Ćwiczenia I - Mikroskopy - Ogólna budowa komórki roślinnej. Różnicowanie, Programowana śmierć komórki roślinnej (PCD).

Mikroskop fluorescencyjny to mikroskop świetlny używany w badaniach substancji organicznych i nieorganicznych, którego działanie oparte jest na zjawisku fluorescencji i fosforescencji, zamiast, lub razem ze zjawiskami odbicia i absorpcji. Fluoroscencja próbki może być pochodzenia naturalnego (np. fluoroscencja chlorofilu) lub być wynikiem dołączenia do elementów obserwowanej próbki fluoroforów, czyli substancji chemicznych, które fluoryzują po wzbudzeniu światłem o określonej długości.

Mikroskop polaryzacyjny - mikroskop ten posiada między okularem i źródłem światła dwa filtry polaryzacyjne. Jeden z nich jest nazywany polaryzatorem i znajduje się między źródłem światła i analizowaną próbką, a drugi jest nazywany analizatorem i znajduje się między próbką a tubusem. Polaryzator i analizator przepuszczają tylko tę część światła, która ma ściśle określoną polaryzację. W trakcie obserwacji są one skręcone względem siebie o 90° (są skrzyżowane), co powoduje, że jeśli próbka nie skręca płaszczyzny polaryzacji światła, to nie może ono przejść przez cały układ. Jeśli próbka jest aktywna optycznie, to wówczas przynajmniej część światła przechodzi przez analizator i dociera do oka obserwatora.

Mikroskop konfokalny (laserowy skaningowy) - nowoczesna odmiana mikroskopu fluorescencyjnego, w którym źródłem światła jest laser. Mikroskop ten umożliwia dokonywanie tzw. przekrojów optycznych preparatu, analizuje bowiem światło pochodzące z jednej jego płaszczyzny, eliminując światło docierające z warstw położonych wyżej lub niżej. Różnica między zwykłymi mikroskopami nawet fluorescencyjnymi polega na tym, że dzięki mikroskopowi konfokalnemu otrzymujemy obraz o lepszej rozdzielczości i kontraście. Dzięki tej metodzie możliwa jest analiza przekrojów optycznych w czasie ciągłym położonych na powierzchni lub w głębi preparatu.

Mikroskop kontrastu fazowego:

- badania przyżyciowe

- świetlny

- przesłona pierścieniowa i płytka fazowa

- przepuszcza światło na zasadzie interferencji

Charakterystyka ogólna komórki roślinnej:

• W komórkach roślinnych miozyna występuje w niewielkich ilościach; stosunkowo łatwo można ją zidentyfikować w olbrzymich komórkach ramienic.

• Komórki roślinne nie są samodzielne (bo rosną w układzie).

• Ściany komórkowe sąsiednich komórek są połączone, tworzą system zwany apoplastem (system połączonych blaszkami ścian komórkowych, umożliwiający szybki transport wody, hormonów i transmiterów pomiędzy protoplastami komórek).

• Ściana komórkowa stanowi środowisko zewnętrzne - podobne do ECM (przestrzeń / macierz zewnątrzkomórkowa). Szkielet ściany łączy się z mikrofilamentami wewnątrz protoplastu.

• W ścianach komórkowych występują różnorakie enzymy (np. enzymy lignifikacji) oraz wypustki białkowe (receptory); procesy zachodzące w ścianie mogą mieć wpływ na metabolizm komórki.

• Rośliny wyższe posiadają plastydy typu zielenicowego (zawierające chlorofil typu A, B oraz karotenoidy). Materiałem zapasowym jest skrobia magazynowana w amyloplastach.

• Pomimo, że pierwotniaki uważane są za organizmy jednokomórkowe, u niektórych grup(Apicomplexa) występują pierwotne plastydy.

• Centralne miejsce w komórce zajmuje ogromna wakuola wypełniona wodą; jej zadaniem między innymi jest nadawanie turgoru komórce - wakuola rozpiera komórkę i powoduje jej rozrost przestrzenny ( w przypadku zdegradowania ścian, komórka pęka).

• Jądro komórkowe oddzielone jest od cytoplazmy podwójną błoną (nukleolemmą); system błon wewnętrznych (SER, RER, AG), mitochondria oraz peroksysomy; Wszystkie powyższe struktury są analogiczne do występujących w komórce zwierzęcej.

Immunolokalizacja

• Specyficzność znakowania struktur, związków dzięki reakcji antygen-przeciwciało

• Wyróżnia się:

- pośrednią (bardziej precyzyjna, najpierw przeciwciało pierwotne nie znakowane, następnie na nie przeciwciało wtórne znakowane i łączenie się z nim, następnie przyłącza się antygen)

- bezpośrednią (od razu przeciwciało wtórne, oznakowane)

Plazmoliza - proces tracenia wody w komórce w roztworze hipertonicznym. W wyniku tego następuje obkurczenie cytoplazmy od ścian komórki. Dotyczy ona wyłącznie komórek roślinnych.

* po dodaniu rodanku potasu (KCNS) następuje plazmoliza kątowa

* po dodaniu octanu amonu następuje plazmoliza kapturowa (wypukła)

Determinacja komórki - jest to określenie w co zostanie zróżnicowana komórka merystematyczna, na determinację ma wpływ:

- pochodzenie danej komórki (prokambium => elementy waskularne)

- roślin ważniejsza jest informacja pozycyjna czyli informacja o położeniu danej komórki

- nierównocenny podział komórki (zależność od podziału antyklinarnego i peryklinarnego - w inne struktury zostają przekształcone zależnie od typu podziału)

- o kierunki różnicowania decydują też komórki towarzyszące i ogólny plan budowy (na zewn. okrywające, wewn. np. przewodzące itp.)

- morfogeny - są to czynniki wpływające na różnicowanie, transportowane czynnie lub dyfunduje, komórki pod ich wpływem różnicują się zależnie od stężenia, takimi morfogenami możliwe że są hormony

PCD - jest to programowana śmierć komórki, nie mylić z apoptozą (to jest jeden z rodzajów tego procesu).

• Występuje w komórkach które np. mają funkcjonować jako martwe (sklerenchyma, ksylem) - dochodzi do samotrawienia (lizy protoplastu).

• Towarzyszy komórkom przechodzącym mejoze - 3 mejospory degenerują właśnie w sposób zaprogramowany, tylko 1 z nich zostaje, występuje też w rozwoju zarodkowym, jeśli jest coś niepotrzebne.

• W kwiecie jednopłciowym (żeński + męski) jedna część z nich ulega programowanej śmierci.

GFP -

GUS -

Ćwiczenia II - Cytoszkielet. System błon wewnętrznych. Peroksysomy komórki roślinnej.

Cytoszkielet:

• Do najważniejszych składników cytoplazmatycznych komórki eukariotycznej należy cytoszkielet (jest to zespół włókien białkowych o różnym składnie chemicznym, architekturze oraz funkcji).

• Rozróżniamy trzy rodzaje włókien wchodzących w skład cytoszkieletu (podział ze względu na wielkość):

• mikrotubule (MT) - średnica około 24 nm (budują np. wici i rzęski)

• filamenty pośrednie (IF) - średnica 7 - 10 nm

• mikrofilamenty (MF) - średnica 5 - 8 nm (budują np. mikrokosmki).

