Ćwiczenie 3

TEMAT: RECEPTORY KOMÓRKOWE

DROGI SYGNALIZACYJNE

• szlak parakrynowy

• sposób komunikowania komórek które znajdują się w niedalekiej odległości od siebie. Znajdują się w danym narządzie, w danej strukturze

• Cząsteczkami sygnalizacyjnymi są hormony tkankowe/miejscowe (pochodne kw. arachidonowego, które produkowane są przez nabłonek wyścielający nasze naczynia (śródbłonek) i należą tu w większości prostaglandyny, prostacykliny, tromboksany). Te wszystkie substancje maja wpływ na wykrzepianie krwi w naszym organizmie czy proces zapobiegający przed tym wykrzepianiem w naszych naczyniach krwionośnych a także mają wpływ na mięśniówkę naczyń. Cała ta grupa substancji pochodnych kw. arachidonowego nazywa się ejkosanoidami

• oprócz tego substancjami które działają w tym szlaku komunikacyjnym są hormony produkowane przez układ APUT, układ komórek wydzielających hormony które nie tworzą skupisk, a tworzą pojedyncze komórki znajdujące się m.in. w naszym przewodzie pokarmowym. Wydzielają one również część z tych hormonów które nie działają ogólnoustrojowo a działają w miejscu swojej produkcji i swojego uwolnienia

• szlak endokrynowy

• szlak który wykorzystują hormony ogólnoustrojowe, tak jak np. hormony sterydowe, tarczycy, hormony kory nadnerczy

• Te substancje uwalniane są najczęściej od krwioobiegu, i wędrując z krwią rozprowadzane są po całym organizmie. Wpływają na funkcjonowanie komórek, które mogą znajdować się w dużej odległości od komórek które wydzieliły ta substancje. Czyli miejsce wydzielania i komórka efektorowa znajdują się w dużej odległości od siebie.

• szlak autokrynowy

• komórka która produkuje cząsteczkę sygnałową (informator I-go rzędu, bądź też ligand) uwalniana jest na zew. komórki, Ta cząsteczka przyłącza się do receptora znajdującego się na błonie komórkowej

• Komórka zwiększa swoją odpowiedz na dany czynnik który ją uaktywnia. Ponieważ komórka czasami nie jest w stanie w cytoplazmie uruchomić mechanizmu intensyfikujących tą odpowiedz, więc sama produkuje cząsteczki sygnałowe i zwiększa aktywność tego procesu.

• Jest to szlak sygnalizacyjny wykorzystywany np. w uk. odpornościowym, gdy pewne substancje immunomodulujące są uwalniane na zewnątrz, i mogą one działać na tą sama komórkę, zwiększając jej odpowiedź, czy zwiększając uwalnianie tej samej substancji, ale mogą też być powiązane z innym szlakiem np. parakrynowym, bo jeżeli mamy skupisko tkanki należącej do uk. odpornościowego, to wtedy zarówno te cząsteczki sygnałowe mogą pobudzać tą sama komórkę jak i komórki sąsiednie

• szlak okołokrynowy (jukstakrynowy)

• cząsteczka sygnałowa nie jest uwalniana do środowiska zew., ale komórka ta prezentuje tą cząsteczkę na błonie komórkowej i do tej cząsteczki przyłącza nam się receptor. W ten sposób powoduje to ze te 2 komórki do siebie przylegają

• Ten szlak sygnalizacyjny wykorzystywany jest w procesie adhezji - agregacji (przylegania komórek, np. tworzenie się czopów płytek krwi, skupiska komórek leukocytarnych)

RECEPTORY

• Są cztery zasadnicze klasy receptorów, tzw. nadrodziny. Przynależność receptora do danej nadrodziny warunkowany jest przez jego mechanizm działania.

