6. Kwasy nukleinowe

Wiadomości wstępne

Budowa

Kwasy nukleinowe są liniowymi polimerami podstawowych jednostek zwanych nukleo­tydami. Pojedynczy nukleotyd składa się z części powtarzalnej, którą tworzą cząsteczka pentozy (ryboza lub dezoksyryboza) i reszta kwasu fosforowego oraz części specyficznej, którą tworzy cząsteczka zasady azo­towej - pochodnej puryny (adenina, guanina) lub pirymidyny (cytozyna, tymina lub uracyl). Stosownie do rodzaju pentozy rozróż­niamy kwasy rybonukleinowe - RNA i kwasy dezoksyrybonukleinowe - DNA. W DNA występują zasady: adenina, tymina, cytozyna i guanina, natomiast w RNA zamiast tyminy występuje uracyl. Cząsteczka kwasu nukleinowego powstaje w ten sposób, że tworzy się wiązanie estrowe pomiędzy grupą -OH pentozy jednego nukleotydu i grupą fosforanową nukleotydu sąsiedniego. Specyficzna dla każdego nukleotydu zasada azotowa nie uczestniczy więc w powstawaniu cząsteczki kwasu nukleinowego (por. budowę aminokwasów i powstawanie białek przez łączenie się aminokwasów).

Struktura DNA

DNA stanowi pod­stawowy magazyn informacji genetycznej w organiz­mie. Informacja ta zakodowana jest w kolejności czyli sekwencji nukleotydów, a dokładniej w sekwencji zasad azotowych w kolejnych nukleotydach, którą analogicznie jak w białkach, nazywamy strukturą I rzędu. W komórkach eukariotycznych DNA zlokalizowany jest w jądrze komórkowym oraz w mniejszych iloś­ciach w mitochondriach i chloroplastach, zaś w komórkach prokariotycznych (nie posiadających jądra komórkowego) mieści się w centralnej części komórki. Strukturę II rzędu DNA stanowi, podobnie jak w białkach, struktura α, czyli prawoskrętna helisa polinukleotydów, przy czym w odróżnieniu od białka helisa DNA składa się z dwóch nici. Nici te zwinięte są tak, że ich zewnętrzną powierzchnię stanowią grupy fosforowo-cukrowe, zaś do środka helisy wystają prostopadle do jej osi - zasady azotowe. Obydwie nici wiążą się ze sobą przy pomocy wiązań wodorowych wytwarzanych pomiędzy leżącymi naprzeciwko siebie zasa­dami azotowymi. Wiązania te mogą powstać tylko wtedy, gdy zasady te nie leżą zbyt blisko ani zbyt daleko od siebie. Ten warunek jest spełniony tylko wtedy, gdy naprzeciwko zasady większej (purynowej) znajduje się zasada mniejsza (pirymidynowa) oraz, gdy naprzeciwko zasady azotowej z grupą C=O (z atomem tlenu z wolnymi parami elektronów) znajduje się zasada posiadająca w tym miejscu grupę aminową bogatą w atomy wodoru. Z tych dwu warunków wynika tzw. zasada komplementarności, tj. wymogu, aby naprzeciwko siebie w obydwu niciach występowały tylko dwa rodzaje par zasad azotowych: para AT (adenina - ty­mina) i para GC (guanina - cytozyna) (Rys. 6.1). Z reguły tej wynika, że struk­tura I rzędu jed­nej nici DNA (tj. sekwencja nukleotydów) określa w pełni strukturę drugiej nici. Jedna z tych nici jest nazwana nicią kodującą (sensowną, 5'→3'), ponieważ sekwencja nukleotydów tej nici zwana kodem genetycznym określa kolejność występowania aminokwasów w poszczególnych białkach. Druga nić natomiast - nić matrycowa (3'→5') wykorzystywana jest do przepisywania (transkrypcji) informacji genetycznej. Replikacji (namnażaniu) podlegają obydwie nici.

Jedynie kilka procent sekwencji cząsteczki DNA to sekwencje kodujące, zawierające geny, czyli odcinki, w których zapisana jest struktura różnych rodzajów RNA. Tylko część genów (tzw. geny konstytucyjne) koduje cząsteczki mRNA, na podstawie sekwencji których syntetyzowane są białka. Inne cząsteczki RNA uczestniczą natomiast w biosyntezie białka pośrednio. Najważniejszymi z nich są tRNA (transportowy RNA), rRNA (rybosomalny RNA) oraz miRNA (regulatorowy mikro RNA).