• Mikrotubule zbudowane są z tubuliny - białka konserwatywnego genetycznie (wszelkie mutacje genów kodujących tubulinę są letalne). In vitro można dokonać polimeryzacji mikrotubul z podjednostek pochodzących z różnych źródeł. Mikrotubule mogą być stabilne (rzęski, wici) lub dynamiczne (np. wrzeciono podziałowe).

• Filamenty pośrednie mogą być budowane z różnych rodzajów białek (o wspólnej domenie w części α-helikalnej oraz tym samym sposobie polimeryzacji). W wyniku rozpadu filamentów pośrednich, białka podjednostkowe są degradowane (nie są wtórnie wykorzystywane do syntezy filamentów, jak to jest w przypadku heterodimerów tubuliny lub G-aktyny). Aby wytworzyć włókno filamentu pośredniego, białka strukturalne muszą być syntetyzowane od nowa.

• Mikrofilamenty zbudowane są polimerycznie z podjednostek G-aktyny (całe włókno nazywamy F-aktyną). Mikrofilamenty występują bardzo często w towarzystwie cząsteczek miozyny. Jako jedyne filamenty cytoszkieletu są elastyczne. Często łączą się w wiązki. Helikalność włókien aktynowych oznacza możliwość magazynowania energii (ciasny splot dwóch łańcuchów aktynowych - dużo energii; luźny splot - mało energii).

• Sieć tensegralna („bierki połączone gumkami”) to sieć tworzona przez włókna cytoszkieletu, która tworzy trójwymiarową strukturę komórki (błona nie usztywnia komórki!!!). Obecność białek rozciągliwych (F-aktyna) i nierozciągliwych (mikrotubule, filamenty pośrednie) pozwala na wytworzenie tego typu sieci.

• W szkielecie aktynowym mogą występować tzw. nadskręcenia. Jest to sytuacja analogiczna do nadskręceń występujących w kolistych cząsteczkach DNA u bakterii (zwijanie genoforu się w ósemki) - taka sytuacja następuje w wyniku np. wycięcia fragmentu cząsteczki DNA i wklejeniu go po obróceniu o 180°.

Funkcje cytoszkieletu w komórce roślinnej:

• Generowania ruchu cytoplazmy (cykloza).

• Reakcja grawitropijna (rejestracja kierunku działania grawitacji; biorą w tym udział amyloplasty statolitowe oraz mikrofilamenty).

• Ruch organelli typu wici lub rzęsek.

• Ruchy chromosomów wrzeciono kariokinetyczne).

• Powstawanie polarności komórki (co jest ważne u komórek dzielących się, bo wyznacza kierunek podziału).

• Kontrola kierunku podziałów komórkowych (zasada Errery - komórki zawsze dzielą się w miejscu; gdzie przyszła ściana komórkowa będzie miała najmniejszą powierzchnię).

• Kierowanie procesem tworzenia ściany komórkowej.

Mikrofilamenty aktynowe

Białka oddziałujące z aktyną- ARP:

Inhibitory aktynowe- naturalne, produkowane przez grzyby, gąbki i rośliny w odpowiedzi na infekcje (jako broń chemiczna):

1. Latrunkulina-(Gąbki) blokujące podjednostki, uniemożliwia polimeryzację

2. Falloidyna-(grzyby) stabilizuje (usztywnia) MF, zapobiega depolimeryzacji-ważne w preparatyce, badaniach; zatrucia muchomorami sromotnikowymi;

3. Swinholid- fragmentuje MF

4. Cytochalazyna B-(grzyby) blokuje dodatni koniec MF

Reakcja grawitropijna.

• Za reakcję grawitropijną roślin odpowiada cytoszkielet; dzięki niej korzeń główny rośliny rośnie wgłąb ziemi. Odchylenie od pionu rejestrowane jest przez skrobię statolitową.

• Już Darwin zaobserwował skrobię statolitową w komórkach czapeczki korzenia.

• Za reakcję grawitropijną odpowiadają całe komórki (zwane statocytami), a nie skrobia (zmagazynowana w amyloplastach statolitowych).

• Czapeczka korzeniowa pełni zatem rolę receptoru (statocyty ze statolitami); komórki czapeczki należą do jednego klonu (mają wspólne pochodzenie - ta sama komórka pierwotna).

• Sygnał grawitropijny przechodzi od czapeczki do strefy wydłużeniowej korzenia; korzeń skręca, gdy komórki z jednej jego strony wydłużają się szybciej.

• Chwytniki (ryzoidy) ramienic (np. Nitella sp. lub Chara sp.) również wykazują reakcję grawitropijną (więc można je nazwać statocytami). Ryzoid jest komórką o wzroście szczytowym (rośnie tylko wyróżniony fragment ściany). W ryzoidach występują tzw. ciężkie wakuole (wypełnione BaSO₄), które spełniają funkcje statolitów.

• Rolą statolitów jest sedymentacja na powierzchni, która ma nie rosnąć (blokują one dopływ substancji transportowanych w pęcherzykach AG).

• W wyniku zastosowania cytochalazyny B (trucizny mikrofilamentów) można upośledzić lub całkiem zahamować reakcję grawitropijną (doświadczenie to można wykonać np. na czapeczce korzeniowej Lepidium sp. taka sytuacja oznacza oczywiście, że w reakcji grawitropijnej bierze udział szkielet aktynowy (współpracujący ze statolitami).

• Innymi przykładami reakcji grawitropijnej jest wzrost włośników lub łagiewki pyłkowej.

• Zmiana położenia statolitów zmienia stan naprężenia włókienka aktynowego połączonego z plazmalemmą. Stąd właśnie zniszczenie szkieletu aktynowego powoduje osłabienie reakcji grawitropijnej. Zmiana naprężeń błony może wpływać na przepuszczalność kanałów jonowych.

• 
  U mutanta Arabidopsis sp., który nie wytwarza skrobi w amyloplastach reakcja grawitropijna zachodzi pomimo tego, że amyloplasty są lekkie.

• Bramkowanie kanałów jonowych zależy od:

• czynników elektrycznych

• czynników chemicznych

• naprężenia błony (czynników fizycznych)

Czapeczka korzeniowa

• Komórki czapeczki korzeniowej ulegają apoptozie (nie jest to zniszczenie mechaniczne, jak pierwotnie sądzono).

• Wszystkie komórki czapeczki posiadają skrobię statolitową.

• Zaledwie 2-3 komórki w części centralnej czapeczki mają istotny wpływ na reakcję grawitropijną. Pozostałe komórki tylko wzmacniają sygnały.

• Korzenie boczne są niewrażliwe na grawitację (rosną w bok od korzenia głównego). Czynnikiem modyfikującym to zjawisko jest światło. Gdy światła brakuje, korzenie rosną płasko; gdy jest światło - wzrost pod kątem GSA (jest to kąt odpowiedzi grawitropijnej specyficzny dla gatunku).

• W czapeczkach korzeni bocznych amyloplasty statolitowe są skupione w pobliżu jądra komórkowego (a nie na dnie komórki, jak jest to w czapeczce korzenia gównego).

Rola mikrotubul i szkieletu tubulinowego:

• Mikrotubule są najgrubszymi (do 25 nm) włóknami białkowymi; są puste w środku. Jedną miktotubulę tworzy 13 protofilamentów zbudowanych z heterodimerów tubuliny. Heterodimery odkładane są po helisie. Helisa posiada koniec A (+) i D (-).

• Mikrotubule powstają jako struktury polarne (ponieważ polarne są heterodimery: α(-); β(+)).

