od DNA, - wprowadzenie do genomu roślinnego zbyt dużo kopii genów jednocześnie funkcjonowanie bioreakt? Zasada działania bioreakt - zagwarantowanie optimum warunków wzrostu i rozwoju komórką somatycznym w kierunku zainicjowania embriogenezy somatycznej poprzez regulację i kontrolę wewnętrzną czynników fizyko - chemicznych. Komputerowej kontroli podlegają następujące parametry: - dozowanie świeżej pożywki, - kontrola ilości namnażanych komórek, - temp( z dokładnością do 0,1◦), - szybkość rotacji pożywki( przemieszczania się suspensji w bioreaktorze) zwykle 50 rpm, poniżej komórki sedymentuja i zamierają, pH sygnału aktywowania pompy perystaltyczne wtłaczające sterylny roztwór kwasu lub zasady, - poziom tlenu regulowany droga dodatkowego dotlenienia lub zmiany szybkości rotacji pożywki (poziom tlenu mierzy elektroda tlenowa), -potencjał redox, - stężenie CO2 Podział bioreak ze wzgl na system napowietrzania pożywki: - bior zaopatrzone w mieszadła magnetyczne typu rotacyjne bębny, wirujące filtry, - bior w których powietrze jest wtłaczane często pod ciśnieniem poprzez system membran umieszczonych w dolnej strefie urzadzienia, - zwykłe napowietrzanie, - dodatkowe kolumny( bąbelkowe napowietrzanie), - poprzez systemy sylikonowych lub polipropylenowych węży zaopatrzonych w liczne perforacje i mikropory, - bior z równomiernym rozprowadzeniem powietrza z góry bez mieszania pożywki, - podświetlane przewody rozprowadzające tlen Rozmnaż wegetatywne in vitro( klonalne, mikrorozmnażanie, masowe) 1. Powstanie zarodków somatycznych kulturach tkanek i organów 2. Różnicowanie pąków przybyszowych w kulturach kalusa 3. Różnicow pąków przybysz. bez pośrednictwa tkanki kalusowej 4. Rozwój pąków bocznych w kulturze merystemów wierzchołkowych 5.Rozwój pąków bocznych w kulturze fragmentów pędów i innych organów 6. Kultury primordiów pędowych Rozmna wege in vitro realizow przez: 1. Organy przysposobione do rozmnażania wegetatywnego (skrócone pędy)-bulwy, cebule, kłącza 2.Sadzonki-odciete części rośliny 3.Odkłady 4. Transplantacje: - szczepienie, - podkładki, - okulizacja Dezynfekcja i traktowanie wstępne: 1.przemycie eksplantantu woda bieżącą przez1-2 godz. często z dodatkiem detergentów 2.sterylizacja powierzchniowa 70%-etanol-30 sek. ; 80%-etanol-5 min.(pąki drzew) 3.dezynfekcja właściwa: podchloryn wapnia lub sodu 2-10%- 5-20 min. -HgCl2 0,2- 1,0% 3-10 min.- chloroamina 0,2- 1,0% 5-10 min. 4. przemywanie 3-6- krotne sterylną wodą Pożywka (Murashige i Skooga) 1.nieroganiczne sole (mikro i makroskl.) 2. witaminy 3.organiczny N 4. regulatory wzrostu 5.żródło energii i węgla + wyciąg: z mleczka kokosowego, kukurydzianego, wyciąg z drożdży, bielma itd. Warunki zewn: -światło -temp.ok.25"C -źródło węgla (sacharoza) -witaminy - wielkość eksplantatu AUKSYNY:- stymulują podziały kom.w tworzeniu się tkanki kalusowej -wpływają na organogenezę kalusa -stymulują powstawanie tkanki embriogennej →zarodki somatyczne -indukują merystemy korzeni przybyszowych na pędach- stymulują syntezę etylenu (efekt niepożądany) i starzenie się kultur CYTOKININY: -pobudzają podziały kom. brak cytokinin zwiększa poliploidalność jąder -wpływają na różnicowanie się ksylemu i lignifikację komórek -stymulują wyrastanie pędów bocznych -hamują indukcję, wzrost i rozwój korzeni -redukują długość pędów -opóźniają starzenie -likwidują zjawisko dominacji wierzchołkowej - "odmładzają" i zwiększają wigor eksplantantów- rejuwenalizacja drzew i krzewów, ukorzenianie pędów -niskie dawki cytokininy +auksyna stymulują rozwój tkanki embriogennej→ zarodki somatyczne GIBERELINA: (GA 3) -pobudza wydłużanie międzywęźli pędów -przyspiesza wzrost merystemów -stymuluje proliferację pędów bocznych -hamuje ukorzenianie pędów -hamuje indukcję embriogenezy somatycznej -stymuluje kiełkowanie dojrzałych zarodków ABA: (kwas abscysynowy) -inhibitor wzrostu -stymuluje tworzenie kalusa -współdziała z cytokininą i auksyną w dojrzewaniu zarodków somatycznych-inicjuje embriogenezę - pozytywnie wpływa na dojrzewanie i kiełkowanie sztucznych nasion -inicjuje rozwój minibulw -zwiększa żywotność protoplastów i ich dzielenie się ETYLEN: -hamuje podziały kom. i morfogenezę -wprowadza komórki w stan spoczynku -hamuje embriogenezę somatyczną -wywołuje objawy starzenia się eksplantantów (żółknięcie i opadanie liści), epinastię i deformację organów -wpływa na zanik wigoru-stymuluje ukorzenianie sadzonek Zdolności regeneracyjne roślin: RESTYTUCJA - uzyskanie rośliny z np. .liścia innej rośliny, powstała z różnych organów rośliny matecznej TOTIPOTENCJA - powstanie rośliny z 1 komórki PRZEBIEG MIKROROZMNAŻ: I FAZA: 1.wybór rośliny matecznej, pobranie organu, dobór pożywki 2.stabilizacja kultury- uzyskanie zdolnego do regeneracji eksplantantu (pierwsze przyrosty tkanki kalusowej, rozwój pąków, pędów) II FAZA: szereg pasaży tkanki kalusowej, paków przybyszowych, zarodków, wierzchołków, pędów - na świeża pożywkę III FAZA: -ukorzenienie eksplantatów -przygotowanie do wysadzenia w pobliżu lub do gruntu -przywrócenie autotroficzności -aklimatyzacja. Z chwila wysadzenia do gruntu proces mikrorozmnażania jest zakończony Zdolności morfogenetyczne kom roslinnych: - kom. roślinne są totipotentne czyli maja zdolność do dzielenia się oraz odtwarzania poszczególnych organów i całego organizmu z pojedynczej kom. rośl. Ujawnienie pełnej totipotencji może nastąpić drogą organogenezy bezpośredniej i pośredniej *ORG.BEZPOŚREDNIA -pierwotny eksplantat -(roślina) organ - pierwotny eksplantat- zarodek somatyczny-organ (roślina) *ORG.POŚREDNIA - pierw ekspl.- kalus (zarodek, zawiązki korzenia, pędu)- organ (roślina)
Najbardziej przydatne do rozwoju w kulturze in-vitro są eksplantaty zawierające kom merystemów wierzchołkowych, bocznych i interkalarnych, potem w kolejności kom.kambialne, floem, okolnica i promienie rdzeniowe. U nasiennych regeneracja następuje łatwiej u dwuliściennych niż jednoliść. a najtrudniej u nagonasiennych. U każdego gatunku można wybrać fragment rośliny dający dobre efekty. Jeśli zregenerowany organ powstał z grupy kom. niejednorodnych genetycznie to otrzymamy chimerę. Bodźcem wyzwalającym odróżnianie w kulturach in vitro jest odizolowanie kom. i tkanek od rośliny matecznej oraz wpływ regulatorów wzrostu zastosowanych w pożywce. KULTURA KALUSA Zastosowanie *-materiał wyjściowy do otrzymywania zawiesin komórkowych i protoplastów *szeroko wykorzystany do mikrorozmnażania i transformacji *do pozyskiwania na skale masową zarodków somatycznych *do biotransformacji i pozyskiwania metabolitów wtórnych *do badań podstawowych nad morfologią i strukturą komórki Geneza: *w tworzeniu kalusa mogą brać udział wszystkie tkanki eksplantatu *mogą tez brać udział tylko nieliczne tkanki np. kom. miękiszowe rdzenia łodygi lub kambium wiązkowe BUDOWA TKANKI KALUSOWEJ *początkowo są to niezróżnicowane kom. parenchymatyczne o różnym kształcie i wielkości *po pewnym czasie trwania kultury kalus wykazuje heterogeniczność i obok kom. parenchymatycznych powstają nieregularne formacje tk. przewodzących, centra merystematyczne *kalus może mieć strukturę luźna i łatwo się rozpadać lub bardzo zwartą *barwa może być zróżnicowana od białej, żółtej, pomara. przez różne odcienie zieleni *analizy cytologiczne kalusa wykazują na wielką różnorodność genetyczną kom.-od diploidalności do poliploidalności KULTURA PĄKÓW PRZYBYSZOWYCH: *w różnych częściach roślin z mniej lub bardziej dojrzałych tkanek mogą powstawać wierzchołki pędów zwane przybyszowymi .Tworzą się one na różnych organach roślin (korzeniach, łodygach, liściach) W łodygach i liściach pąki przybyszowe powstają z epidermy i subepidermy. Eksplantaty korzenia wytwarzają pąki przybyszowe w korze pierwotnej, a z budowy wtórnej tworzą pąki w sąsiedztwie albo w obrębie floemu wtórnego. Kierunek organogenezy eksplantatów pierwotnych a wiec tworzenie pędów korzeni przybyszowych lub zarodków somatycznych zależy nie tylko od rodzaju wzajemnych proporcji zastosowanych auksyn i cytokinin ale również od rodzaju tkanki, gatunku rośliny i kondycji kultury. Metoda wykorzystywana do rozmnażania roślin cebulowych. Embriogeneza somatyczna - jest procesem biologicznym, podczas którego formują się zarodki z komórek wegetatywnych, wyzwolenie potencjału do tworzenia się zarodka w pojedynczej kom lub ich grupie nazywane jest indukcja embriogeniczności. Budowa zarodka somatycznego: - istnieje wiele wspólnych cech w formowaniu zarodków somatycznych i zygotycznych, a poszczególne stadia rozwoju zarodków( globularne, serca) sa podobne lub wręcz identyczne, - zarodki mają wyraźne zaznaczoną biegunową strukturę typu pęd- korzeń. Efektem końcowym embriogenezy somatycznej jest kompletna roślina z wykształconym jednym liścieniem(1-liścienne) lub dwoma liścieniami( 2-liścienne), a także epikotylem i korzonkiem zarodnikowym. Zastosowanie: - metoda ta może znaleźć istotne zastosowanie w nasiennictwie i szkółkarstwie, ze względu na niezwykle wysoki współczynnik rozmnażania, - przykładowo w Cyclamen persicum do 40 tys sztuk zarodków w 1 litrze pożywki w czasie 10 tyg, - metoda znalazła zast do produkcji drzew leśnych głównie iglastych, roślin ozdobnych i warzywnych. Izolowane merystemy Alternatywne sposoby prowadzenia kultur merystemów:1.* Wielokrotny podział roślin które rozwinęły się z merystemów na „ sadzonki węzłowe” - metoda przydatna w wielkotowarowym systemie uprawy roslin ozdobnych, sadowniczych oraz Asparagus officinalis i Solanum tuberosum, zapewnia ciągłą produkcję mikrosadzonek identycznych z genotypem rośliny matecznej. Szczególna odmianą tej metody jest indukowanie organów spichrzowych np. mikrobulwek lub mikrokłączy u Alstromeria, Cymbidium, Gloriosa na pędzie uzyskanym z merystemu. Pożywki nie zawierają lub zawierają śladowe ilości substancji wzrostowych co zapobiega zmienności somaklonalnej. 