Rys. 6.1. Fragment helisy DNA

Pozo­stałej, niekodującej części DNA przypisuje się funk­cje regulatorowe lub też inną, nieznaną dotąd rolę, np. ochro­ny informacji genetycznej przed działaniem mutagenów, czyli czyn­ników zmieniających strukturę DNA, a więc zawartą w nim informację genetycz­ną. Warto przypomnieć jeszcze, że skok „śru­bowo nawi­niętych” dwóch nici polinukleotydowych wynosi 3,4 nm, na co składa się 10 par zasad, natomiast średnica helisy wynosi 2 nm.

DNA wy­twarza struktury wyższego rzędu, tzw. nukleosomy (Rys. 6.2), obejmujące około 150 par nukleoty­dów, nawiniętych na rdzeń składający się z 8 cząsteczek białek histonowych (po dwie cząsteczki z czterech rodzajów histonów grupy H2). Cząsteczka innego histonu (H1) zapobiega rozwijaniu się struktury nukleosomu.

Struktury nukleosomowe zwi­jają się następnie w tzw. superhelisę, która ostatecznie tworzy pętle o koń­cach przyłączonych do białek nukleoszkieletu (Rys. 6.3). Dzięki temu, pomimo ogro­m­nej iloś­ci infor­macji zmagazynowanej w DNA (np. sumaryczna długość DNA w jąd­rze ludzkiej komórki somatycznej sięga 2 m i zawiera 5,8 miliardów par nukleotydów), enzymy odczy­tujące tę informa­cję bezbłę­dnie odnajdują i kopiują w procesie transkrypcji każdy potrzebny gen „licząc” nie kolejne nukleotydy, ale „odliczając” całe pętle superhelisy, zawierające tysiące nukleotydów. W okresie poprzedzającym mitozę cząsteczki DNA nadal się kondensują i tworzą jeszcze grubsze struktury, i wskutek tego stają się znacznie krótsze, przyjmując pałeczkowaty kształt chromosomów. W tej „spakowanej” formie chromosomy mogą być rozdzielane do komórek potomnych.

Rys. 6.2. Nukleosomowa struktura DNA

Rys. 6.3. Superhelisa DNA.

Przed każdym podziałem komórkowym, w tak zwanej fazie S cyklu komórkowego, DNA ulega powieleniu, tak, by każda komórka potomna zawierała taką samą informację genetyczną. Proces powielenia (duplikacji) DNA nazywany jest replikacją. Przed replikacją struktura DNA ulega rozluźnieniu, mostki wodorowe pękają, a obie nici są rozplatane. Następuje wówczas odtworzenie obu nici równocześnie na zasadzie komplementarności zasad i powstają dwie kompletne cząsteczki DNA, przy czym każda składa się z jednaj tzw. starej i jednej dosyntetyzowanej, a więc nowej nici DNA, a każda z tych całych cząsteczek przechodzi do jednej z dwóch komórek potomnych. Ten sposób powielania DNA określany jest jako semikonserwatywne odtwarzanie kodu genetycznego.

Warunkiem zdolności DNA do replikacji jest jego luźna struktura, natomiast forma skondensowana, zwłaszcza do postaci chromosomów, jest nieaktywna transkrypcyjnie i metabolicznie.

Struktura RNA

Kwas RNA jest jednoniciowy, aczkolwiek nić ta zwykle ulega przestrzennemu zwinięciu. W niektórych rodzajach wirusów, tzw. wirusach RNA (retrowirusach i rybowirusach), stanowi on główny magazyn informacji genetycznej. W organizmach natomiast rozróżnianych jest kilka rodzajów kwasu rybonukleinowego. Matrycowy RNA (mRNA) jest syntetyzowany w jądrze komórkowym na podstawie informacji zapisanej na kodującej nici DNA w procesie transkrypcji, tj. przepisania informacji o strukturze konkretnego białka. W pierwszym eta­pie transkrypcji odpowiedni fragment cząsteczki DNA przepisy­wany jest na komplementarną strukturę pre-mRNA (hnRNA - heterogenny jądrowy RNA) i po wstępnej obróbce, po wycięciu fragmentów niekodujących tzw. intronów, informacja genetyczna przenoszona jest do cytoplaz­my. Do syntezy białek (proces ten nazywa się translacją) potrzebne są dalsze dwa rodzaje RNA: rybosomowy RNA (rRNA, który wytwarza strukturę rybosomów stano­wią­cych środo­wisko dla syntezy białek w cytoplazmie) i transportujący RNA (tRNA), któ­rego cząsteczki wiążą się specyficznie z określonymi amino­kwa­sami.