• Cytoszkielet tubulinowy można stabilizować przy pomocy taxolu (preparat uzyskiwany z cisu; głownie z kory). Taxol blokuje podziały komórkowe, co jest wykorzystywane w leczeniu nowotworów (np. raka piersi).

• Kolchicyna blokuje polimeryzację mikrotubul; dzięki kolchicynie można uzyskać komórki poliploidalne (chromosomy nie rozchodzą się w trakcie podziału). Kolchicyna pochodzi od Colchicum autumnae (ziemowit jesienny; kwiat podobny do krokusa; śmiertelnie trujący; krowy go nie jedzą).

• γ-tubulina to forma tubuliny występująca w MTOC, układająca się w struktury przypominające z wyglądu sprężynkę. γ-tubulina daje początek nowym mikrotubulom.

• Protofilamenty mogą być składane w płaszczyznę, która następnie zwija się w rurkę (sposób częsty w układach wieloelementowych jak dublety w wiciach lub triplety w centriolach). Należy pamiętać, że jedynie zwierzęta i glony (poza krasnorostami) posiadają centriole).

• Mikrotubula określonej długości jest zbudowana ze stale wymieniających się heterodimerów (ciągła polimeryzacja i depolimeryzacja). Mikrotubule mogą ulegać wydłużaniu lub skracaniu.

• Polimeryzacja polega na przyłączaniu heterodimerów związanych z GTP (guanozynotrójfosforan). Na szczycie mikrotubuli znajduje się „czapeczka” GTP; jeśli w pobliżu nie ma nowych heterodimerów do polimeryzacji, mikrotubula traci GTP i zaczyna się rozpad struktury.

• Z powierzchnią mikrotubul oddziałują różnego rodzaju białka z grupy MAP, min. białka motoryczne:

• dyneina (przemieszcza się do końca „-”)

• kinezyna (przemieszcza się do końca „+”)

• Białka motoryczne mogą pełnić funkcje transportowe (np. transportują pęcherzyki AG); podobnie jak miozyna w połączeniu z mikrofilamentami. Układy transportowe działają zawsze poza jądrem komórkowym (aby DNA nie uległo uszkodzeniu; gdy komórka nie miała otoczki jądrowej; transport stanowił zagrożenie dla tożsamości DNA).

• Stabilnym przykładem działalności budulcowej mikrotubul są wici i rzęski. Wić ma strukturę uniwersalną (9 X 2 + 2); szkielet tubulinowy jest spięta neksyną (białko elastyczne - rozciągliwość nawet ośmiokrotna) i otoczony plazmalemmą. Za ruch zginający rdzenia odpowiada dyneina rzęskowa.

• Klejnotka (Euglena) porusza się za pomocą wici, w której mikrotubule składają się teleskopowo dzięki wędrówce haczyków dyneinowych po ich powierzchni (kierunek wędrówki zmienia się okresowo). Zatem dyneina jest bardzo ważnym białkiem biorącym udział w ruchu wici.

• Gamety męskie (nawet tak wysoko uorganizowanych roślin jak sagowce i miłorzęby) są ruchliwe (posiadają wić).

• Geny kodujące ważne dla organizmu białka są konserwatywne ewolucyjnie (niewrażliwe na mutacje; wszelkie mutacje są letalne), gwarantuje to stałość budowy białka (np. tubuliny).

• Dublety mikrotubul występujące obwodowo w szkielecie wici zachodzą na siebie, co umożliwia im ślizganie się (jedna po drugiej) podobnie jak miozyna z aktyną w sarkomerach.

• Wici poruszają się ruchem falistym, a rzęski wahadłowym.

System błon wewnętrznych

• Błona elementarna zewnętrzna (plazmolemma)

• System endomembranowy (GERL)

• Reticulum endoplazmatyczne (ER)

• Diktiosomy (G)

• Pęcherzyki egzo- i endocytowe

• Lizosomy (L)

• Pęcherzyki egzocytowe biorące udział w procesie sekrecji (wydzielania) łączą się z plazmalemmą w momencie wylewania zawartości poza komórkę (powoduje to wzrost powierzchni błony).

• Odwrotną sytuacją jest fagocytoza (i inne formy endocytozy), która powoduje zmniejszenie powierzchni błony poprzez utworzenie pęcherzyka endocytowego.

• Biorąc pod uwagę oba powyższe zjawiska, można stwierdzić, że w pewnym sensie pazmalemma jest składnikiem systemu endomembranowego.

• Kompartymentacja - powstanie pęcherzyków z dwuwarstwy lipidowej (oddzielenie części środowiska poprzez zamknięcie go wewnątrz pęcherzyka).

• System błon wewnętrznych tworzy platformę dla reakcji zachodzących w komórce (tam zachodzi obróbka produkowanych substancji).

• Każdy fragment błony posiada specyficzne markery białkowe (dzięki temu można odróżnić stronę cytoplazmatyczną i cysternową). Wnętrze pęcherzyka (lub strona od cysterny) jest częścią środowiska zewnętrznego - przy egzocytozie ta właśnie strona kontaktuje się ze środowiskiem zewnętrznym.

Fosfolipidy:

• Ze względu na polarność cząsteczek fosfolipidów, hydrofilowe główki skierowane są do środowiska wodnego, a hydrofobowe ogonki skierowane są w stronę tłuszczową (kontakt z ciałem tłuszczowym lub innymi ogonkami fosfolipidów - tworzenie miceli i dwuwarstw).

• Dwuwarstwy lipidowe spontanicznie zamykają się w formę pęcherzyka (liposom).

• Ze względu na hydrofobowy charakter wnętrza błony fosfolipidowej, jest ona nieprzepuszczalną barierą dla polarnych cząsteczek; za transport tych cząsteczek odpowiadają białka tworzące:

• kanały (mogą być otwarte lub zamknięte; gdy są otwarte, następuje transport bierny; płyną tędy substancje, które nie łączą się z białkiem kanałowym)

• przenośniki / transportery (przenoszona cząsteczka łączy się z przenośnikiem - transport aktywny)

Poryny:

• Transmembranowe części białek z grupy poryn mają budowę nie α-helikalną, ale β-kartkową (zwaną β-beczułką; beczułka wypełniona jest wodą).

• Białka te tworzą duże (przepuszczające cząsteczki do 600 D), niespecyficzne pory w błonach zewnętrznych bakterii, mitochondriów i plastydów.

Akwaporyny:

• Specjalnym rodzajem kanałów membranowych są akwaporyny (AQPs). Są to kanały wodne ułatwiające bardzo szybki wpływ lub wypływ wody np. w erytrocytach (lub w tonoplaście komórki roślinnej podczas zmian turgoru).

• Białka akwaporyn składają się z 6 transbłonowych segmentów α-helikalnych.

• Por ma średnicę 0,3 nm, co oznacza, że w świetle kanału mieści się dokładnie jedna cząsteczka wody (single file passage). Mimo to szybkość przepływu sięga kilku mld. cząsteczek na sekundę.

GERL:

• System endomembranowy ma związek z plazmalemmą oraz nukleolemmą, tonoplastem, błoną mitochondrialną itd.

• Kształt ER nadają mu aktynowe pęczki (platformowanie ER przez aktynę). ER można obserwowac stosując barwnik fluorescencyjny DiOC6.

• Ruch anterogradowy (do przodu) - pęcherzyki od ER łączą się ze stroną cis AG. W cysternach odbywa się dojrzewanie białek; od strony trans odrywają się pęcherzyki, które wędrują do plazmalemmy, wakuoli lub ruchem retrogradowym (do tyłu) do ER.