2.* Pobudzenie pojedynczego merystemu do podziału - poliferacja tk merystematycznej w której powstają liczne pąki i pędy na drodze organogenezy bezpośredniej( bez stadium kalusa), - duże wierzchołki pędów ( merystem wierzchołkowy, zawiązki liści i powierzchniowo usytuowane paki boczne) wkłada się na pożywkę z dodatkiem cytokinin o wysokim stężeniu co powoduje rozwój tzw wieloroślinek. Ponowne pasaże wieloroślinek gwarantuje w krótkim czasie uzyskanie tysięcy roślin potomnych, - wykorzystywana do propagacji m in Dianthus, Chrysantemum, Rosa multiflora, oraz drzew Malus czy Prunus.3.* W ramach tej techniki obiecująca jest metoda „ powiększania” lub „ rozszerzania” merystemów - praktykuje się wykładanie merystemów na pożywkę zawierającą retandanty( paklobutrazol, acymidol, diaminozyd, etylen lub etafon), - w efekcie merystem powiększa się 56-krotnie , po czym może być powtórnie podzielony i po kolejnych subkulturach przeniesiony na pozywkę bez substancji wzrostowych, na którego z każdego eksplantatu rozwiną się rośliny 4.* poliferacja tk merystematycznej drogą regeneracji czyli organogenezy pośredniej poprzez stadium kalusa, rozwijające się pąki i pędy, - izolowane merystemy wykładane są na pozywki z dodatkiem dużych ilości auksyn przez co uzyskuje się efekt namnożenia kalusa, w tk kalusa pojawiają się centra merystematyczne z których dopiero masowo rozwijają się pęd i rośliny, - wadą jest duża tendencja do zmienności somaklonalnej Kultura pędów bocznych (pachwinowych) Inicjalnymi eksplantatami w tej metodzie mikrorozmnażania mogą być: - merystemy pąków wierzchołkowych lub bocznych, - wierzchołki pedów, - pąki kwiatowe( boczne), - fragmenty pędów z węzłem, parą liści i pąków bocznych, - wierzchołki mogą być izolowane z zarodków somatycznych. Wymienione eksplantaty zawierają: merystem, 2-3 zawiązki liści, oraz kilka paczków bocznych osadzonych w „ kątach liści”, inaczej nazywana sadzonkowaniem in vitro Procedura postępowania * po wyłożeniu na pożywkę nie zawierającą substancji wzrostowych paki nie krzewią się, rozwijają się w pojedynczą roślinkę.Za pomocą tej metody rutynowo namnaża się wiele gat: Nephrolepis, Arhidiaceae, Spatiphyllum. Kultury primordiów pędowych 1. Zakładamy je izolując z pąków wierzchołkowych merystemy z 3 zawiązkami( primordiami) liściowymi , umieszczamy je na pożywce płynnej, ważne jest: - skład pożywki(NAA•BAP), - cyrkulacja, - objętość płynu i tkanki, - temp, - intensywność naświetlenia, - częstotliwość 2. Po wstępnym okresie stabilizacji- intensywne namnażanie primordiów pędowych, które tworzą zielone eulorofilowe agregaty 3. Po wyłożeniu ich na pożywkę zestaloną z dodatkiem auksyny→ ukorzenianie→ regeneracja rośliny Metoda znalazła zastosowanie w masowej produkcji wielu gat roślin 1 i 2 - liściennych oraz drzewiastych, ma bardzo wysoki współczynnik namnażania, porównywalny do embriogenezy somatycznej. Produkcja roślin in vitro na świecie Rozmnażanie wegetatywne in vitro znalazła zastosowanie przede wszystkim w produkcji takich roslin, które trudno się rozmnaża za pomocą tradycyjnych metod in vivo( rośliny ozdobne, drzewa leśne, odm heterozygotyczne) oraz rośliny elitarne o dużej wartości jednostkowej. Przygotowanie do samodzielnego wzrostu -in vitro: pożywka ukorzeniająca, po właściwym ukorzenieniu uchylić zamknięte naczynia, usunąć agar,doodać fungicydy, umieścić w stałym podłożu (mineralne ,gleba) -ex vitro: ukorzenianie poza szkłem (subst. stymulujące ukorzenianie), umieścić w stałym podłożu (mineralne, gleba) Czynniki korzystne -wysoka wilgotność -cieniowanie -właściwy fotoperiod -ogrzewanie podłoży- po rozwinięciu nowych liści -wyłączenie ogrzewania -stopniowa redukcja wilgotności -zwiększenie natężenia światła słonecznego, Podłoże mineralne np.Vernikulit, pianka poliuretanowa, perlit, wełna mineralna, kostki torfopodobne Zalety:-sterylne, wolne od patogenów *ułatwia ukorzenianie dzięki specjalnej strukturze porowato-fibrylnej *nie zawiera subst. odżywczych tj. zanieczyszczeń organicznych *sprasowane w bryłach lub kostkach ułatwia transport roślin *gwarantuje dogodną migrację i dyfuzję gazów *zapewnia optymalną dystrybucję H2O Warunki fotoautotroficzne -wysokie nat. Światła -wysokie stężenie CO2 Zalety hodowli autotroficznej 1. namnażanie roślin jest 2 razy szybsze 2 .można zredukować lub wyeliminować subst .wzrostowe 3. spada wilgotność poniżej 100% co hamuje m.in. syntezę etylenu, poprawia to wigor roślin, normalnie funkcjonują aparaty szparkowe 4. przy braku cukru spada % infekcji bakteryjnej i grzybowej 5. można prowadzić hodowlę w dużych pojemnikach-spadek kosztów 6 .łatwa aklimatyzacja roślin przy wsadzaniu do gruntu Korzyści z klonowania in vitro - mikrorozmnażanie może być kontynuowane przez cały rok, umożliwia powrót do formy juwenilnej -ułatwia prace hodowlane (pozyskanie nowych odmian, skracanie cyklu hodowlanego, namnażanie genotypów niestabilnych-chimer) -zastępuje szczepienie bądź okulizację -umożliwia przechowywanie ogromnej ilości materiału namnożeniowego na stosunkowo małej pow. -ułatwia fitosanitarne przemieszczanie się roślin między różnymi krajami -dostarcza materiał wolny od mikroorg .patogenicznych -przy doborze właściwej metody klonowania obniża koszty produkcji roślin -gwarantuje stabilność genetyczną Kultury protoplastów stanowią unikalną populację jednokomórkowych jednostek odizolowanych od siebie.-każdy zastosowany czynnik eksperymentalny dociera do wszystkich komórek jednakowo tj. w tym samym czasie i z jednakową częstotliwością. - protoplasty są bardzo przydatne w badaniach czynników indukujących morfogenezę oraz badaniach mutacyjnych Wykorzystanie protoplastów Jako system jednokom. pozbawiony ścian komórkowych i zdolny do ich odtwarzania, protoplasty stanowią doskonały model doświadczalny służący do badania szeregu procesów przebiegających na poziomie: bosyntezy ścian komórkowych - *badania właściwości plazmolemy, składu błon, ładunku receptorów błonowych, mechanizmu aktywnego, pobierania i transportu związków drobnocząsteczkowych -*funkcjonowanie organelli *badanie wpływu patogenów na roślinę *źródła pozyskania mieszańców somatycznych *doskonały materiał do biotransformacji*wpływ hormonów na morfogeneze *badania czynników wpływających stymulująco bądź hamująco na podstawowe funkcje metaboliczne Pozyskiwanie protoplastów: fragment tkanki (np. Liść), podajemy sterylizacji oraz usuwamy epidermę *skrawki umieszcza się w mieszaninie enzymów macerujących ścianę komórkową ( istotny czas inkubacji, temp, pH) *degradacja dwuetapowa: -najpierw działają enzymy peptyno- a następnie celulityczne *degradacja jednoetapowa: - stosuje się mieszaninę różnych enzymów o aktywności totalnie degradującej ściany * ważny dodatek stabilizatorów osmotycznych ( o charakterze jonowym i niejonowym) *mieszaninę filtruje się przez sita *delikatnie wiruje się *w zależności od zastosowania stabilizatora frakcję protoplastów zbiera się w osadzie lub na powierzchni płynu * przemywa kilkakrotnie roztworem stabilizatorów osmotycznych lub pożywką *ostatecznie protoplasty poddaje się ocenie morfologicznej i jakościowej Fuzja protoplastów: Zlanie protoplastów ułatwiają tzw. stymulatory które mogą być różnego pochodzenia: *natury fizycznej: wirowanie, impulsy elektryczne, elektroforeza *natury chemicznej: glikol polietylenowy, alkohol poliwinylowy, lektyny, wysokie stężenie jonów wapnia o silne alkalicznym pH Somatyczna hybrydyzacja protoplastów polega na: Fuzja protoplastów --> sekcja heterokariocytów --> hodowla mieszańców (krzyż. wsteczne) -->pełna regeneracja roślin ( nowa jakość) Wydajność fuzji 30% , Heterokariony 10-40% Selekcja heterokariocytów Do czynników identyfikujących i selekcjonujących należą: barwienie różnymi barwnikami „ przyżyciowymi” np: rodamina B- fluorescencyjna *okresowe stosowanie różnych inhibitorów metabolicznych *analiza izoenzymatyczna * stosowanie różnych markerów cytochemicznych i molekularnych Kontrola zdrowotności kultur Metody eliminowania wirusów: * Chemioterapia- stosowanie związków, które włączają sie w metabolizm wirusa i hamują jego namnażanie ( antymetabolity) również antybiotykoterapia Termoterapia- działanie podwyższoną temperaturą ( ok 3 tyg w temp. 35-40C ) na roślinę w celu inaktywacji wirusów Izolowanie merystemów wierzchołkowych z roślin poddanych uprzednio termoterapii Kontrola zdrowotności namnożonego materiału. testowanie biologiczne *testy sereologiczne ( gotowe przeciwciało zawarte w surowicy łączy się z wirusem zawartym w ekstrakcie z rośliny) * analiza pod mikroskopem elektronowym i fluorescencyjnym *testy enzymoimmunologiczne- ELISA * metody molekularne( hybrydyzacja kwasów nukleinowych wirusa i znakowanej sondy) Problemy z powiększaniem skali kultur przygotowanie inokultur *metoda inkubacji, transfer do bioreaktora i odbiór namnożonego materiału *stres mechaniczny związany z mieszaniem pożywki * wprowadzenie światła do bioreaktora *problem zachowania podobieństw o charakterze fizycznym i biologicznym Embriogeneza somatyczna w bioreaktorach. Modelowy system indukowania embriogenezy somatycznej w bioreaktorze- na przykładzie poinsecji (Gwiazda betlejemska-Euphorbia pucherina) Etapy: Faza proembriogenna ( inicjacja embriogenezy) kultura wstępna- eksplantant (merystem wierzchołkowy) pobrany z rośliny rosnącej w szklarni umieszczony na pożywce zestalonej agarem indukującej kalusowanie. Po 2-3 tygodniach kalus przenosi się na pożywkę płynną o tym samym składzie i umieszcza się na wytrząsarce pasażowanie- po kolejnych 3 tyg agregaty komórek filtruje się a większe