• Między różnymi organizmami występuje niewielkie zróżnicowanie receptorów. (występowanie tylko kilku mechanizmów działania tłumaczy się teorią wspólnego przodka- teoria ewolucyjna która mówi że w wyniku ewolucji komórki wykształciły praprzodków jakiś receptorów które były już tylko modyfikowane (zwielokrotnienie genu wspólnego przodka) )

RECEPTORY WEWNĄTRZKOMÓRKOWE

• 98% to receptory błonowe, zewnątrzkomórkowe

• 2% to receptory wewnątrzkomórkowe (leżą w cytoplazmie lub w jądrze komórkowym) -Cząsteczka sygnałowa pierwszego rzędu, musi posiadać odpowiednie cechy, aby przedrzeć się przez błonę i dotrzeć do receptora:

- mały rozmiar

- lipofilność, hydrofobowość

- brak ładunku (brak polarności)

• Takimi cechami nie musi się charakteryzować cząsteczka dla receptora zewnątrzkomórkowego, na błonie komórkowej. Może to być duża cząsteczka, hydrofilna i naładowana ładunkiem

• Do grupy receptorów wew. należą przede wszystkim białka, (białka cytozolowe, białka wewnątrzjądrowe). Cząsteczkami sygnalizacyjnymi dla tej grupy receptorów są hormony sterydowe (glikokortykosteroidy, mineralokortykosteroidy (hormony kory nadnerczy)), hormony płciowe (androgeny, estrogeny, estradiol i progesteron). Należą tu też hormony niesterydowe - hormony tarczycy (tyroksyna), substancje pochodne Wit. A (retinoidy) oraz Wit D₃.

• Hormony te i substancje wpływają na dane komórki po pewnym okresie, nie jest to odpowiedz natychmiastowa, może to być kilka godzin ale i kilka dni. Odpowiedz ta trwa aż do momentu kiedy substancje które powstaną w wyniku działania tych receptorów zostaną w sposób naturalny usunięte z komórki lub zużyte. Receptory te wpływają na ekspresje i transkrypcje ( 50 do 100 genów) genów dlatego ta odpowiedz jest opóźniona i dlatego jest długotrwała. Receptory te wpływają również na procesy potranslacyjne i potranskrypcyjne - dojrzewanie tych białek które już powstały. Działanie cząsteczki widać już po paru minutach ponieważ rośnie aktywność enzymów transkrypcyjnych, i informacyjnego RNA. Te receptory to białka zahaczone, zaczepione do białek znajdujących się cytoplazmie (najczęściej do białka szoku cieplnego, HSP 90 należące do chaperonów, stabilizujące inne białka; receptory dla tyroksyny i pochodnych Wit. A przyłączają się do niehistonowych białek chromatyny)

• Sam receptor to łańcuch polipeptydowy do 1000 reszt polipeptydowych. Składa się z 3 elementów:

• końca C, do których przyłącza się ligand (cząsteczka sygnałowa)

• środkowej domeny, domeny DRB, domena konserwatywna, co oznacza że jej budowa jest nie zmienna, tzw. palce cynkowe

• koniec N - mały stopień homologii, charakterystyczny dla danego receptora, zmienny, zależy od niego jaki promotor genu dany receptor aktywuje

Przykładowy szlak sygnalizacyjny hormonu sterydowego - kortyzolu.

1. Hormon przedostaje się przez błonę komórkową,

2. Czeka na niego nieaktywny receptor, połączony z białkiem HSP 90,

3. Przyłączenie cząsteczki sygnalizacyjnej,

4. Odłączenie receptora od białka HSP 90

5. Receptor i cząsteczka sygnałowa przedostają się z cytoplazmy do jądra kom.

6. W jadrze fragment DRB przyłącza się do fragmentu HRE (fragment stały dla wszystkich genów które ulegają ekspresji w wyniku działania receptorów wewnątrzkomórkowych.

7. Koniec N decyduje do jakiego genu się przyłączy

8. Przyłączenie promotora do genu powoduje aktywacje ekspresji genów

9. Wszystkie procesy syntezy białka zaczynają się.

RECEPTORY ZEWNĄTRZKOMÓRKOWE

98% wszystkich receptorów znajduje się na powierzchni błony komórkowej.

Wyróżniamy tutaj 3 zasadnicze nadrodziny:

- receptory jonotropowe - związane z kanałami jonowymi. ich fragment to kanał jonowy,

- receptory metabotropowe - przekazywanie informacji przy pomocy wtórnego przekaźnika, elementem przekazującym tą inf. jest układ białka G.