• kierunku ruchu pęcherzyka decyduje etykieta białkowa (np. klatryna).

• Ciała tłuszczowe w komórkach roślin oleistych powstają z SER jako pęcherzyki wypełnione trójglicerydami, otoczone jednowarstwą fosfolipidową naszpikowaną stabilizującymi „pinezkami” oleozynowymi.

• Ciała białkowe tworzące się z RER w komórkach tkanki odżywczej (endosperm), tworzą się poprzez magazynowanie białek syntetyzowanych na rybosomach RER.

• Każda błona systemu GERL jest asymetryczna (asymetria cis-trans).

• Zasada transportu pęcherzykowego gwarantuje zachowanie orientacji błon.

• Ciała białkowe to magazyny białka otoczone dwuwarstwą lipidową; ciała olejowe otoczone są jednowarstwą.

• Ruch od ER do AG nazywamy anterogradowym, a odwrotny - retrogradowym.

• Polisomy (wiele rybosomów połączonych razem) to główna postać, w jakiej występuja rybosomy na RER.

• Pęcherzyki oderwane od ER zawierające białko wędrują dalej do AG, gdzie białko dojrzewa (dołączane są reszty cukrowe, lipidowe lub inne; zmienia się też struktura przestrzenna białka).

• Ekstensyna transportowana jest pęcherzykowo do ściany komórkowej.

• Istnieje możliwość zmiany liczby diktiosomów (mogą się rozrywać).

• Przy użyciu izotopów radioaktywnych można śledzić obieg substancji wewnątrz systemu GERL.

• Przekazywanie zawartości pomiędzy cysternami następuje na drodze pęcherzykowej. Możliwe jednak, że transport może odbywać się na zasadzie dynamiki całego układu; nowe pęcherzyki tworzą nową cysternę i całość przesuwa się; na stronie trans cysterna ulega rozpadowi. Taka sytuacja oznaczałby, że zawartość pęcherzyków w zasadzie nie zmienia lokalizacji (nie przechodzi pomiędzy cysternami) - można to porównać do mikrotubuli, która budowana jest z coraz to nowych heterodimerów.

• Białka receptorowe umieszczone na plazmalemmie muszą być transportowane w specyficzny sposób (bo muszą być odpowiednio zorientowane na powierzchni błony komórkowej.

• Kierunek wędrówki pęcherzyków zależy od etykiet białkowych na powierzchni pęcherzyków. Białka z grupy SNARE rozpoznają miejsce, do którego ma trafić pęcherzyk.

• V-SNARE (vesicule SNARE) - białko na pęcherzyku; rozpoznaje błonę docelową

• T-SNARE (target SNARE) - białko rozpoznające białka V-SNARE

• Połączenie V-SNARE i T-SNARE powoduje zlanie się obu błon w miejscu połączenia.

Lizosomy

• Markerem lizosomów jest kwaśna fosfataza (jeden z enzymów wewnątrz liposomu).

• Lizosomy są szczególnymi pęcherzykami odpączkowującymi od strony trans AG.

• Zawierają hydrolazy; ich funkcją jest degradacja makrocząsteczek wchłoniętych do komórki.

• Nowo syntetyzowane enzymy są znakowane specjalną resztą cukrową (tak, aby mogły być związane do błony przy pomocy specyficznego receptora), we wnętrzu AG enzym łączony jest z przyszłą błoną lizosomu. Dopóki jest on związany z błoną, nie ma właściwości hydrolitycznych. Gdy lizosom odrywa się od AG, następuje aktywacja pomp protonowych (zakwaszanie środowiska wewnątrz lizosomu), białko enzymatyczne odłącza się od receptora błonowego i następuje podział lizosomu na dwie części (jedna zawiera enzym, a druga receptor, który wędruje do AG - taki komórkowy recycling :P)

Białka z grupy COP

COP1 - odpowiada za transport retrogradowy (od AG do ER)

COP2 - odpowiada za transport anterogradowy

Endocytoza receptorowa:

• Pęcherzyki sekrecyjne docierające do błony komórkowej wbudowują swoją błonę do plazmalemmy (powiększenie powierzchni). Aby błona nie pękła, równolegle biegną procesy odwrotne (endocytoza). Oba te procesy zapewniają ciągły ruch systemu GERL.

• Proces endocytozy prowadzony jest tylko na niektórych obszarach błony.

• Połączenie się ligandu z receptorem powoduje rozpoczęcie wpuklania błony; bierze w tym udział białko markerowe - klatryna.

• Triskeliony klatryny budują kosz klatrynowy wokół pęcherzyka.

• Przewężenie szyjki dołka opłaszczonego powodujeinne białko - dynamina.

• Kosz klatrynowy zapobiega pęknięciu pęcherzyka w cytoplazmie.

• Z pęcherzykiem endosomalnym łączy się lizosom dając endosom wtórny, który traci klatkę klatrynową..

• Klatka klatrynowa jest podobna do struktury węgla C60 (fullerenu) - piłka złożona z 12 pentagonów zamykających heksagony w kulę.

• Klatryna jest białkiem zbudowanym z 6 łańcuchów (struktura 4-rzędowa); ramiona triskelionów są elastyczne (mogą tworzyć 5 lub 6-kątne elementy).

Mikrosomy

• Otoczone są pojedynczą błoną elementarną.

• Często zawierają inkluzje krystalicznego białka.

• Wyróżniamy:

• Peroksysomy: liściowe, glioksysomy, brodawek korzeniowych

• Sferosomy - rezerwy energetyczne komórek (silnie załamują światło)

• Hydrogenosomy - prowadzą oksydację pirogronianu

• Glikosomy - katalizują beztlenowy rozkłąd glukozy

Peroksysomy

• Peroksysomy są bardzo podobne do lizosomów (bark różnic strukturalnych).

• Białka peroksysomów mają skłonność do krystalizacji.

• Peroksysomy mogą mieć różny charakter. Peroksysomy liściowe utylizują tlen powstały w procesie fotosyntezy; w komórkach brodawek korzeniowych obrabiają związki azotowe.

• U zwierząt peroksysomy występują w dużych ilościach w wątrobie i nerkach; u glonów i roślin - w komórkach prowadzących fotosyntezę.

• Markerem peroksysomów jest rozkładająca nadtlenek wodoru katalaza (stanowiąca do 15% składy białkowego peroksysomu). Występuje ona wraz z licznymi oksydazami generującymi nadtlenek wodoru; w ten sposób komórka jest odizolowana od toksycznego tlenu i wody utlenionej.

• Peroksysomy wspomagają pracę mitochondriów.

• Triton WR-1339 - detergent akumulujący się w lizosomach i zwiększający ich ciężar.

• Peroksysomy różnią się od lizosomów wrażliwością na inny detergent - digitoninę; aby wyzwolić katalazę z peroksysomu trzeba użyć około 10 razy więcej digitoniny niż jest potrzebne do wyzwolenia kwaśniej fosfatazy z lizosomu. Gdyby obie substancje były w takich samych pęcherzykach, zostałyby uwolnione przy tym samym stężeniu detergentu.

• Jeśli peroksysomy zawierają rdzeń krystaliczny, łatwo je odróżnić na zdjęciach TEM; jeśli nie mają rdzenia, stosuje się test DAB (reakcję z diaminobenzydyną).