skupiska komórek osadzone na sitach przenosi ponownie na pożywkę zestaloną agarem, celem wyprodukowania tzw „ wtórnych kalusów” mających zdolność do zarodnikowania klonalnego pozyskiwanie inokulum wyjściowego - po 2 tyg szybko rosnącą masę poddaję się filtrowaniu na sitach i uzupełnia w 2\3 swieżą pożywką, otrzymana zawiesina stanowi suspensję wyjściową dla bioreaktora Kultury w bioreaktorach - pożywka płynna ( ściśle kontrolowane warunki wewnętrzne). Zarodki stopniowo osiągaja stadium globuli i dalej stadium serca. Barwa suspensji zmienia się z białawej na zielonkawo- brązową Konwersa embrionów w rośliny -zarodki usuwa się z bioreaktorów, odsącza się na sita i umieszcza na szalkach Petriego na pożywce zestalonej pozbawionej auksyn- MS +0,05 mg BAP po 3 tyg. normalnie rozwijające się zarodki izolowane są od form dewiacyjnych i kalusujących prawidłowo rozwijające się zarodki ponownie się umieszcza na pożywce o tym samym składzie i po 1-2 tyg zarodki kiełkują wytwarzając długi hypokotyl charakterystyczny dla poinsecji po osiągnięciu 20 -25 mm eksplantaty przenosi sie do szklarni ( przeżywalność ok 90 %)Efektywność stymulowania embriogenezy somatycznej w bioreaktorach dla poinsecji. Wydajność- teoretycznie można otrzymać 100 tyś. zarodków z 1 litra suspensji -czas ok 3 miesiące Sztuczne nasiona: *pozbawione otoczki zarodki somatyczne poddane procedurze wysuszenia *otoczkowanie zarodków poddane desykacji *uwodnienie zarodki ( merystemy wierzchołkowe) otoczone kapsułą z żelu *uwodnione zarodki zanurzone w płynnym żelu Otoczkowanie nasion: unieruchomienie fragmentu tkanki *zminimalizowanie funkcji życiowych *ochrona przed niekorzystnymi czynnikami środowiska *ochrona przed utlenieniem i desykacja (odwodnienie) *ochrona przed uszkodzeniem mechanicznym podczas siewu i transportu *wprowadzenie regulatorów, mikroflory, pestycydów* możliwość wprowadzenia do otoczek hydrofilnych dodatkowych otoczek hydrofobowych Etapy wytwarzania sztucznych nasion: roślina macierzysta, *eksplantat *indukcja i proliferacja kalusa embriogennego *namnożenie komórek w zawiesinie embriogennej. * synchronizacja stadiów embiogenezy i hartowanie zarodków. *filtrowanie *suszenie *otoczkowanie *wysiew nasion in-vivo lub in-vitro Rodzaje hydrożeli: otoczki polisocharydowe-najważniejsze ze wszystkich *organiczne żele (poliakryloamidowe) *żele białkowe (żelatyna, polimer glutaraldehydowy lub formaldehydowy Pochodz wiązań żelifikujących żele powstają poprzez krzyżowe wiązanie jonowe odpowiednio naładowanych polimerów np. Alginian, chitozan, karaginian żele powstałe zimnej lub gorącej polimeryzacji (agar, agaroza, karaginian). żele powstałe drogą chemicznej reakcji (poliakrylamian, formaldehyd).Otoczki agarowe Agar- polisacharyd ekstrahowany z różnych gatunków czerwonych wodorostów pozyskiwanie: 2-4% agar rozpuszcza się w soli fiajologicznej w temp. 100C, a następnie schładza do 50C dodaje się materiał roślinny (zarodki lub merystemy) zawieszone w soli fizjologicznej po zestaleniu tnie się żel lub otacza fazą hydrofobową np. olejem można ciepły agar wraz z komórkami wkraplać do oleju silikonowego lub sojowego, umieścić na mieszadle magnetycznym i po stężeniu oddziela się kuleczki -droga wirowania Otoczki agarozowe Agaroza- naturalny czynnik żelifikujący otrzymany z agaru pozbawionego grup estrowosiarczanowych pozyskiwanie agaroza 2-4% w temp. 35*C dobrze się rozpuszcza a jednocześnie żelifikuje przygotowany już roztwór wraz z komórkami dodajemy wkraplając do oleju roślinnego umieszczonego na mieszadle, całość oziębiamy i wirujemy Otoczki alginianowe Alginiany otrzymywane są z olbrzymich brązowych alg morskich Macrocystis i Laminaria drogą ekstrachowania zasadą sodową. Otrzymywany kwas alginianowy składa się z jednostki M ( kwas manuroniowy ) oraz jednostki G ( kwas gulurioniowy )Kiedy jony Na+ zastąpimy jonami dwuwartościowymi np. Ca2+ ,Ba2+ , Si2+, Zn2+ lub Al3+ tworzy się sieć polimerowa pomiędzy jonami. Powstają wiązania krzyżowe pomiędzy grupami karboksylowymi, a molekułami polisacharodowymi. Proces jest termo niezależny i bardzo dobrze w strukturę żelu dopasowuje się wapń. Procedura pozyskania suspensje komórek miesza się w temp. pokojowej ze sterylnym roztworem alginianu sodu 2-3% *następnie mieszaninę tę wkrapla się do roztworu chlorku wapnia (50-300 mM CaCl2) *perełki o określonej średnicy (0,5-5 mm) utwardzają się przez kilkanaście minut do kilku godzin - powleka się je dodatkową warstwą hydrofobową na etapie kiełkowania zarodków, otoczki rozpuszcza się w EDTA lub buforze cytrynianowym ( fosforanowym ) Kiełkowanie i konwersja Kiełkowanie- zdolność do formowania korzonka zarodkowego Konwersja- równoczesny rozwój korzonka zarodkowego i merystemu pędu, z wytworzeniem rośliny o fenotypie właściwym dla danego gatunku Otoczki karaginianowe Otrzymywane z komórek czerwonych wodorostów typu Chondrus, Euchemia, Gigartina... pozyskiwania2-5% roztwór karaginianu ogrzewa się do temp. 45°C, a po schłodzeniu miesza się w/w roztwór z suspensją komórek *następnie wkrapla się zawiesinę w karaginianie komórki do roztworu KCl (kąpiel utwardzająca) *perełki (2-4 mm) otrzymuje się w KCl przez 1-5 godz. najczęściej stosowane Inne celuloza i jej pochodne,chitozan, żelifikujące gumy, pektyny, podwójne otoczkowanie np. alginiany/ pektyniany , karaginian/ chitozan lub -algininian/ chitozan, najnowsze otoczki hydrofobowe, Tulanox, Elwox, Bio- kapsuły! (osłonki zaindukowane wokół zarodka somatycznego imitujące okrywę nasienną z kutikulą Efektywność maszyny do otoczkowania -500000 sztucznych nasion o średnicy 80 ul dziennie maszyna otoczkuje zarodki somatyczne: pomidorów, bawełny, petunii, ogórka, sałaty, papryki, tytoniu, melona, zbóż. *Stopień konwersji 8-90% i zależy od gatunku rośliny i warunków kiełkowania. W warunkach polowych dla sztucznych nasion M. media (lucerna) A. gravedens (seler) czy D. carota (marchew) wynosi 50-80 Rodzaje nasion: Ortodoks- genotypy, które można poddawać wysuszeniu Rekakacitrant - genotypy bardzo wrażliwe na wysuszenia (nie tolerują) Etapy wytwarzania sztucznych nasion Uzyskanie i namnażanie materiału wyjściowego Dojrzewanie i hartowanie (przygotowanie materiału do suszenia i otoczkowania) GA3 , ABA zapewniają prawidłowy rozwój zarodka, odporność na dehydratację oraz zapobiegają przedwczesnemu kiełkowaniu. hartowanie polega na osuszeniu i lekkim schłodzeniu Odwodnienie- eksykator lub glikol polietylenowy Otoczkowanie- otoczka pełni rolę „sztucznego bielma„ a dodatkowo osłonka hydrofobowa „okrywę nasienna” Wysiew- w zależności od typu sztucznych nasion, przenosi się je do warunków in vitro w celu dalszego przechowywania lub wysiewu do gruntu in vivo Problemy technologii sztucznych nasion indukcja zarodków somatycznych (dodatek różnych substancji m. in. Aminokwasów), faza dojrzewania zarodków i konwersji → podstawa ABA, problem O2, wysychanie otoczek, stopniowe uwodnienie nasion!, koszty produkcji, próby tworzenia Bio- kapsuł namnaża się przez sztuczne nasiona: hybrydy ryżu, geranium, europejskie odm. ogórka , gerberę, kawę, lucerne. Potencjalne korzyści szybkie namnażanie pożądanej linii, gwarancja genetycznej jednorodności roślin bezpośrednie transplantowanie tkanki do gleby dostarczanie i namnażanie zmiennych (niestałych) genotypów, takich jak rośliny transgeniczne o wysokiej niestabilności genetycznej dostarczenie sterylnych linii redukcja kosztów związanych z wegetatywnym namnażaniem linii elitarnych możliwość masowej produkcji tkanki embriogennej z komórek poddanych inżynierii genetycznej Banki genów Przechowywanie materiału roślinnego Krótkoterminowe przechowywanie materiału roślinnego w stosunkowo niskiej temp. Ok. 4°C, przy niskim natężeniu światła i na ubogich pożywkach. Długoterminowo- w temp. 70°C (zamrażanie przemian metabolicznych, chociaż istnieje niebezpieczeństwo powolnego utleniania tłuszczów oraz wzrost ilości mikrokryształów lodu w komórkach *w temp. -196°C (temp. Ciekłego azotu) komórki przez wiele lat nie tracą żywotności Przechowywanie komórek in vitro w bankach genów (zamrażanie) Etapy:.wzrost wstępny kultury prowadzi się w pożywkach o obniżonym potencjale chemiczny, wody (sacharoza, mannitol, glukoza) oraz przy niskiej zawartości azotu (komórki są małe i słabo zwakuolizowane) krioprotekcja (krioprezerwacja) przed zamrożeniem usuwa się nadmiar wody z komórek i przestrzeni międzykomórkowych. Uzyskuje się ten efekt nasączając tkanki roztworem gliceryny, sacharozy, dwufenylosulfanianem DMSO, aminokwasem proliną lub glikolem plietylenowym. Możliwe jest łączenie kriopretaktantów w formie 2 lub 3 składników. zamrażanie metodą konwencjonalną zamrażanie wstępne (0-40°C) optymalne tempo schładzania 0,5-2 C/min. (zależy od stopnia odwodnienia struktury i krystalizacji, wody w krioprotektancie) , zamrażanie trwałe w cikłym azocie metoda odwodnienia struktury roślinneulegają odwodnieniu (dehydratacji) w temp. Pokojowej, zamrażanie w ciekłym azocie metoda witryfikacji umieszczenie tkanki w silnie stężonym roztworze krioprotektantów (odciąganie wody do przestrzeni międzykomórkowych i do roztworu), zamrażanie w ciekłym azocie przechowywanie właściwe (-196°C), odmrażanie, przywrócenie właściwego tempa wzrostu komórek Krioprezerwacja zapewnia zachowanie stabilności genetycznej materiału na bardzo długi okres czasu stad z powodzeniem stosowana jest do przechowywania tkanek roślinnych, sztucznych nasion. Schemat zamrażania komórek w ciekłym azocie Komórki roślinne--> Pożywka adaptacyjna--> Mieszanina kriochronna -->Zamrażanie--> Przechowywanie--> Rozmnażanie Przeżywalność zakonserwowanego materiału zależy od: tolerancji na dehydratację i działanie skoncentrowanych roztworów odwadniających odporność na zamrażanie protoplastu (cecha uwarunkowana genetycznie) stopnia uwodnienia i wielkości zamrożonej struktury Banki genów Holandia, Francja, Anglia, Belgia, Polska- Leśny Bank Genów w Kostrzycy od 1995 r., Ex- situ (poza naturalnym środowiskiem) →banki genów, In- situ (poza naturalnym ekosystemem), In vitro (w szkle), Zachowanie zasobów genowych in vitro techniki kultur in vitro umożliwiają mikrorozmnażanie i średnio- lub długoterminowe przechowywanie materiału roślinnego w bankach genów roślinnych izolowanie komórki, tkanki zmodyfikowane genetycznie, haploidy, rośliny użytkowe, rzadkie lub ginące gatunki, kolekcje ogrodów botanicznych lub arboretów, roślin transgenicznych przechowywane są w: warunkach powolnego wzrostu, warunkach kriogenicznych, w postaci sztucznych nasion