- receptory katalityczne wyróżniamy dwa rodzaje, w zależności jaki enzym jest związany w tym receptorem:

• zależne od kinazy tyrozynowej

• zależne od kinazy serynowo - treoninowej

RECEPTORY JONOTROPOWE

• spełniają dla komórki najprostszą funkcję

• wykorzystują najprostszy sposób przeniesienia sygnału do komórki

• receptor dla szybkich neuroprzekaźników

• szybkość odpowiedzi tych receptorów to kilka milisekund i utrzymuje się też przez kilka milisekund

• kanał jonowy to centralny fragment receptora, który najczęściej jest ułożony z czterech splecionych łańcuchów transbłonowych

• mechanizm działania polega na tym że w przypadku związania się cząsteczki sygnałowej czyli tego informatora pierwszego rzędu, dochodzi do zmiany w układzie przestrzennym tych białek. Zmiana ta doprowadza do otworzenia kanału jonowego i do przepływu odpowiednich jonów dzięki wytworzonemu przez błony gradientowi stężeń, utrzymywany przez mechanizm np. pompy sodowo - potasowej, pompy wapniowej

Proces bramkowania - otwieranie zamkniętego kanału jonowego, lub odwrotnie. Czynniki wywołujące bramkowanie:

• przyłączenie danej substancji/cząsteczki

• bramkowanie fosforanami ( powoduje dostarczenie energii)

• bramkowanie napięciem (depolaryzacja błony komórkowej)

• bramkowanie czynnikami mechanicznymi (ciśnienie, rozciąganie)

Aktywowanie to zazwyczaj otwieranie kanałów.

Przykłady receptorów:

1. NIKOTYNOWY DLA ACETYLOCHOLINY.

Jest to białko kanałowe zbudowane z 5 podjednostek (2 α, β, γ, δ), które budują kanał, mający miejsce na acetylocholinę - neuroprzekaźnik w naszych synapsach neuronowo - mięśniowych

Receptor związany z kanałem dla jonów sodowych.

Jeżeli impuls w naszych nerwach przebiega do mięśni, w błonie presynaptycznej zostają uwolnione cząsteczki neuroprzekaźnika (acetylocholina), docierają one do błony postsynaptycznej, gdzie napotykają receptor, i łączą się z nim. Doprowadza to do otworzenia kanału sodowego i gwałtownego napływu Na⁺ do komórki. Doprowadza to do depolaryzacji błony komórkowej i otworzenia kanałów jonów Ca²⁺ (bramkowanie napięciem). Dochodzi do skurczu mięśni szkieletowych. Nikotyna jest agonistą, substancją inną niż naturalny ligand łącząca się z receptorem i w małych ilościach pobudzająca receptor

2. GABAERGICZNY typu A (GABA_A)

• występują w dużej ilości w ośrodkowym układzie nerwowym - stanowią 30% wszystkich występujących tam receptorów

• ligandem jest kwas γ-aminomasłowy

• ma 5 podjednostek, a każda kodowana jest przez kilka różnych genów

• receptory tego typu różnią się między sobą nie jakościowo a ilościowo co jest związane z tym, że podjednostki receptorów mogą być kodowane przez różne geny

• receptor obsługuje kanał dla jonów Cl ^- (które wchodzą do cytoplazmy) i wywołują hiperpolaryzację doprowadzając do wygaszania potencjałów komórkowych

• za pomocą tych receptorów działa wiele leków - uspokajające, przeciwalergiczne, nasenne, anastetyki steroidowe, (barbiturany - luminal, benzodiazepiny - relanium, tegretal)(to agoniści niekompetycyjni - łączą się i pobudzają receptor ale w innych miejscach, a nie w tych w których łączy się naturalny ligand), takim agonistą jest także alkohol etylowy - działa w niewielkim stężeniu

3. GLICYNOWY WRAŻLIWY NA STRYCHNINĘ

• pentamer (5 podjednostek), 3α i 2β

• tworzy kanał dla jonów Cl^-

• występuje w rdzeniu kręgowym w neuronach pośredniczących - regulacja napięcia mięśni szkieletowych