• W reakcji DAB, po utlenieniu diaminobenzydyny przez katalazę, powstaje polimer łączący się z czterotlenkiem osmu (standardowa substancja kontrastująca)

• W komórkach roślin rdzeń krystaliczny peroksysomu tworzy katalaza (marker peroksysomów).

• W komórkach zwierząt rdzeń peroksysomu tworzy oksydaza moczanowa (nieregularny kryształ).

• Urikaza - oksydaza moczanowa przeprowadza w peroksysomach oksydację produktów przemiany kwasów nukleinowych (puryny) i niektórych białek.

• Wszystkie peroksysomy mają zdolność rozkładania H₂O₂ za pomocą katalazy.

H₂O₂ -> 0,5 O₂ + H₂O

Funkcje peroksysomów:

• Metabolizm nadtlenku wodoru.

• Detoksykacja komórki (utlenianie różnych substancji).

• Oksydacja kwasów tłuszczowych.

• Metabolizm związków azotu.

• Katabolizm substancji niezwykłych np. D-aminokwasów albo ksenobiotyków (alkany), np. teflonu.

• U grzybów w peroksysomach znajdują się enzymy pozwalające na rozkład krótkołańcuchowych węglowodorów. Może się to przyczyniać do oczyszczania wycieków ropy.

Glioksysomy

• W komórkach roślinnych specjalne peroksysomy zwane glioksysomami przeprowadzają konwersję lipidów w węglowodany podczas kiełkowania nasion roślin oleistych (soja, orzeszki ziemne, słonecznik), gdzie materiałem zapasowym w komórkach liścieni lub endospermu są kropelki tłuszczu (trójglicerydy). Dzieje się to przy udziale typowo roślinnych enzymów.

• Glioksysomy są nietrwałe; czynne w czasie kiełkowania siewki (1-2 tygodnie), następnie przekształcają się w peroksysomy liściowe. Spektrum enzymów zmienia się w ontogenezie.

Peroksysomy brodawek korzeniowych

• W peroksysomach brodawek korzeniowych znajdują się aminotransferazy; dzięki czemu może tam zachodzić degradacja lub tworzenie aminokwasów.

Biogeneza peroksysomów

• Powstają poprzez podział (są uważane za najstarsze endosymbionty komórki eukariotycznej; oksydaza D-aminokwasowa jest być może dowodem tego, że peroksysomy są najstarszymi endosymbiontami).

• Białka peroksysomowe są dostarczane posttranslacyjnie, ich transport do wewnątrz odbywa się z użyciem energii z ATP.

• Białka peroksysomowe są syntetyzowane na rybosomach cytoplazmatycznych; muszą być zaopatrzone w sekwencję sygnałową SKL zbudowaną z trzech aminokwasów.

• S - small uncharged (mały, nienaładowany) - seryna, prolina, alanina

• K - kation charged (+) - lizyna, arginina

• L - lipidlike (hydrofobowy) - metionina, leucyna

• Pozbawienie sygnału SKL powoduje pozostanie białka w cytozolu, natomiast dołączenie sygnału SKL do obcego białka pozwala wprowadzić je do peroksysomu (uniwersalizm SKL polega na tym, że można tą drogą wprowadzać bardzo różne białka; podany tutaj przykład z lucyferazą, świetlikami i transgenicznym tytoniem

• Adrenoleukodystrofia - defektywne białko integralne błony peroksysomu nie pozwala na transport do wnętrza kwasów tłuszczowych, które nagromadzając się w płynach ustrojowych niszczą osłonki mielinowe nerwów.

Ćwiczenia III - Podział komórkowy. Ściana komórkowa.

Cykl komórkowy - od podziału do podziału, wyróżnia się 4 fazy:

#Faza G1

- komórka jest mała, następuje jej wzrost

- w tej fazie najłatwiej jest zahamować, spowolnić czy przyśpieszyć cykl

- tu występuje translacja i transkrypcja

CDK + cykliny G1 = kompleks umożliwiający przejście do fazy S

#Faza S

- tutaj następuje replikacja materiału genetycznego (semikonserwatywnie) przez aparat replikacyjny (ligazy, helikazy), zaczyna się w konkretnym miejscu,

- tworzone są białka histonowe, kohezyjny które łączą ze sobą 2 siostrzane chromatydy

- kończy się gdy mat. genetyczny zostaje zreplikowany

Kinaza + cyklina A = kompleks zatrzymujący replikację i umożliwiający tym samym wejście w następną fazę

#Faza G2

- synteza białek wrzeciona podziałowego (mikrotubul i filamentów aktynowych)

- pod koniec fazy uaktywnia się kinaza fazy M i powoduję fosforylację i defosforylację białek -rozpoczęcie mitozy

Cykliny mitotyczne + kinaza = przejście do fazy M

#MITOZA:

- Kariokineza:

1. Profaza:

- kondensacja chromatyny - powstają chromosomy mitotyczne poprzez fosforylację histonu H1, H2A, H3 (przez kinazę fazy M)

- po obu stronach centromeru tworzy się kinetochor który ma strukturę blaszkową (miejsce wiązania mikrotubul wrzeciona)

- depolimeryzacja mikrotubul kortykalnych - z nich powstaje wrzeciono kariokinetyczne:

* MT biegunowe

* MT kinetochorowe (łączą się z kinetochorem - liczba MT łączących się z kinetochorem jest różna)

2. Prometafaza:

- otoczka jądrowa ulega fragmentacji - zapoczątkowuje to aktywacja kinazy fazy M (fosforyzuje i zmienia konformację białek blaszki)

- zanikanie jąderka przez udział nukleolin.

3. Metafaza:

- kończy się kondensacja chromatyny

- chromosomy ustawiają się w płaszczyźnie równikowej, stała pozycja

- składniki cytoplazmy rozdzielają się po równo do biegunów komórki

4. Anafaza:

- nagłe rozdzielenie chromatyd siostrzanych w miejscu centromerów

- jest kilka teorii ruchu tych chromatyd:

* ruch ślizgowy - polega na ślizganiu się mikrotubul biegunowych względem siebie (podobny ruch MT jaki występuje w wiciach)

* mechanizm kieratowy - polega na wydłużaniu mikrotubul, z przodu następuje polimeryzacja a na tylnej części depolimeryzacja przy czym jest ona wolniejsza.

* mechanizm zamka błyskawicznego - występuje tutaj boczne oddziaływanie między MT biegunowymi a MT kinetochorowymi.

* teoria kołnierza ślizgowego - kinetochor ślizga się po MT-ach

5. Telofaza:

- po doprowadzeniu chromatyd następuje dekondensacja chromatyny

- synteza rRNA jest wstępem do odtwarzania jąderka

- reorganizacja cytoszkieletu komórki

- wrzeciono zanika , rekonstrukcja jądra

- Cytokineza:

• Z wrzeciona kariokinetycznego powstaje tutaj wrzeciono cytokinetyczne (ono tylko inicjuje podział)

• Powstaje pierścień kurczliwy (opaska preprofazowa)

- składa się z miozyny i aktyny

- zaciska się podobnym mechanizmem jak u nas w sarkomerze

- filamenty się nie tworzą od nowa tylko reorganizują

- obkurczając się tworzy się bruzda podziałowa

• ER wysyła pęcherzyki do centrum (centryfugalnie) - sekrecja różnych subst. (pektyn)

• Tworzy się przegroda pierwotna

- w niej są pektyny (półpłynne)

- rozrasta się na boki

- po styknięciu się z oryginalną ścianą, masa ta gęstnieje i tworzy się blaszka środkowa

• Tworzona jest następnie ściana pierwotna (elastyczna)

• Zanika fragmoplast

• Mikrotubule odbudowywują cytoszkielet

• Jest hamowana przez cytochalazynę B (powstaje komórka dwujądrowa, nie wstrzymuje kariokinezy)

Ruch chromosomów:

• Mikrotubule odpowiedzialne są również za ruch chromosomów - mikrotubule dynamiczne polimeryzujące w MTOC.