Hodowla roślin. W cyklu hodowlanym wprowadza się nowe oraz doskonali już istniejące cechy użytkowe tworząc odmiany w gatunkach roślin uprawnych. Rośliny nabierają nowych właściwości przez trwałą zmianę składu genetycznego. Genetyka- nauka o dziedziczności i zmienności organizmów Kultury in vitro To hodowla komórek i tkanek roślinnych na sztucznych pżywkach w warunkach sterylnych. Regeneracja roślin na drodze organogenezy lub embriogenezy somatycznej Mikrowstrzeliwanie- rozmnażanie klonalne, kultury zarodków, kultury roślin haploidalnych Haploid- roślina zawierająca w swoich komórkach somatycznych gametyczną liczbe chromosomów Sposoby uzyskiwania roślin haploidalnych eliminacja chromosomów w zarodkach powstających w wyniku krzyżowań między gatunkami i między rodzajami, androgeneza - sporoficzny rozwój gametofitu męskiego: kultury pylnikowe , kultury izolowanch mikrospor gynogeneza- sporoficzny rozwój z haploidalnych komórek woreczka zalążkowego: kultury niezapłodnionych zalążkó i zalążni, kultury zapłodnionych zalążków i zalążni Uzyskiwanie zmienności genetycznej:Mutacje ;Rekombinacje i segregacje, kultury merystemowe, transformowanie obcego DNA, kultury kalusa , mieszańce płciowe , kultury protoplastów, mieszańce somatyczne, haploidy (-) androgeneza (-) gynogeneza Utrzymanie zmienności gamet i rozmnażania roślin Kultura merystemów i pąków przybyszowych, Kultury kalusowe, Kultury komórki, Kultury protoplastów Zalety z kultur in vitro w pracach genetyczno- hodowlanych Dysponowanie ogromnymi liczebnościami genotypów na bardzo małych powierzchniach, Uzyskanie efektów selekcji w krótkim czasie ,Możliwości bardzo precyzyjnej kontroli czynników dotyczących działania mutagetagenami, warunków selekcji i wzrostu Diagnostyka molekularna Porównanie markerów molekularnych z morfologicznymi *przy pomocymarkerów molekularnych, genotypy roślin mogą być określane w całym okresie wzrostu i rozwoju rośliny, na poziomie tkankowym i komórkowym w przypadku markerów morfologicznych, genotypy określane są tylko na poziomie całych roślin i często dopiero w stanie dojrzałej rośliny. *w wielu gatunkach roślin występuje naturalna zmienność alleli w większości loci markerów molekularnych. A zatem w badaniach genetycznych można wykorzystać naturalną zmienność w istniejących populacjach bez konieczności zmienności wymaganej często dla loci morfologicznych *zmiennośćizoenzymów i markerów DNA wykazuje zwykle neutralność fenotypową podczas gdy markery morfologiczne powodują zmienność fenotypowa często niepożądana w populacjach hodowlanych *allele niektórych typów loci molekularnych (np. izoenzymy, RLFP) wykazują kodominujący charakter dziedziczenia. Dominujący charakter dziedziczenia cech morfologicznych uniemożliwia rozróżnienie wszystkich genotypów *niepożądane działania epistatyczne występujące często pomiędzy loci kodującymi morfologiczne cechy mogą limitować liczbę segregującuch markerów możliwych do obserwacji w jednej segregującej populacji. Większość markerów molekularnyc pozbawiona jest tego typu oddziaływań tak więc liczba loci, jaką można obserwować w jednej populacji jest teoretycznie ograniczona. Diagnostyka oparta o markery (znaczniki, własności) Diagnostyka oparta o markery morfologiczne (monogeniczne dziedziczenie)Diagnostyka molekularna oparta o markery genetyczne Wynik diagnostyczny powstaje na podstawie Oceny polimorfizmu fragmentów restrykcyjnych (RFLP)Określenie długości badanego fragmentu DNA Wykrycie delecji, insercji, mutacji punktowych Określenie sekwencji badanego fragmentu DNA Łańcuchowe reakcje polimerazy PCR stadia reakcji: denaturacja DNA, w temp. od 95°C w wyniku której powstają jednoniciowe cząsteczki DNA 2.przyłączanie starterów do jednoniciowej cząsteczki DNA w miejscach komplementarnych do homologii starterów ich długości itp. 3.synteza nowych nici DNA w temp. od 72°C Rodzaje markerów molekularnych izoenzymy (polimorfizm białek, kodominowanie) *markery DNA (polimorfizm DNA) RFLP,MAAP, AFLP, STMS, SCAR (STS) *RFLP badanie polimorfizmu Diagnostyka oparta na hybrydyzacji z sondami molekularnymi hybrydyzacja punktowa DNA lub RNA, unieruchomienie w temp. 80°C lub promieniowanie UV, inkubacja z sondami metoda Sontherna hybrydyzacja DNA-DNA metoda Northen hybrydyzacja RNA-DNA hybrydyzacja in situ. PTL- loci cech ilościowych Inżynieria genetycznaGenetyka molekularna i technika rekombinacji DNA przyczyniły się do opracowania metod pozwalających na uzyskanie nowej zmienności droga transformacji Transformacja genetyczna - jest to proces przenoszenia obcych fragmentów DNA (genów) do genomu biorcy i stabilna ich integracje w tym genomie (przenoszenie genów bez względu na ich oddalenie fitogenetyczne) Etapy uzyskiwania roślin transgenicznych 1*wyizolowanie i sklonowanie genu przeznaczonego do transformacji 2*opracowanie metody wprowadzenia genu do komórek roślinnych, 3*ustalenie metodyki regeneracji transformowanych komórek kompletnie wykształcone rośliny, 4*określenie sposobu sprawdzenia integracji i ekspresji wprowadzonego genu, 5*zbadanie stabilności transformowanego genu w następnych pokoleniach roślin i określenie sposobu dziedziczenia nabytej cechy Konstrukt stosowany w transformacji składa się z : gen strukturalny (cecha), gen markerowy ( selekcyjny) np. aro A, odporność na glyfosad lub npt H, odporność na neomycyne i kanamycyne oraz reporterowy (wizualizujący) np. GUS, β glukuronidaza , promotor i terminator, sekwencje regulacyjne ( promotor poprzedzający gen strukturalny jest odpowiedzialny za inicjację transkrypcji, a terminator za jej ukończenie) Metody transformacji: wektorowe , bakterie z rodzaju Rhizobium- Agrobaterium fumefaciens plazmid Ti oraz Agrobacterium rhizogenes , plazmid Ri System Agrobacterium wykorzystuje się do roślin 2-liściennych bezwektorowe , makroiniekcja, mikroiniekcja, elektroporacja, mikrowstrzeliwanie- wykorzystuje się do wprowadzenia konstruktów DNA u roślin 1-liściennych wprowadzone geny: nie ulęgają ekspresji, bardzo słaba ekspresja zanika w kolejnych pokoleniach bo „wyciszenie genów”- poznano powierzchownie, przypadkowe miejsce integracji obcych genów w transkrypcyjnie nieaktywne obszary genomu wyklucza z reguły możliwość transkrypcji (rejony chromosomów zwane heterochromatyną) modyfikacja obcego DNA przez metylacje, której ulega cytozyna, prowadzi to do zablokowania trankrypcji trandezaktywacja ( kosupresja) polega na wyciszaniu transkrypcji genu homologicznego za pomoca transformacji Wykorzystanie roślin transgen w hodowi wprowadzenie cech : odporność na szkodniki i choroby wirusowe, bakteryjne i grzybowe odporność na herbicydy modyfikacje cech użytkowych roślin ingerencja w metabolizm związany z dojrzewaniem modyfikowanie spektrum barw kwiatów zmiany w metabolizmie węglowodanów i tłuszczów rośliny transgeniczne jako bioreaktory do syntezy białek: alfa- amylazy, beta- glukozydazy, peroksydaza ligniny - białka przemysłowe oraz źródło przeciwciał i szczepionek rośliny transgeniczne mogą służyć do biodegradacji plastiku
Wymień metody rozmnażania in-vitro
-Powstanie zarodków somatycznych kulturach tkanek i organów -Różnicowanie pąków przybyszowych w kulturach kalusa -Różnicowanie pąków przybysz. bez pośrednictwa tkanki kalusowej-Rozwój pąków bocznych w kulturze merystemów wierzchołkowych -Rozwój pąków bocznych w kulturze fragmentów pędów i innych organów -Kultury primordiów pędowych.
2. Co to są kultury protoplastów, jak je pozyskujemy i do czego wykorzyst?
Kultury protoplastów stanowią unikalną populację jednokomórkowych jednostek odizolowanych od siebie, pozbawionych ść. kom. I zdolnych do ich odtworzenia.
Pozyskiwania: - fragment tkanki podajemy sterylizacji oraz usuwamy epidermę - maceracja ść. kom. (jedno lub dwu etapowa) - dodajemy stabilizatory osmotyczne ( o charakterze jonowym i niejonowym) - mieszaninę filtruje oraz wirujemy - zebranie frakcji protoplastów -przemywa kilkakrotnie roztworem stabilizatorów osmotycznych lub pożywką - ostatecznie protoplasty poddaje się ocenie morfologicznej i jakościowej
Wykorzystanie: - badania nad bosyntezą ścian komórkowych - badania właściwości plazmolemy, składu błon itp. - funkcjonowanie organelli -badanie wpływu patogenów na roślinę -źródła pozyskania mieszańców somatycznych - doskonały materiał do biotransformacji - adania nad wpływ hormonów na morfogeneze - badania czynników wpływających stymulująco bądź hamująco na podstawowe funkcje
3. Bioreaktor. eksplantat, organogeneza pośrednia.
Bioreaktor - użadenie służace da zapewnienia optymalnych warunków wzrostu i rozwoju kom. somatycznym w kierunku zainicjowania embiogenezy somatycznej.
Eksplantat - Fragment rośliny umieszczony na pożywce w celu uzyskania tk. kalusowej, rozmnożenia rośliny lub zregenerowania jej.
Organogeneza pośrednia - odtwazanie organu lub całej rośliny nie bezposrednio z eksplantatu, ale za pośrednicstwem tk. kalusowej powstałej na eksplantacie.