• w trakcie życia człowieka jego budowa ulega zmianom. u dziecka i u płodu receptory wrażliwe na strychninę (domeny α₂) są zastępowane u dorosłego w α₁

• normalne działanie receptora zwiotcza mięśnie

• strychnina jest antagonistą - wywołuje zahamowanie receptorów - drgawki i wzrost napięcia mięśniowego, spazmy

4. NMDA (glutaminowy) - występuje w ukł. nerwowym

RECEPTORY METABOTROPOWE

• najliczniejsza grupa receptorów

• współpracują z białkami G

• aktywują enzym wzmacniacz

• pośredniczą w powstawaniu odpowiedzi na hormony, mediatory lokalne i przekaźniki nerwowe

• inna nazwa to serpentynowy - bo układa się jak serpentyna

• receptory mają charakterystyczną budowę, w cząsteczce występuję 7 sekwencji hydrofobwych powtarzających się o budowie α-helisy

• ich struktura oparta jest na siedmiokrotnym przejściu pojedynczego łańcucha polipeptydowego przez dwuwarstwę lipidową.

• receptory sprzężone z białkiem G kontrolują:

• aktywność cyklazy adenylowej i syntezę cAMP

• aktywność fosfolipazy A₂ i syntezy kwasu arachidowego oraz jego metabolitów

• aktywność fosfolipazy C i syntezę 2 wtórnych przekaźników inf. IP₃ i DAG (ważne w komórkach mięśniowych)

• kanały jonowe np kanały Ca²⁺ i K⁺

• aktywność fosfodiesterazy cGMP (rodopsyna)

• receptory powiązane z białkiem G - kieszonka zlokalizowana jest zewnątrzkomórkowo i śródbłonowo

• istnieją setki odmiennych form receptorów białka G, a chemiczna różnorodność ligandów które wiążą się z tą rodziną receptorów jest niezwykła

• substancje aktywujące receptory metabotropowe:

• małe cząsteczki : katecholaminy

• peptydy, chemokiny

• światło

• Ca²⁺

• Hormony glikoproteinowe

Receptory metabotropowe: adrenergiczne (α_1A, α_1B, α_2A, α_2B, α_2C, α_2D, β₁, β₂, β₃), dopaminowe, serotoninowe, histaminowe (H₁, H₂, H₃), błonowe receptory melatoninowe, rodopsyna, muskarynowe receptory cholinergiczne, GABA_B.

Białko G łączy się z receptorem na 3 pętli wewnętrznej i zmienia jej konformację

Białko G - heterotrimer, zbudowany z 3 podjednostek: α, β, γ; w stanie niepobudzonym podjednostka α ma związany ze sobą GDP, a całe białko jest w stanie spoczynkowym, mogą być pobudzające bądź inhibitujące

• gdy zewnątrzkomórkowy ligand łączy się z receptorem, receptor wiąże się z białkiem G i aktywuje je wywołując zmianę GDP na GTP

• białko G rozpada się na dwa kompleksy αGTP i βγ

• kompleks αGTP ma aktywność GTP-azową (wywołuję ją cAMP) co prowadzi do ponownego powstania GDP i połączenia się obu jednostek białka G

• αGTP działa na układ wzmacniacza enzymatycznego (najczęściej cyklaza adenylowa) - dochodzi do wzmożonej produkcji substancji będącej informatorem II rzędu (najczęściej cAMP), która wywołuje różne efekty poprzez związanie się z kinazą zależną od cAMP-u i uwolnienie aktywnego enzymu

• aktywność może wykazywać także kompleks βγ

Podjenostki α:

• Gα_S - podjednostka stymulująca

• Gα₁ - podjednostka hamująca

• Gα₀ - podjednostka ta pośredniczy w zamykaniu kanałów Ca²⁺ i hamuje obrót IP

• Gα_T - podjednostka ta jest ulokowana w zewnętrznym segmencie fotoreceptorów - pręcików i pośredniczy w pobudzaniu fosfodiesterazy. Inne wyspecjalizowane podjednostki α narządów zmysłów są nazywane α-olf (ang. olfactory - zapach), czy α-gust (ang. gustation - smak)