• Przewężenie pierwotne chromosomu (centromer) otoczony jest białkami kinetochorowymi, które mają zdolność łączenia się z mikrotubulami. Białka kinetochorowe można wykrywać (tak jak inne białka) metodą immunocytochemiczną.

• Złapanie chromosomu (połączenie się MT z kinetochorem) przed ustawieniem w płaszczyźnie równikowej nie powoduje przerwania ani zmiany w podziale; sytuacja taka prowadzi jedynie do dodatkowej polimeryzacji mikrotubuli i właściwego ustawienia chromosomu.

• Dzięki połączeniu chromosomu z mikrotubulami (różną ilością) z przeciwnych biegunów, w kinetochorze tworzy się silne naprężenie. Anafaza trwa bardzo krótko (chromatydy bardzo szybko się rozchodzą).

Mechanizm ściągania chromosomów do biegunów komórki:

• Hipoteza pęczków mikrotubul (odciąganie odbywa się na zasadzie składania teleskopowego, analogicznie do sytuacji w obwodowych dubletach MT w wiciach).

• Eksperyment polegający na laserowym przecięciu połowy wrzeciona w momencie największego naprężenia udowadnia, że mikrotubula (ta nie potraktowana laserem) działa jak gumka i ściąga cały chromosom do jednego z biegunów). Można zatem dojść do wniosku, że istnieje elastyczne białko, na którym umieszczone są mikrotubule wrzeciona.

p34 - kinaza występująca przy podziale/cyklu komórki

p34 + cyklina mitotyczna (G2) = MPF

MPF (M-phase promoting factor) - kompleks wprowadzający do fazy M

p34 + cyklina mitotyczna (G1) = SPF

MPF i SPF odpowiadają za fosforylację odmiennych substratów

Wrzeciono cytokinetyczne:

• Mikrotubule wrzeciona cytokinetycznego zdają się być niezbędne do przemieszczania pęcherzyków AG (wypełnionych pektynami) do płaszczyzny podziału, gdzie tworzy się pektynowa przegroda pierwotna.

• Najnowsze badania obalają jednak ten pożałowania godny mit , bo zniszczenie mikrotubul wrzeciona cytokinetycznego nie powoduje zahamowania tworzenia się przegrody.

• Wrzeciono cytokinetyczne posiada inną odporność i właściwości niż wrzeciono kariokinetyczne (odpowiadają za to białka z grupy MAP).

• Cytokineza może zachodzić na trzech drogach:

1. Gdy wrzeciono kariokinetyczne nie rozpadnie się, tylko zmieni nieco kształt (tzw. fragmoplast); przegroda pierwotna rośnie centyfugalnie (odśrodkowo).

2. Gdy wrzeciono kariokinetyczne nie rozpadnie się, ale nie zmieni nawet swego kształtu; przegroda pierwotna rośnie centrypetalnie (dośrodkowo).

3. Gdy wrzeciono kariokinetyczne rozpadnie się, a mikrotubule ustawią się równolegle do płaszczyzny podziału (tzw. fikoplast); jądra komórkowe zbliżają się do siebie, ale nie wiem, w którą stronę następuje wzrost przegrody pierwotnej.

Cytoszkielet tubulinowy kortykalny

• Ułożony jest on tuż pod plazmalemmą; mikrotubule są często połączone z błoną za pomocą transbłonowych łączników.

• Cytoszkielet kortykalny jest najlepiej widoczny w czasie interfazy; układ mikrotubul jest często wysoce uporządkowany (są ułożone równolegle do siebie).

• Układ mikrotubul kortykalnych wskazuje oś polarności komórki (jest do niej prostopadły).

Polarność komórki

• 
  Roślina może kontrolować polarność komórek regulując stężenie hormonów roślinnych (drobnocząsteczkowych); można to udowodnić przedstawiając choćby doświadczenie wykonane na hypokotylu owsa.

• układ mikrotubul poziomy (więc oś polarności pionowa) - gdy traktujemy komórki gibereliną GA₃ (promocja wydłużania).

• układ mikrotubul pionowy (przebudowa o 90°) - gdy potraktujemy komórki etylenem

Mikrotubule kortykalne, a układ mikrofibrylli w ścianie:

• Na merystemach apikalnych, w komórkach rosnących izometrycznie (równomiernie we wszystkie strony), układ mikrotubul kortykalnych jest sieciowy (nieuporządkowany); również sieciowy jest układ mikrofibrylli celulozowych ściany.

• Intrususcepcja - wzrost poprzez rozciąganie turgorowe (np. wzrost ścian pierwotnych w komórkach rosnących izometrycznie.

• Na bocznej powierzchni merystemów zachodzi już wzrost spolaryzowany.

• Mikrofibrylle celulozowe tworzą się równolegle do układu mikrotubul kortykalnych; dzięki takiemu ułożeniu turgor może rozciągać komórkę tylko w jedną stronę.

• W komórkach podlegających ukierunkowanemu wzrostowi (w organach osiowych) układ mikrotubul kortykalnych jest wysoce uporządkowany (są równoległe do siebie).

• W preprofazie cytoszkielet ulega depolimeryzacji; w fazie tej mikrotubule kortykalne ulegają „collapsowi”, tworzy się opaska preprofazowa.

• W szkielecie kortykalnym interfazowym mikrotubule są oddalone o około 25 nm. Pod wpływem „collapsu” mikrotubule z biegunów „zsypują” się na środek.

• Opaska preprofazowa (PPB - preprophase band) nie występuje np. w komórkach kambium, mimo że są to komórki z definicji dzielące się (jednak to, że nikt tego nie zobaczył, wcale nie znaczy, że tego nie ma).

• W komórkach kamforowca układ mikrotubul kortykalnych w interfazie jest helikalny; nie znaleziono opasek preprofazowych w komórkach kamforowca (istnieje hipoteza, że opaska może być tworzona przez pojedyncze mikrotubule, dlatego nie widać jej pod mikroskopem.

• Położenie opaski wyznacza płaszczyznę podziału i położenie przegrody pierwotnej (jest odzwierciedlaniem polarności komórki).

• Opaska całkowicie depolimeryzuje z chwilą wejścia komórki w profazę (dzięki temu zwiększa się pula heterodimerów potrzebnych do syntezy wrzeciona).

• Aparat szparkowy u cebuli powstaje prostopadle do opaski preprofazowej.

• Położenie opaski preprofazowej jest „zapamiętywane”; nawet po wirowaniu przegroda pierwotna tworzy się w miejscu wyznaczanym wcześniej przez opaskę.

• Do tworzenia wrzeciona cytokinetycznego używane są heterodimery, które wcześniej tworzyły wrzeciono kariokinetyczne.

Ułożenie cytoszkieletu kortykalnego a mikrofibrylle celulozowe

• Ułożenie mikrotubul kortykalnych jest związane z ułożeniem mikrofibrylli celulozowych (ściana powtarza układ mikrotubul). Zależność ta zaobserwowana została w dojrzewającym protoksylemie.