4. Metody zabezpieczania genomu i jego reaktywacja.
Aby moc przechowywać genom należy posiadać miniumu jedna komórkę zawierająca pożądany mat. gen. Które uzyskuje się hodując na zubożonej pożywce, aby otrzymać małe i słabo zwakuolizowane komórki, które następnie poddaje się krioprotekcji, poczym zamraża. Przechowuje się je w temp. -196 C (temp. Ciekłego azotu) gdyż w takich warunkach przez wiele lat kom. nie traci żywotności. Aby je reaktywować należy je rozmrozić i zapewnić warunki przywracające właściwe tępo wzrostu.
5. Sztuczne nasiona - to zarodki somatyczne poddane procesowi dehydratacji a nastepnie otoczkowane.
6. Przykłady roślin transgenicznych: - kukurydza Bt., bawełna Bt, soja, rzepak, ziemniaki, pomidor, tytoń
8. Rodzaje transgenezy i jej efektywność
a) wektorowe - inaczej pośrednie, wprowadzanie mat. gen. za pomocą plazmidów, efektywnośc jest wysoka, ale metoda ta sprawdza się głównie u roślin jedno liściennych.
b) bezwektorowa (bezpośrednia) - mat. gen. wprowadzany jest za pomocą mikrowstrzeliwania, metoda wprawdzie jest skuteczna dla jedno i dwu liściennych, ale z racji częstych uszkodzeń mechanicznych czy nadmiaru kopi jest mało efektywna.
9. Embriogeneza somatyczna na przykładzie poinsecji. (to jest gwiazda betlejemska)
* Faza proembriogenna ( inicjacja embriogenezy)
-kultura wstępna- eksplantant (merystem wierzchołkowy) pobrany z rośliny rosnącej w szklarni umieszczony na pożywce zestalonej agarem indukującej kalusowanie. Po 2-3 tygodniach kalus przenosi się na pożywkę płynną o tym samym składzie i umieszcza się na wytrząsarce.
-pasażowanie- po kolejnych 3 tyg agregaty komórek filtruje się a większe skupiska komórek osadzone na sitach przenosi ponownie na pożywkę zestaloną agarem, celem wyprodukowania tzw „ wtórnych kalusów” mających zdolność do zarodnikowania klonalnego
-pozyskiwanie inokulum wyjściowego - po 2 tyg szybko rosnącą masę poddaję się filtrowaniu na sitach i uzupełnia w 2\3 swieżą pożywką, otrzymana zawiesina stanowi suspensję wyjściową dla bioreaktora
* Kultury w bioreaktorach - pożywka płynna ( ściśle kontrolowane warunki wewnętrzne). Zarodki stopniowo osiągaja stadium globuli i dalej stadium serca. Barwa suspensji zmienia się z białawej na zielonkawo- brązową
*Konwersa embrionów w rośliny
-zarodki usuwa się z bioreaktorów, odsącza się na sita i umieszcza na szalkach Petriego na pożywce zestalonej pozbawionej auksyn -po 3 tyg. normalnie rozwijające się zarodki izolowane są od form dewiacyjnych i kalusujących -prawidłowo rozwijające się zarodki ponownie się umieszcza na pożywce o tym samym składzie i po 1-2 tyg zarodki kiełkują wytwarzając długi hypokotyl charakterystyczny dla poinsecji -po osiągnięciu 20 -25 mm eksplantaty przenosi sie do szklarni ( przeżywalność ok 90 %)
11. Biblioteka genowa - to samo co bank genów.
12. Hybrydyzacja somatyczna - polega na zlewaniu się protoplastów z czego powstaje sekcja heterokarjocytów (nowe kombinacje genetyczne) z których odtwarzamy całe rośliny o nowych właściwościach.
13. Biotransformacja - to proces w wyniku którego dochodzi się do modyfikacji grup funkcyjnych związków organicznych przez żywe kom. lub wyizolowane z nich enzymy.
14. Merystemy wierzchołkowe (primordiów pędowych)
1. Zakładamy je izolując z pąków wierzchołkowych merystemy z 3 zawiązkami( primordiami) liściowymi , umieszczamy je na pożywce płynnej, ważne jest: - skład pożywki(NAA•BAP), - cyrkulacja, - objętość płynu i tkanki, - temp, - intensywność naświetlenia, - częstotliwość
2. Po wstępnym okresie stabilizacji- intensywne namnażanie primordiów pedowych, które tworzą zielone eulorofilowe agregaty
3. Po wyłożeniu ich na pożywkę zestaloną z dodatkiem auksyny→ ukorzenianie→ regeneracja rośliny
Metoda znalazła zastosowanie w masowej produkcji wielu gat roślin 1 i 2 - liściennych oraz drzewiastych, ma bardzo wysoki współczynnik namnażania, porównywalny do embriogenezy somatycznej.
15. Etapy klonowania in-vitro
I FAZA: 1.wybór rośliny matecznej, pobranie organu, dobór pożywki 2.stabilizacja kultury- uzyskanie zdolnego do regeneracji eksplantantu (pierwsze przyrosty tkanki kalusowej, rozwój pąków, pędów) II FAZA: szereg pasaży tkanki kalusowej, paków przybyszowych, zarodków, wierzchołków, pędów - na świeża pożywkę III FAZA: -ukorzenienie eksplantatów -przygotowanie do wysadzenia w pobliżu lub do gruntu -przywrócenie autotroficzności -aklimatyzacja. Z chwila wysadzenia do gruntu proces mikrorozmnażania in-vitro jest zakończony.
Biotransformacja - proces w wyniku którego dochodzi do modyfikacji grup funkcyjnych związków organicznych przez żywe komórki lub izolowanie z nich enzymy.
Eksplantat- fragment rośliny wyizolowany z organizmu macierzystego i przeniesiony n pożywkę.
Embriogeneza somatyczna- kierunek morfogenezy przybyszowej w kulturach In vitro polegający na formowaniu na nowo przybyszowych zarodków. Może być bezpośrednia (nowy zarodek powst. bezpośrednio z komórki eksplantatu) lub pośrednia(z kalusa).
Kalus- narośl powstająca w miejscu zranienia rośliny zasklepiająca ranę.W kulturach In vitro pows.kalusa jest indukowane czynnikami zew.(reg. wzrostu i rozwoju)
Roślina transgeniczna- roślina powstała w wyniku transformacji.
Transgen- właściwy gen, przeniesiony do transformowanej rośliny. Nie ma on w genomie rośliny swojego odpowiednika w postaci allelu, stąd roślina transgeniczna jest heterozygotą.
Linia transgeniczna- samozapylone rośliny transgeniczne o nowym fenotypie dają potomstwo rozszczepiające się lub jednolite. Te ostatnie pochodzą z homozygoty i dają ustaloną linie transgeniczną.
Zmienność samaklonalna- rośliny powstałe z transgenicznej komórki i mogą wykazywać różne zmienione właściwości, co nazywamy zmiennością samoklonalną- dziedziczoną trwale w kolejnych pokoleniach.
Transformacja- wprowadzenie obcych fragmentów DNA do komórek ,w których integrują się one z genomem biorcy. Może być bezpośrednie wprowadzenie genów np. mikrowystrzeliwanie lub wprowadz. przy użyciu Agrobacterium.
Totipotencja- nieograniczona zdolność każdej żywej komórki roślinnej do dzielenia i odtwarzania(regeneracji) całego organizmu.
Bioreaktory-duże pojemniki ,pozwalające prowadzić kultury komórek roślinnych w ściśle kontrolowanych i sterylnych warunkach.
Bank genów-centrum zasobów genowych prowadzące prace nad długoterminowym zachowaniem genotypów w postaci izolowanych fragmentów DNA ,nasion, ziaren pyłu, tkanek.
SZTUCZNE NASIONA-zarodki somatyczne lub inne części roślin zdolne do regeneracji, umieszczone w osłonce ochronnej, przygotowana do długoterminowego przechowywania lub do celów komercyjnych. Cel: przechowywanie i masowe namnażanie identycznych roślin .Ze wzgl.na cechy mater.wyróżniamy typy:odwodnione otoczkowane i nieotoczkowaneoraz uwodnione otoczkowani i nieotoczkowane. Otoczkowanie polega na zamykaniu materiału roślinnego w hydrożelu. Otoczka zapewnia ochronę przed wysychaniem ,utlenianiem, unieruchomienie fragmentu tkanki, ochrona przed niekorzystnymi czynnikami środowiska, możliwość wprowadzenia do otoczek hydrofilnych dodatkowych otoczek hydrofobowych, zminimalizowanie funkcji życiowych,
Sztuczne nasiona: -pozbawione otoczki zarodki somatyczne poddane procedurze wysuszenia -otoczkowanie zarodków poddane desykacji -uwodnienie zarodki ( merystemy wierzchołkowe) otoczone kapsułą z żelu - uwodnione zarodki zanurzone w płynnym żelu
Etapy wytwarzania sztucznych nasion: -roślina macierzysta -eksplantat -indukcja i proliferacja kalusa embriogennego -namnożenie komórek w zawiesinie embriogennej. -synchronizacja stadiów embiogenezy i hartowanie zarodków. -filtrowanie -suszenie -otoczkowanie -wysiew nasion in-vivo lub in-vitro
KONSTRUKCJA GENOWA: skł.się z genu kodującego określone białko, genu markerowego,genu reporterowego, dwóch genów regulatorowych(promotor i terminator).
Konstrukt -odcinek DNA ,plazmidu lub plazmidu w formie linearnej, zawierający gen strukturalny z sekwencjami regulacyjnymi(promotor i terminator),gen markerowy(selekcyjny_ i reporterowi(wizualizujący)
HYBRYDYZACJA SOMATYCZNA- krzyżowanie protoplastów komórek somatycznych należących do różnych gatunków. Somatyczna hybrydyzacja protoplastów polega na: Fuzja protoplastów-sekcja heterokariocytów -hodowla mieszańców (krzyż. wsteczne)-pełna regeneracja roślin ( nowa jakość).
4 etapy hybrydyzacji: immobilizacja badanego materiału
* hybrydyzacja z sonda molekularna * odmycie nadmiaru reagentów * detekcja sondy.
Etapy klonowania in vitro: a)rozwój struktur już istniejących lub powstanie przybyszowych b)regeneracja roślin c)powtarzanie tego stadium aż do uzyskania oczekiwanej liczby zregenerowanych roślin.
Etapy uzyskiwania roślin transgenicznych :1.wyizolowanie i sklonowanie genu przeznaczonego do transformacji 2.opracowanie metody wprowadzenia genu do komórek roślinnych 3.ustalenie metodyki regeneracji transformowanych komórek kompletnie wykształcone rośliny 4.określenie sposobu sprawdzenia integracji i ekspresji wprowadzonego genu 5.zbadanie stabilności transformowanego genu w następnych pokoleniach roślin i określenie sposobu dziedziczenia nabytej cechy
RODZAJE TRANSFORMACJI: a)wektorowe(pośrednie) , bakterie z rodzaju Rhizobium- Agrobaterium fumefaciens (plazmid Ti) oraz Agrobacterium rhizogenes (plazmid Ri).System Agrobacterium wykorzystuje się do roślin 2-liściennych,właczony pojedynczy transgen b)bezwektorowe (bezpośrednie), makroiniekcja, elektroporacja, mikrowstrzeliwanie- wykorzystuje się do wprowadzenia konstruktów DNA bez ograniczeń gat. .Elektroporacja- odwracalna destabilizacja błony kom. pod wpływem prądu elektrycznego o wysokim napięciu.
Rośliny transgeneniczne- rzepak, kukurydza, soja, bawełna
REAKCJA PCR(łańcuchowa reakcja polimerazy)technika służąca do powielania dowolnej sekwencji DNA z użyciem pary oligonukleotydowych starterów oraz termostabilnej polimerazy DNA.