Struktura mRNA od­czyty­wana jest sekwencyjnie kolejnymi trójkami nukleotydów, przy czym każda trójka nukleotydów stanowi kodon, czyli informa­cję nie­zbęd­ną dla okre­ślenia rodzaju aminokwasu wbudowywanego w odpowiednie miejsce do syn­tety­zowa­nego białka. Ten związek pomiędzy strukturą genu w DNA, struk­turą od­powied­niego mRNA oraz strukturą powstającego białka nazywa się kodem gene­tycznym. Kod ten jest więc sekwencyjny (informacja odczyty­wana jest w stałej kolej­ności od aminokwasu N-końcowego do aminokwasu C-koń­cowe­go), trój­kowy (trzy nukleotydy stanowią informację wy­star­czającą do zako­dowa­nia jednego aminokwasu), uniwersalny (te same trój­ki nukle­oty­dów kodu­ją te same aminokwasy u wszystkich organizmów od bakterii do czło­wie­ka), nieprzekraczający (każdy nukleotyd wchodzi w skład tylko jed­nego kodonu, a więc nukleotydy w kolejnych kodonach nie nakładają się), oraz zdegenerowany (liczba mo­żliwych trójek nu­kleoty­do­wych przewyższa liczbę aminokwasów, stąd też niektóre amino­kwasy kodo­wane są przez więcej niż jeden kodon, a poza tym ist­nieją kodony puste, nie kodujące żadnego aminokwasu i stanowiące sygnał końca struk­tury białka). Reasumując, kod genetyczny umożliwia translację czyli „przetłumaczenie” informacji genetycznej zawartej w mRNA w postaci sekwencji nukleotydów na sekwencję aminokwasów zawartych w białkach.

Transportowy RNA (tRNA) jest nośnikiem aminokwasów na miejsce syntezy białek. Struktura tego kwasu przypomina kształtem liść koniczynki. W jego cząsteczce można wydzielić cztery nierówne pętle. Na jednym końcu łańcucha tRNA znajdują się trzy nukleotydy, których sekwencja decyduje o rodzaju aminokwasu, który będzie doczepiony do tego rodzaju tRNA. Z kolei na przeciwległym końcu cząsteczki znajduje się trójka nukleotydów nazywana antykodonem. Układ ich zasad jest komplementarny do zasad kodonu znajdującego się na mRNA, dzięki czemu specyficzny tRNA odszukuje właściwe miejsce dla transportowanego przez niego aminokwasu.

Pozostałe rodzaje cząsteczek RNA charakteryzujące się niewielką długością cząsteczek zaliczane do dwóch grup: RNA interferującego (np siRNA - small interfering RNA i miRNA - mikro RNA) oraz nieinterferującego (snRNA - small nuclear RNA, scRNA - small cytoplasmic RNA, snoRNA - small nucleolar RNA,) pełnią doniosłą rolę w regulacji odczytywania informacji genetycznej. Badania ich funkcji oraz znaczenia są obecnie wyznacznikiem w ostatnich latach postępu w dziedzinie biologii molekularnej.

Przyjmuje się, że RNA był pierwszym związkiem warunkującym ewolucję pojawiającym się w prakomórkach. Początkowo cząsteczki RNA realizowały zarówno funkcje gromadzenia jak i przekazywania informacji genetycznej, oraz funkcje katalityczne. Obydwie funkcje były jednak pełnione albo z niewystarczającą precyzją (przekazywanie informacji genetycznej) albo z niedostateczną efektywnością (funkcje katalityczne). Dlatego też w późniejszym etapie ewolucji funkcję przechowywania informacji przejął DNA, zaś funkcje katalityczne - białka enzymatyczne. Jednak do czasów współczesnych RNA spełnia nadal pewne ograniczone funkcje katalityczne (w tzw. rybozymach).

ĆWICZENIA

6.1. Hydroliza, wykrywanie składników kwasów nukleinowych

Zasada:

Po hydrolizie kwasów nukleinowych można wykrywać poszczególne ich składniki jak pentozę, kwas fosforowy i zasady azotowe.

Wykonanie:

Hydroliza kwasów nukleinowych: Do 5 cm³ 0,5 % roztworu RNA z drożdży dodać 5 cm³ 1 M HCl i ogrzewać na wrzącej łaźni wodnej przez 30 minut od momentu zagotowania.

a) Wykrywanie pentozy:

Do probówki nalać 2 cm³ odczynnika Biala i ogrzewać na łaźni wodnej przez ok. 3 min, a następnie dodać 1 cm³ hydrolizatu. Zamieszać i wstawić do łaźni wodnej. Po kilku minutach zanotować powstające zielononiebieskie zabarwienie.

b) Wykrywanie jonów ortofosforanowych:

Do 1 cm³ hydrolizatu dodać 2 cm³ 2,5% roztworu molibdenianu amonowego i całość ogrzać do wrzenia. Wy­twarza się żółty osad fosforomolibdenianu amonowego. Po dodaniu paru kropel 1% roztworu kwasu askorbinowego (witamina C) następuje re­duk­cja molibdenianu amonowego do mieszaniny tlenków molibdenu (Mo₂O₅⋅MoO₃), tzw. błękitu molibdenowego.

c) Wykrywanie zasad purynowych:

2 cm³ hydrolizatu ogrzać do wrzenia, dodać kilka kropel roztworu 0,25 M CuSO₄ i ostrożnie kroplami dodawać nasycony roztwór Na₂SO₃. W obecności puryn (Rys. 6.4) wytrąca się żółtobiały osad nierozpuszczalnych soli miedziowych I (miedziawych) puryn (Na₂SO₃ zredukował Cu²⁺ do Cu⁺).

Rys. 6.4. Wzory strukturalne zasad purynowych

6.2. Izolacja DNA z warzyw, owoców

Wykonanie:

Pomidor (zgnieść) lub jabłko (zetrzeć na tarce) a następnie umieścić w zlewce i dodać łyżeczkę płynu do mycia naczyń w celu emulgacji lipidów, a przez to dezintegracji błon cytoplazmatycznych. Zlewkę wraz ze zhomogenizowanym materiałem wstawić na 15 minut do łaźni wodnej (60°C) (Uwaga!!! temperatura nie może być zbyt wysoka, bowiem DNA może zdenaturować, z kolei nie może też być za chłodno, bo wtedy nie zdenaturuje RNA co sprawi, że izolowany DNA może być nim zanieczyszczony). Przełożyć do łaźni lodowej (szybko schłodzić) i dodać łyżkę stołową soli zmiękczającej do mięsa firmy „Kamis” (na tym etapie następuje wytrącenie białek, które podobnie jak DNA rozpuszczają się w wodzie). Otrzymany ekstrakt przesączyć przez lejek z sączkiem bibułowym. Wlać przesącz do naczynia (cylindra) zawierającego 50 cm³ alkoholu 96% (może być denaturat). Zaobserwować wytrącone białe „kłaczki” DNA.

6.3. Spektrofotometryczne oznaczanie zawartości kwasów nukleinowych i badanie ich czystości

Zasada:

Aromatyczne pierścienie purynowe i pirymidynowe (Rys. 6.5) absorbują światło w zakresie UV. Właściwość tę można zastosować do pomiaru stężenia RNA w roztworze. Wprawdzie poszczególne zasady różnią się nieco pod względem zakresem maksymalnej absorpcji UV, to jednak różnice te są niewielkie i można przyjąć, że 260 nm jest optymalną długością fali przy pomiarze ilościowym RNA.

Rys. 6.5. Wzory strukturalne pirymidyny i puryny

Spektrofotometrię w UV można wykorzystać również do ilościowych oznaczeń białek, jednak jedynie w przypadku, jeśli oznacza się zawartość konkretnego białka względem konkretnego wzorca (białko badane i wzorzec zawierać muszą taką samą ilość absorbujących UV aminokwasów aromatycznych; pomiar wykonuje się przy λ = 280 nm).

Wykonanie:

Sporządzanie krzywej kalibracyjnej

Do probówki wlać 3 cm³ roztworu wzorcowego (w 100 cm³ buforu octanowego o pH = 5,5 rozpuścić na gorąco 10 mg RNA z drożdży) i dolać do niego 3 cm³ buforu octanowego uzyskując stężenie 100 μg RNA w 1 cm³. Po zmieszaniu powtórzyć rozcieńczanie tą samą metodą pobierając do nowej probówki 3 cm³ roztworu z poprzedniej probówki i uzupełnić 3 cm³ buforu octanowego, uzyskując kolejne stężenia RNA: 50; 25; 12,5; 6,25; 3,1; 1,5 μg w 1 cm³. Z każdego rozcieńczenia wzorcowego pobrać po 1 cm³ do kuwetki spektrofotometrycznej ze szkła kwarcowego (przepuszczającego promienie UV) i zmierzyć absorbancję przy długości fali 260 nm względem ślepej próby (sam bufor octanowy).

Pomiar stężenia RNA w nieznanym roztworze

Do kuwetki spektrofotometrycznej wlać 1 cm³ roztworu RNA i zmierzyć absorbancję przy λ=260 nm względme ślepej próby (bufor octanowy).

Sprawozdanie

a) Za pomocą arkusza kalkulacyjnego MS Excel wykreślić krzywą kalibracyjną i wyznaczyć równanie regresji liniowej zależności absorbancji od stężenia RNA (wzorca).

b) Odczytać stężenie RNA nieznanych roztworów z równania regresji liniowej (x), podstawiając pod y odczytaną absorbancję.

96

---