• Na powierzchni błony komórkowej istnieją enzymy (syntazy celulozowe - w postaci 6-promiennych rozet), które syntetyzują łańcuch celulozowy z glukozy dostarczanej przez pęcherzyki AG.

Układ syntaz celulozowych:

• Syntazy celulozowe nie zawsze tworzą 6-promienną rozetę; czasem występuje linearny system syntaz (np. u krasnorostów); taki układ syntaz daje tasiemkowaty układ mikrofibrylli celulozowych.

• Na powierzchni komórek niektórych zielenic występują układy heksagonalne zawierające wiele 6-promiennych rozet syntaz celulozowych. Może to sugerować, że kompleks taki syntetyzuje mikrofibrylle w różnych kierunkach (bo poszczególne warstwy ściany są ułożone w różnych kierunkach).

• U roślin wyższych celuloza powstaje na zewnątrz komórki. U niektórych glonów jednak celuloza powstaje w cysternach AG; tworzone są tam łuseczki celulozowe, które transportowane są na zewnątrz komórki.

Ściana komórkowa

• Blaszka środkowa

• Ściana pierwotna z pierwotnymi polami jamkowymi, cienka, rozciągliwa, powstaje w czasie cytokinezy, rośnie wraz z komórką. Safranina + błękit cyjaninowy barwi celulozę na niebieskawy kolor. Po ukończeniu formowania powstaje:

• Ściana wtórna (warstwy S1, S2 i S3) z jamkami prostymi lub lejkowatymi, ulega drewnieniu, odkładana jest tutaj lignina która barwi się na kolor czerwony poprzez dodanie safraniny

• System połączonych ścian komórkowych nazywamy apoplastem.

Funkcje ściany komórkowej:

• Utrzymywanie komórki w stanie turgoru (bez ściany komórka by pękła).

• Określenie właściwości mechanicznych tkanek (często wraz z wakuolą).

• Regulacja kierunków wzrostu komórki.

• Zabezpieczenie przed czynnikami środowiska, oraz aktywne zabezpieczenie przed patogenami.

• Udział w przenoszeniu / odbiorze sygnałów - narzuca drobno cząsteczkowość sygnałów roślinnych; hormony (jak auksyny) wędrują w ścianie jak neurotransmitery pomiędzy neuronami.

• Kontakt apoplastu z symplastem (komórki transferowe) - tam, gdzie protoplast dotyka ściany.

Sklerenchyma posiada grubą ścianę komórkową, która zapewnia sztywność nawet w warunkach stresu wodnego (np. u kserofitów).

Klasyfikacja składników strukturalnych ściany komórkowej:

• składniki szkieletowe celuloza

• macierz ściany hemicelulozy, pektyny, glikoproteiny

• substancje inkrustujące lignina, krzemionka, węglan wapnia, tiaminy, żywice

• substancje adkrustujące suberyna, kutyna, sporoplenina, śluzy, gumy, kaloza (buduje glukan, wiązanie beta)

• Składniki inkrustujące wnikają pomiędzy elementy strukturalne ściany; lignina umożliwia utworzenie tkanki waskularnej.

• Substancje adkrustujące tworzą warstwę na powierzchni; sporoplenina nie ulega biodegradacji.

• Hemicelulozy przyklejone są do mikrofibrylli celulozowych. Z hemicelulozami związane są neutralne pektyny, a z nimi pektyny kwaśne.

• Glikoproteiny to białka elastyczne przeplecione przez mikrofilamenty.

Białka elastyczne występujące w komórkach roślinnych:

• F-aktyna (mikrofilamenty)

• neksyna (spina dublety w szkielecie wici)

• ekstensyny (przepleciona przez mikrofibrylle; pełni funkcję strukturalną; zawiera dużo proliny i hydroksyproliny - jak w kolagenie).

Białka strukturalne ściany:

• Zawartość białek w ścianie komórkowej zależy od stanu dojrzałości komórki, typu ściany, jej stymulacji (zranienia, atak patogenów itp.)

• Rodzaje białek w ścianie (wartość procentowa określa zawartość procentową cukru w glikoproteinie):

• HRGP (55%; bogate w hydroksyprolinę; występują we floemie, kambium; inaczej nazywane ekstensynami).

• PRP (0-20%; bogate w prolinę; występują w ksylemie, włóknach i korze pierwotnej).

• GRP (0%; bogate w glicynę, występują w ksylemie).

• AGP (90%; bogate w galaktozę i arabinozę; istotne w adhezji i rozpoznawaniu komórek np. prowadzenie łagiewki pyłkowej przez tkanki słupka).

Białka enzymatyczne:

• Udział w budowaniu ściany (ze składników dostarczanych przez komórkę).

• Ekspansyny - odpowiadają za wzrost powierzchni ściany oraz rozpad ściany w trakcie maceracji i zrzucania organów, pozwalają na rozluźnienie struktury ściany komórkowej (ich działalność przejawia się np. powstawaniem bocznych struktur na powierzchni merystemu.

Droga transportu ekspansyny jest zawsze drogą najkrótszą; transkrypt wędruje do najbliższego diktiosomu, gdzie dojrzewa. Nie wiadomo skąd komórka wie, że dana droga jest najkrótsza i że daną ścianę należy modyfikować ekspansyną.

w środowisku kwaśnym oddzielają hemicelulozy od mikrofibrylli (rozkładają wiązanie wodorowe; ekspansyny nie są białkami enzymatycznymi, ponieważ wiązanie wodorowe nie jest typowym wiązaniem chemicznym).

• Ekstensyny to białka elastyczne spinające mikrofibrylle celulozowe w ścianie komórkowej, nie można ich mylić z ekspansynami.

• W ścianie znajdują się enzymy szlaku syntezy ligniny, a także degradujące ścianę.

• Komórki posiadające ściany komórkowe posiadają receptory (w ścianie rzecz jasna), które rozpoznają komórki sąsiednie.

* Transglukozydaza ksyloglukanu - enzym rozcinający wiązania glikozydowe między hemicelulozą (ksyloglukanem), zmienia układ struktury i wiązań.

* CKI - białka inhibitujące kolejne podziały komórkowe.

* NOR - (nucleosome organizer region) - w tym regionie zakłada się jądro po podziale

* UDP-glukoza - ufosforylowana forma, prekursor do budowy celulozy. MT kortykalne określają gdzie się utworzą włókna (Kolchicyna hamuje ten proces)

Ćwiczenia IV - Plastydy.

• Plastydy powstają wskutek różnicowania się form prekursorowych - proplastydów (w tkankach merystematycznych)

• Namnażanie przez podział

• Różnicowanie się proplastydów następuje tkankowo, przez udział światła - prowadzi do powstania form dojrzałych:

- amyloplasty

- leukoplasty

- chloroplasty (tylko one chlorofil mają - fotosynteza)

- chromoplasty

• Ostatnią fazą jest faza starzenia

• Mogą się odróżnicowywać w inne typy plastydów (np. chromoplast w chloroplast)

• Każdy plastyd ma: podwójną błonę, zachowują własne DNA, posiadają macierz - stromę.

• Genom plastydowy jest pojedynczą cząsteczką DNA, znajdują się po kilkanaście w pojedynczym obszarze nukleoidopodobnym

• Białko PEND - białko które odpowiada za replikację, segregację i transkrypcję DNA

• W otoczkach błonowych znajdują się unikalny skład lipidowy: znaczna ilość sulfolipidów i galaktolipidów przy niskim poziomie fosfolipidów.