Kompleks βγ

• może wspomagać α poprzez nasilanie czy zmniejszanie powinowactwa do nukleotydu GDP

• może aktywować odrębne rodziny enzymów (BARK)

• może bezpośrednio aktywować inne cząsteczki efektorowe takie jak kanały jonowe np. K⁺

• RECEPTORY Z BIAŁKIEM G INHIBITUJĄCE

• badano endotoksyny białkowe działające na białka G

• białka G są wrażliwe na toksyny bakteryjne

• toksyna cholery - działa na układ białek G, blokuje podjednostkę α stymulująca w stanie aktywnym, pozbawiając ją zdolności GTP-azy

• toksyna krztuśca - działa na układ białek G, blokuje podjednostkę α hamującą w stanie nieaktywnym, uniemożliwiając wymianę GDP na GT

RECEPTORY KATALITYCZNE (o aktywności enzymatycznej)

• są białkami transbłonowymi, których domeny wiążące ligandy znajdują się na zewnętrznej powierzchni błony, domena ta działa jak enzym

• związanie ligandu powoduje zbliżenie się w błonie dwóch cząsteczek receptora i wytworzenie ich dimeru co powoduje włączenie ich aktywności kinazowej

• O AKTYWNOŚCI KINAZY TYROZYNOWEJ

• wczesna i późna odpowiedź biologiczna

• rodzaj I - kinaza tyrozynowa stanowi element budowy takiego receptora - jest domeną wiążącą, powoduje fosforylację reszt tyrozyny co prowadzi do aktywacji następnych receptorów

• PGT - płytkowy czynnik wzrostu

• IGT - insulinopodobny czynnik wzrostu (insuliny)

• PDGF, EGF, IGF, UGF

• rodzaj II - w swojej budowie nie mają domeny zbudowanej z kinazy tyrozynowej, ale aktywują kinazy tyrozynowe niereceptorowe

• cytokiny (układ immunologiczny)

• interleukiny I, II, VI

• interferony

• TNF - czynnik martwicy nowotworu

• cząsteczka sygnałowa czyli czynnik wzrostu (dimer, dzięki któremu cały receptor ulega dimeryzacji)

• dochodzi do aktywacji kinazy tyrozynowej, która fosforyluje w tyrozynę

• aktywowany receptor działa na układ białka Ras

• Białko Ras

• monomer, należy do grupy białek o aktywności kinazy tyrozynowej

• łączy działalność białka G z receptorami o aktywności kinazy tyrozynowej

• białko to w stanie aktywnym (z GTP) inicjuje kaskadę kinaz, w której ostatnia kinaza działa na określone białka regulatorowe genów

• dochodzi do występowania nadaktywnego białka Ras, które powoduje, że mimo tego, że nie zostaje aktywowane przez układ receptorowy, zostaje aktywowane w wyniku patologicznych mutacji doprowadza do tego, że szlak przemian białkowych jest aktywowany - metabolizm komórki zostaje przestawiony na namnażanie (komórki nowotworowe)

• w 30% wszystkich nowotworów występujących u ludzi zauważono mutacje w obrębie białka Ras

• O AKTYWNOŚCI KINAZY SERYNOWO-TREONINOWEJ

• układ receptorowy występuje rzadko

• późna odpowiedź biologiczna

• mechanizm przekazywania sygnałów związany jest z białkami SMAD regulującymi ekspresję genów (inhibin/aktywin regulujących funkcje przysadki, TGF-β, białka morfogenetyczne kości BMP, regulujących powstawanie mezodermy)

• żeby aktywować receptor musi powstać tetramer (skupisko 4 receptorów)

• początkowo powstaje dimer zbudowany z 2 receptorów typu II (mają enzym kinazy serynowo - treoninowej)

• do dimeru przyłączają się 2 receptory typu I (mają domeny GS - glisyna i seryna)

• fosforylacja reszt serynowych w domenie GS - aktywacja kinaz serynowo - treoninowych i powstaje pełny tetramer

1

---