Stadia reakcji: 1.denaturacja DNA, w temp. od 95°C w wyniku której powstają jednoniciowe cząsteczki DNA 2.przyłączanie starterów do jednoniciowej cząsteczki DNA w miejscach komplementarnych do homologii starterów ich długości itp. 3.synteza nowych nici DNA w temp. od 72°C .
1.primery (startery)przyłączają się do obu nici,każdy z nich do innej i łącznie wyznaczają dł. dwuniciowego fragm..DNA 2.synteaz DNA biegnie od końca 3' primera a ponieważ łańcuchy DNA są przeciwbieżna syntetaz nowych łańcuchów na obu niciach biegnie pozornie w odwrotne strony 3.w drugim cyklu reakcji PCR powstają niespecyficzne łańcuchy których ilość przyrasta w kolejnych cyklach 4.w trzecim i następnych cyklach PCR tworzy specyficzne łańcuchy
Temperatura przyłączania starterów:a)punkt wyjscuia ,tem.dysocjacji dupleksu,starter -matryca oznaczona jako temp.topnienia Tm b)najlepsze rezultaty,startery,których Tm jest równa lub wyższa niż 54 C. c)starter krótszy niż 25 nukleotydów-Tm oblicza się z :Tm=4(G+C)+2(A+T)
MARKER- to wyznacznik ,dowolna ,genetycznie kontrolowana cecha fenotypowa lub dowolna różnica genetyczna wykorzystywana dla ujawnienia polimorfizmu osobniczego. Rodzaje markerów: morfologiczne(cechy fenotypowe,których ekspresja umożliwia ocenę sposobu dziedziczenia)cytologiczne(bazujące na ober.aberacji chromosomowych w genomie danego org.)inoenzymatyczne(markery białek strukturalnych oraz b.enzymatycznych) molekularne(ujawniające zmienność sekwencji nukleotydowej)
Markery oparte na hybrydyzacji DNA (RFLP-polimorfizm dł. fragmentów restrykcyjnych)1.trawoienie DNA enzymami restrykcyjnymi 2.podanie produktów trawienia rozkładowi na zelu agarozowym 3.transfer rozdzielonych frag.DNA na membranę a nast. hybrydyzacja DNA ze specyf.sondą.Markery bazujące na reak.PCR (RAPD) Markery bazujące na r.PCR i trawieniu restrykcyj.(AFLP)
Kraje z GMO: SA,Argentyna ,Kanada,Chiny,poziżej 0,1 mln ha-Austria,Hiszpania,Indie,Niemcy,Kolumbia.
Etapy uzyskiwania GMO przygotowanie DNA ,wprowadzenie DNA, integracja do genomu, selekcja transformantów, odtwarzanie organizmu.
ZASADA DZIAŁANIA BIOREAKT - zagwarantowanie optimum warunków wzrostu i rozwoju komórką somatycznym w kierunku zainicjowania embriogenezy somatycznej poprzez regulację i kontrolę wewnętrzną czynników fizyko - chemicznych. Zastosowanie: - do produkcji metabolitów wtórnych, - do biotransformacji egzogennych prekursorów w bardzo wartościowe, bądź pożądane produkty. Typy reakcji biotransformacji: - utlenianie, redukcja, - hydroliza, - rozszczepienie wiązania C-C, - kondensacja, - izomeryzacja Materiał stosowany: - izolowane enzymy, - zawiesiny komórkowe, agregaty komórek, - immobilizowane( unieruchamiane) enzymy i komórki Lokalizacja procesu biotransf: - wytrząsanie kolby, - bioreaktory Korzyści biotransf: - wysoka wydajność- duża czystość produktu reakcji, - wysoka specyficzność reakcji, - możliwość zajścia reakcji w miejscach mało reaktywnych, - otrzymanie dużej ilości produktów występujących w małych ilościach w roślinie, Ze względu na sposób napowietrzania bioreaktora dzielimy na: a)bioreaktory zaopatrzone w mieszadła magnetyczne ( typu rotacyjne bębny, wirujące filtry) b)bioreaktory do których powietrze jest wtłaczane często pod ciśnieniem, poprzez system membran umieszczonych w dolnej strefie urządzenia c)bioreaktory z równomiernym wprowadzaniem powietrza od góry d)zwykłe napowietrzanie
Rozmnażanie wegetatywne in vitro: 1.Powstanie zarodków somatycznych kulturach tkanek i organów 2.Różnicowanie pąków przybyszowych w kulturach kalusa 3.Różnicow pąków przybysz. bez pośrednictwa tkanki kalusowej 4. Rozwój pąków bocznych w kulturze merystemów wierzchołkowych 5.Rozwój pąków bocznych w kulturze fragmentów pędów i innych organów 6. Kultury primordiów pędowych
BANKI GENÓW- Przechowywanie materiału roślinnego
Krótkoterminowe przechowywanie materiału roślinnego w stosunkowo niskiej temp. Ok. 4°C, przy niskim natężeniu światła i na ubogich pożywkach. Długoterminowo-- w temp. 70°C (zamrażanie przemian metabolicznych, chociaż istnieje niebezpieczeństwo powolnego utleniania tłuszczów oraz wzrost ilości mikrokryształów lodu w komórkach - w temp. -196°C (temp. Ciekłego azotu) komórki przez wiele lat nie tracą żywotności
PRZEBIEG MIKROROZMNAŻANIA: I FAZA:1.wybór rośliny matecznej, pobranie organu, dobór pożywki 2.stabilizacja kultury- uzyskanie zdolnego do regeneracji eksplantantu II FAZA: szereg pasaży tkanki kalusowej, paków przybyszowych, zarodków, wierzchołków, pędów - na świeża pożywkę III FAZA: -ukorzenienie eksplantatów -przygotowanie do wysadzenia w pobliżu lub do gruntu -przywrócenie autotroficzności -aklimatyzacja. Z chwila wysadzenia do gruntu proces mikrorozmnażania jest zakończony
Przechowywanie komórek in vitro w bankach genów (zamrażanie) Proces wieloetapowy, który obejmuje etapy:
1.wzrost wstępny: kultury prowadzi się w pożywkach o obniżonym potencjale chemiczny, wody oraz przy niskiej zawartości azotu (komórki są małe i słabo zwakuolizowane) 2.krioprotekcja (krioprezerwacja):przed zamrożeniem usuwa się nadmiar wody z komórek i przestrzeni międzykomórkowych. 3.zamrażaniea- a)zamrażanie metodą konwencjonalną -zamrażanie wstępne (0-40°C) -zamrażanie trwałe w ciekłym azocie b) metoda odwodnienia -struktury roślinne ulegają odwodnieniu (dehydratacji) w temp. pokojowej -zamrażanie w ciekłym azocie
c) metoda nitryfikacji -umieszczenie tkanki w silnie stężonym roztworze krioprotektantów (odciąganie wody do przestrzeni międzykomórkowych i do roztworu) -zamrażanie w ciekłym azocie 4.przechowywanie właściwe (-196°C) 5.odmrażanie 6.przywrócenie właściwego tempa wzrostu komórek
KULTURY PROTOPLASTÓW: (protoplast to komórka roślinna pozbawiona ściany komórkowej) a)stanowią unikalną populację jednokomórkowych jednostek odizolowanych od siebie. b)każdy zastosowany czynnik eksperymentalny dociera do wszystkich komórek jednakowo tj. w tym samym czasie i z jednakową częstotliwością. c)protoplasty są bardzo przydatne w badaniach czynników indukujących morfogenezę oraz badaniach mutacyjnych
Wykorzystanie protoplastów a) Jako system jednokom. pozbawiony ścian komórkowych i zdolny do ich odtwarzania, protoplasty stanowią doskonały model doświadczalny służący do badania szeregu procesów przebiegających na poziomie b) bosyntezy ścian komórkowych c)badania właściwości plazmolemy, składu błon, ładunku receptorów błonowych, mechanizmu aktywnego, pobierania i transportu związków drobnocząsteczkowych d) funkcjonowanie organelli e) badanie wpływu patogenów na roślinę f) źródła pozyskania mieszańców somatycznych g)doskonały materiał do biotransformacji
Pozyskiwanie protoplastów: a)fragment tkanki (np. Liść), podajemy sterylizacji oraz usuwamy epidermę b)skrawki umieszcza się w mieszaninie enzymów macerujących ścianę komórkową c)degradacja dwuetapowa: -najpierw działają enzymy peptyno- a następnie celulityczne d)degradacja jednoetapowa: - stosuje się mieszaninę różnych enzymów o aktywności totalnie degradującej ściany.W zależności od zastosowania stabilizatora frakcję protoplastów zbiera się w osadzie lub na powierzchni płynu.Ostatecznie protoplasty poddaje się ocenie morfologicznej i jakościowej
Embriogeneza somatyczna w bioreaktorach na przykładzie poinsecji Etapy: * Faza proembriogenna a)kultura wstępna- eksplantant (merystem wierzchołkowy) pobrany z rośliny rosnącej w szklarni umieszczony na pożywce zestalonej agarem indukującej kalusowanie. Po 2-3 tygodniach kalus przenosi się na pożywkę płynną o tym samym składzie i umieszcza się na wytrząsarce b) pasażowanie- po kolejnych 3 tyg agregaty komórek filtruje się a większe skupiska komórek osadzone na sitach przenosi ponownie na pożywkę zestaloną agarem, celem wyprodukowania tzw „ wtórnych kalusów” mających zdolność do zarodnikowania klonalnego c) pozyskiwanie inokulum wyjściowego - po 2 tyg szybko rosnącą masę poddaję się filtrowaniu na sitach i uzupełnia w 2\3 świeżą pożywką, otrzymana zawiesina stanowi suspensję wyjściową dla bioreaktora * Kultury w bioreaktorach - pożywka płynna . *Konwersa embrionów w rośliny -zarodki usuwa się z bioreaktorów, odsącza się na sita i umieszcza na szalkach Petriego na pożywce zestalonej pozbawionej auksyn- MS +0,05 mg BAP -po 3 tyg. normalnie rozwijające się zarodki izolowane są od form dewiacyjnych i kalusujących -prawidłowo rozwijające się zarodki ponownie się umieszcza na pożywce o tym samym składzie i po 1-2 tyg zarodki kiełkują wytwarzając długi hypokotyl charakterystyczny dla poinsecji -po osiągnięciu 20 -25 mm eksplantaty przenosi sie do szklarni
1.Metody transformacji genetycznej
wektorowe , bakterie z rodzaju Rhizobium- Agrobaterium fumefaciens plazmid Ti oraz Agrobacterium rhizogenes , plazmid Ri System Agrobacterium wykorzystuje się do roślin 2-liściennych
bezwektorowe , makroiniekcja, mikroiniekcja, elektroporacja, mikrowstrzeliwanie- wykorzystuje się do wprowadzenia konstruktów DNA u roślin 1-liściennych wprowadzone geny: nie ulęgają ekspresji, bardzo słaba ekspresja zanika w kolejnych pokoleniach bo
„wyciszenie genów”- poznano powierzchownie,
przypadkowe miejsce integracji obcych genów w transkrypcyjnie nieaktywne obszary genomu wyklucza z reguły możliwość transkrypcji (rejony chromosomów zwane heterochromatyną) modyfikacja obcego DNA przez metylacje, której ulega cytozyna, prowadzi to do zablokowania transkrypcji
trandezaktywacja ( kosupresja) polega na wyciszaniu transkrypcji genu homologicznego za pomoca transformacji
2.Enzymy restrykcyjne chronią przed wnikaniem obcego materiału genetycznego i przyłączanie się do genowemu bakterii .W zależności od osi symetrii enzymy restrykcyjne
wytwarzają lepkie lub tępe końce.