• Podział następuje poprzez mechanizm rozszczepienia

1. Proplastydy

• kształt sferyczny

• niewielka ilość rybosomów

• jeden lub kilka obszarów nukleoidopodobnych (ON)

• pojedyncze ziarna skrobi i plastoglobule (struktury osmofilne zawierające estrowe pochodne karotenoidów, plastochinony i kwasy tłuszczowe)

• słabo rozwinięty system błon, rurkowe struktury przypominające MT

2. Chloroplasty

• Ciała kształtu soczewkowatego, zbudowane z otoczki (2 błonowa), stromy oraz silnie rozbudowanego systemu spłaszczonych obłonionych pęcherzyków nazywanych tylakoidami - część może łączyć się w stosy zwane granami

• Pochodzą z proplastydów

proplastyd -> plastyd ameboidalny -> plastyd przedgranowy -> chloroplast (jeśli ma dostęp (sferyczny) (ameboidalny) (następuje wpuklanie do światła)

błony tworząc pęcherzyki)

\

\/

etioplast

(jeśli brak dostępu do światła)

• Etioplasty są charakterystyczne poprzez posiadanie ciał prolamellarnych, które stanowią silnie rozbudowaną przestrzennie parakrystaliczną sieć błonowych rurek (cztero lub cześcio ramienna jednostka rurkowa (rurku :D nie wkurwiaj mnie, dobrze?) łącząc się ze sobą ramionami, jednostki te tworzą sieć przestrzenną, błony tubulin zawierają oksydoreduktazy NADPH - enzym ten katalizuje zależną od światła redukcję protochlorofilidu do chlorofilidu - prekursora chlorofilu.

• Etioplasty mogą przekształcić się w chloroplasty poprzez ekspozycję na światło (protochlorofilid przekształca się w chlorofili a ten w chlorofil) następnie ulega zmianom struktura wewnętrzna tego plastydu tworząc dojrzały chloroplast, taki sam jak ten nieprzerwany epizodem ciemności.

• Chloroplasty to jedyne plastydy zawierające chlorofil i prowadzące fotosyntezę, której istotą jest wykorzystanie energii świetlnej do redukcji pobieranego z atmosfery CO₂ do poziomu cukrów. Reakcja przebiega ta w 2 fazach:

- Faza świetlna - zachodzi niemal w całości w błonach tylakoidów i wymaga stałego dopływu światła (produktami są ATP i NADPH)

- Faza ciemna - zachodzi całkowicie w stromie i nie wymaga dopływu światła, faza ciemna wykorzystuje produkty z fazy świetlnej (jasnej) do produkcji cukrów z użyciem CO₂

• 
  Tylakoid - składa się z błony tylakoidowej oraz światła (wnętrza tylakoidu), stos tylakoidów tworzy grana. Wyróżnia się dwa typy:

- tylakoidy gran (tworzą właśnie te skupiska)

- tylakoidy stromy (przenikają swobodnie stromę)

• W nich znajdują się barwniki - najpowszechniejszy chlorofil (a, b, c, d) oraz inne barwniki (karoteny, fikobiliny i ksantofile).

• Stroma - zawiera liczne struktury zawieszone w substancji podstawowej:

- obszary nukleoidopodobne, rybosomy, ziarna skrobi, plastoglobule, depozyty fitoferrytyny (białko wiążące nadmiar jonów żelaza)

• Otoczka - charakterystyczna jest u chloroplastów ze względu na przebieg wielu skomplikowanych i ważnych procesów. Znajduję się tu CFC (centra formujące chlorofil - są to kompleksy wieloenzymatyczne otoczki)

3. Amyloplasty

• Plastyd nie zawierający chlorofilu, kształt sferyczny, otoczka 2 błonowa, wnętrze wypełnia stroma (w niej ON - obszary nukleoidopodobne, rybosomy i plastoblobule a także najbardziej istotne ziarna skrobi)

• Pojedynczy amyloplast może zawierać pojedyncze duże ziarno lub kilka mniejszych.

• Ziarna powstają poprzez odkładanie (apozycję) skrobii wokół niednego lub kilku tzw. ośrodków znajdujących się w stromie.

• Ziarna można podzielić na: proste (jeden ośrodek) i złożone (kilka takich ośrodków) rzdko występują półzłożone (ośrodki których warstwy odkładające są wspólne)

• Apozycja skrobi niejednakowo intensywna prowadzi do powstania ziaren o uwarstwieniu ekscentrycznym (np. u ziemniaka), podczas gdy równomierne odkładanie warstw nazywa się koncentrycznym ułożeniem (np. miękisz liścieni roślin motylkowych)

• W pełni rozwinięte amyloplasty spotyka się tylko w tkankach spichrzowych u roślin lub czapeczki gdzie pełnią wtedy funkcje statolitu, percepcja bodźca grawitacyjnego.




4. Leukoplasty

• Plastydy nie zawierające chlorofilu, rozpowszechnione w tkankach roślinnych, zazwyczaj znajdują się w sąsiedztwie jądra komórkowego, otoczka 2 błonowa, wnętrze wypełnia stroma z niewielką ilością plastoglobuli i ON, nie zawierają rybosomów.

• Występują przedewszystkim w komórkach kory pierwotnej łodygi, korzenia, epidermie i jej wytworach (włośniki), gruczołach wydzielających olejki eteryczne, i bielmie.

• Słabo poznane funkcje, oprócz tego że udowodniono ich rolę w wytwarzaniu olejków eterycznych w młodych owocach cytrusowych.

5. Chromoplasty

• Zawierają znaczą ilość karotenoidów, mimo tego nieaktywny fotosyntetycznie - brak chlorofilu. Kształtu sferycznego, elipsoidalnego bądź ameboidalnego, powstają na wskutek przekształcenia najczęściej chloroplastów lub amyloplastów

• W pełni rozwinięte chromoplasty znajdują się przedewszystkim w płatkach korony oraz w owocach, przy współudziale antocyjan znajdujących się w wakuoli nadają różnorodne żywe barwy.

• Typowo otoczka 2 błonowa, wnętrze wypełnia stroma oraz struktury magazynujące karotenoidy, jest tu ON, plastoglobule, bardzo mała ilość rybosomów oraz pokłady fitoferrytyny.

• Wyróżnia się kilka typów tych plastydów:

- globularne (powstaje w wyniku transformacji chloroplast -> chromoplast, posiada więcej plastoglobuli niż chloroplast, wysoki stosunek lipidy/białko)

- tubularne (tutaj funkcje gromadzenia karotenoidów mają tabule, niski stosunek lipidy/białko, długie i cienkie struktury, cylindryczne, współistnieją z plastoglobulami)

- krystaliczne (tutaj karotenoidy skumulowane są w formie kryształów, otoczone błoną podobną do błony tylakoidów)

- błonowe (struktury gromadzące barwniki mają postać błoniastą, tworzą retikulum chromoplastowe, powstają przez inwaginację wewnętrznej błony plastydu)

• Białkami swoistymi dla chromoplastów jest fibryllina (wyizolowana z papryki), białko CHRA, CHRB, CHRC

• Są ostatnim ogniwem ciągu biogenetycznych powiązań między plastydami, mogą niekiedy przekształcać się w aktywnie fotosyntezujące chloroplasty.

---