Można to przedstawic graficzne
3 porównaj PCR ilościowy i jakościowy
Te 2 metody służą do badania dwóch różnych właściwości danego DNA
-ilościowy tworzy się wiele kopi DNA jak wyjściowe DNA
-jakościowy pokoleji dodawane są nukleotydy i przestają być dodawane tam gdzie jest błąd np. mutacja
4 elektroforeza metoda rozdziału np. białek lub kwasów nukleinowych, w polu elektrycznym
5 bakterie agrobacterium tumefaciens co robi
-transformacja pośrednia, metoda wprowadzania obcych genów, przydatna dla roślin dwuliściennych
6 etapy aklimatyzacji roślin z kultur in vitro mikrorozmnażanie
I FAZA: 1.wybór rośliny matecznej, pobranie organu, dobór pożywki 2.stabilizacja kultury- uzyskanie zdolnego do regeneracji eksplantantu (pierwsze przyrosty tkanki kalusowej, rozwój pąków, pędów)
II FAZA: szereg pasaży tkanki kalusowej, paków przybyszowych, zarodków, wierzchołków, pędów - na świeża pożywkę
III FAZA: -ukorzenienie eksplantatów -przygotowanie do wysadzenia w pobliżu lub do gruntu przywrócenie autotroficzności -aklimatyzacja. Z chwila wysadzenia do gruntu proces mikrorozmnażania jest zakończon
7. Rodzaje trnsformacjii przykłady roślin zmienionych genetycznie, które zyskały odporność na szkodniki i choroby.
- transformacja wektorowa (pośrednia) 2 liścienne za pośrednictwem Agrobacterium turnefaciens
-transformacja bezwektorowa (bezpośrednia) 1- 2 liścienne mikrowstrzeliwanie
8.Wyjasnić :
organogeneza bezpośrednia - pierwotny eksplantat -(roślina) organ - pierwotny eksplantat- zarodek somatyczny-organ (roślina)
organogeneza pośrednia - - pierwotny eksplantat- zarodek somatyczny-organ (roślina)
10.Embriogeneza somatyczna wyjaśnić pojecie
jest procesem biologicznym, podczas którego formują się zarodki z komórek wegetatywnych, wyzwolenie potencjału do tworzenia się zarodka w pojedynczej kom lub ich grupie nazywane jest indukcja embriogeniczności
Zarodek somatyczny(klonalny) różni się od zarodka zygotycznego tym ze zarodki mają wyraźne zaznaczoną biegunową strukturę typu pęd- korzeń. Efektem końcowym embriogenezy somatycznej jest kompletna roślina z wykształconym jednym liscieniem(1-liścienne) lub dwoma liścieniami( 2-liścienne), a także epikotylem i korzonkiem zarodnikowym
Zarodek somatyczny podobny jest do zarodka zygotycznego w tym ze poszczególne stadia rozwoju zarodków( globularne, serca) sa podobne lub wręcz identyczne
11.Sztuczne nasiona stanowią:
*pozbawione otoczki zarodki somatyczne poddane procedurze wysuszenia
*otoczkowanie zarodków poddane desykacji
*uwodnienie zarodki ( merystemy wierzchołkowe) otoczone kapsułą z żelu
*uwodnione zarodki zanurzone w płynnym żelu
Najczęściej stosowna w produkcji sztucznych nasion okrywa nasiena stanowi...... lub....substancja używana do stożkowania
12 biotransformacja ( etapy, rodzaje)
Reakcje biotransformacji w różnych kulturach zawiesinowych. Zastosowanie: - do produkcji metabolitów wtórnych, - do biotransformacji egzogennych prekursorów w bardzo wartościowe, bądź pożądane produkty.
Typy reakcji biotransform - utlenianie, redukcja, - hydroliza, - rozszczepienie wiązania C-C, - kondensacja, - izomeryzacja
Substraty: naturalne prekursory, - związki syntetyczne( ksenobiotyki), zw obce roślinie Materiał stosowany: - izolowane enzymy, - zawiesiny komórkowe, agregaty komórek, - immobilizowane( unieruchamiane) enzymy i komórki
Lokalizacja procesu biotransf: - wytrząsanie kolby, - bioreaktory
Daneilościowe: - na swiecie jest ok. 137 gat roślin leczniczych i aromatycznych wykorzystywanych do produkcji matabolitów wtórnych lub do biotransformacji prekursorów, - w Polsce tylko ok. 40 gat roślin ( zostało przebadanych)
Korzyści biotransf: - wysoka wydajność( często bliska 100%), - duża czystość produktu reakcji, - wysoka specyficzność reakcji, - możliwość zajścia reakcji w miejscach mało reaktywnych, - otrzymanie dużej ilości produktów występujących w małych ilościach w roślinie, - otrzymanie produktów o zwiększonej aktywności fermakologicznej lub zmniejszonej toksyczności
8 protoplasty ( otrzymywanie, wykorzystanie )
13 Wymień metody rozmnażania in-vitro
-Powstanie zarodków somatycznych kulturach tkanek i organów -Różnicowanie pąków przybyszowych w kulturach kalusa -Różnicowanie pąków przybysz. bez pośrednictwa tkanki kalusowej-Rozwój pąków bocznych w kulturze merystemów wierzchołkowych -Rozwój pąków bocznych w kulturze fragmentów pędów i innych organów -Kultury primordiów pędowych.
14 Co to są kultury protoplastów, jak je pozyskujemy i do czego wykorzystujemy?
Kultury protoplastów stanowią unikalną populację jednokomórkowych jednostek odizolowanych od siebie, pozbawionych ść. kom. I zdolnych do ich odtworzenia.
Pozyskiwania: - fragment tkanki podajemy sterylizacji oraz usuwamy epidermę - maceracja ść. kom. (jedno lub dwu etapowa) - dodajemy stabilizatory osmotyczne ( o charakterze jonowym i niejonowym) - mieszaninę filtruje oraz wirujemy - zebranie frakcji protoplastów -przemywa kilkakrotnie roztworem stabilizatorów osmotycznych lub pożywką - ostatecznie protoplasty poddaje się ocenie morfologicznej i jakościowej
Wykorzystanie: - badania nad bosyntezą ścian komórkowych - badania właściwości plazmolemy, składu błon itp. - funkcjonowanie organelli -badanie wpływu patogenów na roślinę -źródła pozyskania mieszańców somatycznych - doskonały materiał do biotransformacji - adania nad wpływ hormonów na morfogeneze - badania czynników wpływających stymulująco bądź hamująco na podstawowe funkcje
15 Bioreaktor. eksplantat, organogeneza pośrednia.
Bioreaktor - użadenie służace da zapewnienia optymalnych warunków wzrostu i rozwoju kom. somatycznym w kierunku zainicjowania embiogenezy somatycznej.
Eksplantat - Fragment rośliny umieszczony na pożywce w celu uzyskania tk. kalusowej, rozmnożenia rośliny lub zregenerowania jej.
Organogeneza pośrednia - odtwazanie organu lub całej rośliny nie bezposrednio z eksplantatu, ale za pośrednicstwem tk. kalusowej powstałej na eksplantacie.
16. Metody zabezpieczania genomu i jego reaktywacja.
Aby moc przechowywać genom należy posiadać miniumu jedna komórkę zawierająca pożądany mat. gen. Które uzyskuje się hodując na zubożonej pożywce, aby otrzymać małe i słabo zwakuolizowane komórki, które następnie poddaje się krioprotekcji, poczym zamraża. Przechowuje się je w temp. -196 C (temp. Ciekłego azotu) gdyż w takich warunkach przez wiele lat kom. nie traci żywotności. Aby je reaktywować należy je rozmrozić i zapewnić warunki przywracające właściwe tępo wzrostu.
17. Sztuczne nasiona - to zarodki somatyczne poddane procesowi dehydratacji a nastepnie otoczkowane
pozbawione otoczki zarodki somatyczne poddane procedurze wysuszenia *otoczkowanie zarodków poddane desykacji *uwodnienie zarodki ( merystemy wierzchołkowe) otoczone kapsułą z żelu *uwodnione zarodki zanurzone w płynnym żelu
Powstawanie
roślina macierzysta, *eksplantat *indukcja i proliferacja kalusa embriogennego *namnożenie komórek w zawiesinie embriogennej. * synchronizacja stadiów embiogenezy i hartowanie zarodków. *filtrowanie *suszenie *otoczkowanie *wysiew nasion in-vivo lub in-vitro
18 Przykłady roślin transgenicznych: - kukurydza Bt., bawełna Bt, soja, rzepak, ziemniaki, pomidor, tytoń
19 Rodzaje transgenezy i jej efektywność (chyba )
a) wektorowe - inaczej pośrednie, wprowadzanie mat. gen. za pomocą plazmidów, efektywnośc jest wysoka, ale metoda ta sprawdza się głównie u roślin jedno liściennych.
b) bezwektorowa (bezpośrednia) - mat. gen. wprowadzany jest za pomocą mikrowstrzeliwania, metoda wprawdzie jest skuteczna dla jedno i dwu liściennych, ale z racji częstych uszkodzeń mechanicznych czy nadmiaru kopi jest mało efektywna.
20 Embriogeneza somatyczna na przykładzie poinsecji. (to jest gwiazda betlejemska)
* Faza proembriogenna ( inicjacja embriogenezy)
-kultura wstępna- eksplantant (merystem wierzchołkowy) pobrany z rośliny rosnącej w szklarni umieszczony na pożywce zestalonej agarem indukującej kalusowanie. Po 2-3 tygodniach kalus przenosi się na pożywkę płynną o tym samym składzie i umieszcza się na wytrząsarce.
-pasażowanie- po kolejnych 3 tyg agregaty komórek filtruje się a większe skupiska komórek osadzone na sitach przenosi ponownie na pożywkę zestaloną agarem, celem wyprodukowania tzw „ wtórnych kalusów” mających zdolność do zarodnikowania klonalnego
-pozyskiwanie inokulum wyjściowego - po 2 tyg szybko rosnącą masę poddaję się filtrowaniu na sitach i uzupełnia w 2\3 swieżą pożywką, otrzymana zawiesina stanowi suspensję wyjściową dla bioreaktora
* Kultury w bioreaktorach - pożywka płynna ( ściśle kontrolowane warunki wewnętrzne). Zarodki stopniowo osiągaja stadium globuli i dalej stadium serca. Barwa suspensji zmienia się z białawej na zielonkawo- brązową
*Konwersa embrionów w rośliny
-zarodki usuwa się z bioreaktorów, odsącza się na sita i umieszcza na szalkach Petriego na pożywce zestalonej pozbawionej auksyn -po 3 tyg. normalnie rozwijające się zarodki izolowane są od form dewiacyjnych i kalusujących -prawidłowo rozwijające się zarodki ponownie się umieszcza na pożywce o tym samym składzie i po 1-2 tyg zarodki kiełkują wytwarzając długi hypokotyl charakterystyczny dla poinsecji -po osiągnięciu 20 -25 mm eksplantaty przenosi sie do szklarni ( przeżywalność ok 90 %)
21. Hybrydyzacja somatyczna - polega na zlewaniu się protoplastów z czego powstaje sekcja heterokarjocytów (nowe kombinacje genetyczne) z których odtwarzamy całe rośliny o nowych właściwościach.
22. Biotransformacja - to proces w wyniku którego dochodzi się do modyfikacji grup funkcyjnych związków organicznych przez żywe kom. lub wyizolowane z nich enzymy.
23. Merystemy wierzchołkowe (primordiów pędowych)
1. Zakładamy je izolując z pąków wierzchołkowych merystemy z 3 zawiązkami( primordiami) liściowymi , umieszczamy je na pożywce płynnej, ważne jest: - skład pożywki(NAA•BAP), - cyrkulacja, - objętość płynu i tkanki, - temp, - intensywność naświetlenia, - częstotliwość
2. Po wstępnym okresie stabilizacji- intensywne namnażanie primordiów pedowych, które tworzą zielone eulorofilowe agregaty
3. Po wyłożeniu ich na pożywkę zestaloną z dodatkiem auksyny→ ukorzenianie→ regeneracja rośliny
Metoda znalazła zastosowanie w masowej produkcji wielu gat roślin 1 i 2 - liściennych oraz drzewiastych, ma bardzo wysoki współczynnik namnażania, porównywalny do embriogenezy somatycznej.
23. Etapy klonowania in-vitro
I FAZA: 1.wybór rośliny matecznej, pobranie organu, dobór pożywki 2.stabilizacja kultury- uzyskanie zdolnego do regeneracji eksplantantu (pierwsze przyrosty tkanki kalusowej, rozwój pąków, pędów)
II FAZA: szereg pasaży tkanki kalusowej, paków przybyszowych, zarodków, wierzchołków, pędów - na świeża pożywkę
III FAZA:
-ukorzenienie eksplantatów -przygotowanie do wysadzenia w pobliżu lub do gruntu -przywrócenie autotroficzności -aklimatyzacja. Z chwila wysadzenia do gruntu proces mikrorozmnażan
24 Wyjaśnij:
Kallus
-roslinna tkanka regeneracyjna zabliźniająca zranienia glównie roślin drzewiastych powstaje w trakcie ukorzeniania sadzonek gojenia ran zrastania tkanek w miejscu szczepienia
Totipotencja
-jest to zdolność pojedynczej komórki do odtwarzania całego organizmu dzięki obecności w komórkach pełnej informacji genetycznej
Ogranizmy transgeniczne
-organizmy poddane transformacji tzw.posiadajace zmodyfikowany genom.
Powstały z takiej komórki która włącza do swego genomu fragment DNA skonstruowany za pomocą inżynierii genetycznej.Fragment ten może zawierać dowolna informacje i może zostać włączony w prawie każde miejsce genomu
Biotransformacja
-proces w wyniku którego dochodzi do modyfikacji grup funkcyjnych związków organicznych przez żywe komórki lub izolowanie z nich enzymy.
.Mikrowstrzeliwanie
- metoda transformacji polegająca na wprowadzeniu z bardzo dużą prędkością rzędu kilkuset metrów/sekundę do komórek metali pokrytych DNA. Prędkość tę uzyskuje się w specjalnie skonstruowanych akceleratorach, czynnikiem przyśpieszającym ruch cząsteczek metali jest proch strzelniczy lub obecnie hel
26 metody bezwektorowe
makroiniekcja, mikroiniekcja, elektroporacja, mikrowstrzeliwanie- wykorzystuje się do wprowadzenia konstruktów DNA u roślin 1-liściennych
27 Marker
-wyznacznik, dowolna, genetycznie kontrolowana cecha fenotypowa lub też dowolna różnica genetyczna wykorzystywana dla ujawnienia polimorfizmu osobniczego
28 Polimorfizm- całokształt różnic występujących między poszczególnymi gatunkami, odmianami, osobnikami, a także komórkami organizmu, które potencjalnie mogą być ujawniane za pomocą odpowiednio dobranego systemu markerowego.
29 Rodzaje markerów molekularnych
-izoenzymy (polimorfizm białek, kodominowanie)
-markery DNA (polimorfizm DNA) RFLP,MAAP, AFLP, STMS, SCAR (STS)
- RFLP badanie polimorfizmu
30.Rodzaje metod in vitro
-Powstanie zarodków somatycznych kulturach tkanek i organów
-Różnicowanie pąków przybyszowych w kulturach kalusa
-Różnicow pąków przybysz. bez pośrednictwa tkanki kalusowej
-Rozwój pąków bocznych w kulturze merystemów wierzchołkowych -
-Rozwój pąków bocznych w kulturze fragmentów pędów i innych organów
-Kultury primordiów pędowych
31 Kultury protoplastów - co to protoplasty, wykorzystanie, pozyskiwanie
Pozyskiwanie protoplastów
-fragment tkanki (np. Liść), podajemy sterylizacji oraz usuwamy epidermę
-skrawki umieszcza się w mieszaninie enzymów macerujących ścianę komórkową
-degradacja dwuetapowa: -najpierw działają enzymy peptyno- a następnie celulityczne
-degradacja jednoetapowa: - stosuje się mieszaninę różnych enzymów o aktywności totalnie degradującej ściany
-ważny dodatek stabilizatorów osmotycznych ( o charakterze jonowym i niejonowym)
-mieszaninę filtruje się przez sita
-delikatnie wiruje się w zależności od zastosowania stabilizatora frakcję protoplastów zbiera się w osadzie lub na powierzchni płynu
-przemywa kilkakrotnie roztworem stabilizatorów osmotycznych lub pożywką
ostatecznie protoplasty poddaje się ocenie morfologicznej i jakościowej
Wykorzystanie protoplastów:
Jako system jednokom. pozbawiony ścian komórkowych i zdolny do ich odtwarzania, protoplasty stanowią doskonały model doświadczalny służący do badania szeregu procesów przebiegających na poziomie: bosyntezy ścian komórkowych - badania właściwości plazmolemmy, składu błon, ładunku receptorów błonowych, mechanizmu aktywnego, pobierania i transportu związków drobnocząsteczkowych -funkcjonowanie organelli ,badanie wpływu patogenów na roślinę ,źródła pozyskania mieszańców somatycznych ,doskonały materiał do biotransformacji. wpływ hormonów na morfogeneze ,badania czynników wpływających stymulująco bądź hamująco na podstawowe funkcje metaboliczne
Protoplast:
-stanowią unikalną populację jednokomórkowych jednostek odizolowanych od siebie.
-każdy zastosowany czynnik eksperymentalny dociera do wszystkich komórek jednakowo tj. w tym samym czasie i z jednakową częstotliwością.
- protoplasty są bardzo przydatne w badaniach czynników indukujących morfogenezę oraz badaniach mutacyjnych
32 Co to bioreaktor, do czego stosowany, podział ze wzgl. na napowietrzanie
Podział bioreak ze wzgledu na system napowietrzania pożywki:
- bioreaktor zaopatrzone w mieszadła magnetyczne typu rotacyjne bębny, wirujące filtry,
- bioreaktor w których powietrze jest wtłaczane często pod ciśnieniem poprzez system membran umieszczonych w dolnej strefie urządzenia
- zwykłe napowietrzanie, - dodatkowe kolumny( bąbelkowe napowietrzanie), - poprzez systemy sylikonowych lub polipropylenowych węży zaopatrzonych w liczne perforacje i mikropory,
- bioreaktor z równomiernym rozprowadzeniem powietrza z góry bez mieszania pożywki,
- podświetlane przewody rozprowadzające tlen
Zasada działania bioreaktorów - zagwarantowanie optimum warunków wzrostu i rozwoju komórką somatycznym w kierunku zainicjowania embriogenezy somatycznej poprzez regulację i kontrolę wewnętrzną czynników fizyko - chemicznych
33 Co to banki genów, w jakich warunkach przechowujemy
Bank genów jest to miejsce przechowywania komórki tkanki zmodyfikowanej genetycznie , haloidy , rośliny użytkowe rzadkie lub ginące gatunki kolekcje ogrodów botanicznych lub arboretów , roślin transgenicznych przy pomocy procesów długo lub krotko terminowych
Przechowywanie materiału roślinnego
Krótkoterminowe przechowywanie materiału roślinnego w stosunkowo niskiej temp. Ok. 4°C, przy niskim natężeniu światła i na ubogich pożywkach.
Długoterminowo-
- w temp. 70°C (zamrażanie przemian metabolicznych, chociaż istnieje niebezpieczeństwo powolnego utleniania tłuszczów oraz wzrost ilości mikrokryształów lodu w komórkach
- w temp. ?196°C (temp. Ciekłego azotu) komórki przez wiele lat nie tracą żywotności
Przechowywanie komórek in vitro w bankach genów (zamrażanie)
-.wzrost wstępny
-krioprotekcja (krioprezerwacja)
-.zamrażanie
-przechowywanie właściwe (?196°C)
-odmrażanie
-przywrócenie właściwego tempa wzrostu komórek
1.Metody transformacji genetycznej
2.Enzymy restrykcyjne chronią przed
3 porównaj PCR ilościowy i jakościowy
4 elektroforeza
5 bakterie agrobacterium tumefaciens co robi
6 etapy aklimatyzacji roślin z kultur in vitro mikrorozmnażanie
7. Rodzaje trnsformacjii przykłady roślin zmienionych genetycznie, które zyskały
8.Wyjasnić
10.Embriogeneza somatyczna wyjaśnić pojecie
11.Sztuczne nasiona stanowią
12 biotransformacja ( etapy, rodzaje)
13 Wymień metody rozmnażania in-vitro
14 Co to są kultury protoplastów, jak je pozyskujemy i do czego wykorzystujemy?
15 Bioreaktor. eksplantat, organogeneza pośrednia.
16. Metody zabezpieczania genomu i jego reaktywacja.
17. Sztuczne nasiona
18 Przykłady roślin transgenicznych
19 Rodzaje transgenezy i jej efektywność
20 Embriogeneza somatyczna na przykładzie poinsecji. (to jest gwiazda betlejemska)
21. Hybrydyzacja somatyczna
22. Biotransformacja
23. Merystemy wierzchołkowe
23. Etapy klonowania in-vitro
24 Wyjaśnij:
26 metody bezwektorowe
27 Marker
28 Polimorfizm
29 Rodzaje markerów molekularnych
30.Rodzaje metod in vitro
31 Kultury protoplastów - co to protoplasty, wykorzystanie, pozyskiwanie
32 Co to bioreaktor, do czego stosowany, podział ze wzgl. na napowietrzanie
przechowujemy
33 Co to banki genów, w jakich warunkach
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
II semestr - odpowiedzi XXL , ZAGADNiTNIA DO KOLOKW1UM Z SOCJOLOGII ORGANIZACJI I KIEROWANIA - studi
I semestr - odpowiedzi, XXL , ZAGADNIENIA DO KOLOKWIUM Z SOCJOLOGII ORGANIZACJI I KIEROWANIA - studi
BIOCHEMIA- pojęcia, Studia, II rok, II rok, III semestr, Biochemia
Biochemia 3 poprawiona, Studia, II rok, II rok, III semestr, Biochemia
BIOCHEMIA2(1), Studia, II rok, II rok, III semestr, Biochemia
Biochemia2, Studia, II rok, II rok, III semestr, Biochemia
BIOCHEMIA(2)s, Studia, II rok, II rok, III semestr, Biochemia
bio 1 kolos, studia, Maja, Studia, II rok, III semestr, Biochemia
Anabolizm, Studia, II rok, II rok, III semestr, Biochemia
BIOCHEMIA- pojęcia, Studia, II rok, II rok, III semestr, Biochemia
więcej podobnych podstron