METODY STERYLIZACJI

Zabijanie mikroorganizmów, czyli nieodwracalnie pozbawiane ich zdolności

do wzrostu, jest podstawową częścią metod mikrobiologicznych

i konserwacji żywności, wymaga więc dokładnego omówienia. Sterylizacja

albo wyjaławianie jest procesem polegającym na pozbawianiu dowolnego

materiału wszystkich żywych organizmów oraz ich form przetrwalnych.

Należy odróżniać sterylizację od częściowej sterylizacji (np. pasteryzacji)

oraz konserwacji. Jeżeli sterylne podłoże lub takie, które ma być

zaszczepione pewnym typem mikroorganizmów, zostanie zanieczyszczone

innymi, nie dodanymi specjalnie drobnoustrojami, mówi się wówczas

o zakażeniu lub kontaminacji. Takie pojęcia jak dezynfekcja (zabicie

wszystkich patogennych mikroorganizmów), aseptyka, antyseptyka

i infekcja są częściej używane w higienie niż w mikrobiologii.

Mikroorganizmy różnią się wrażliwością na różne metody sterylizacji.

Różnice te są związane z gatunkiem, lecz zależą także od zawartości

wody, pH środowiska, wieku komórek, przetrwalników itp. Szybkość

zamierania zależy więc od pewnej liczby czynników zarówno środowiskowych,

jak i związanych z typem mikroorganizmu. Zamiast określenia

szybkości zamierania stosuje się często określenie stopnia uśmiercenia

danej populacji w danych warunkach, co wyraża się wartością D10, czyli

czasem niezbędnym do zabicia 90% komórek, zwanym też czasem

dziesięciokrotnej redukcji Z)10 (tab. 6. 5). Sterylizację lub częściową

sterylizację można przeprowadzić stosując „wilgotne gorąco", „suche

gorąco", filtrację, promieniowanie lub metody chemiczne.

„Wilgotne gorąco". Komórki wegetatywne większości bakterii i grzybów

giną w temperaturze ok. 60°C w ciągu 5-10 minut, formy przetrwalne drożdży

i grzybów dopiero powyżej 80°C, natomiast spory bakteryjne wymagają czasu

ok. 15 minut w temperaturze 120°C. Czasy dziesięciokrotnej redukcji podane

w tabeli 6. 5 pozwalają obliczyć niezbędny czas ekspozycji na wilgotne gorąco

kilku wytwarzających spory, bardzo ciepłoopornych bakterii. Należy jednak

pamiętać, że program sterylizacji zależy także od stopnia skażenia i że większa

liczba termoopornych przetrwalników wymaga dłuższego czasu sterylizacji.

Aby osiągnąć temperatury powyżej punktu wrzenia wody pod ciśnieniem

atmosferycznym, musi być zastosowany autoklaw — pojemnik, który

umożliwia ogrzewanie pod zwiększonym ciśnieniem.

Aktualna temperatura pary (wytwarzanej z wody) w autoklawie zależy

od ciśnienia (ryc. 6. 15), ale temperatura przy danym ciśnieniu jest

znacznie niższa, jeśli znajduje się w komorze jakakolwiek ilość powietrza.

Ponieważ efektywność sterylizacji zależy od temperatury, a nie od

ciśnienia, należy zapewnić usunięcie powietrza ze sterylizatora. Dokonuje

się tego przez otwarcie zaworu podczas początkowego ogrzewania, tak

aby usunąć powietrze wraz ze strumieniem pary, lub za pomocą pompy

próżniowej. Siedzenie temperatury w autoklawie byłoby właściwsze niż

śledzenie ciśnienia, lecz dzięki prostocie i ze względów bezpieczeństwa

bardziej popularne jest rejestrowanie ciśnienia. Niezbędny czas procesu

sterylizacji zależy także od wielkości aparatu (pojemności cieplnej)

i naczyń, które mają być sterylizowane (odpowiednie dane przytoczono

w tab. 6. 6)

Podobny efekt można uzyskać stosując sterylizację etapową, czyli

tyndalizację. Polega ona na ogrzewaniu podłoży i roztworów przez trzy

kolejne dni w temperaturze 100°C przez 30 minut i pozostawianie ich

w temperaturze pokojowej w okresach pomiędzy ogrzewaniami, tak aby

mogło nastąpić kiełkowanie przetrwalników, a powstałe w ten sposób

formy wegetatywne mogły być uśmiercone przy kolejnym podniesieniu

temperatury do 100°C.

Do wielu celów może być wystarczające zniszczenie tylko wegetatywnych

form mikroorganizmów (częściowa sterylizacja). Takim przykładem

jest proces pasteryzacji, ogrzewanie w temperaturze 75-80°C

przez 5-10 minut. Na przykład mleko jest zazwyczaj pasteryzowane i to

nawet przez krótszy czas, aby nie zanikły jego wartości smakowe. Do

pasteryzacji mleka stosuje się najczęściej dwie metody: krótkoczasową

(20 s, 71, 5-74°C) i wysokotemperaturową (2-5 s, 85-87°C). Sterylizację

mleka przeprowadza się metodą zwaną UHT (ultra high temperature).

W metodzie tej przegrzana para jest wtryskiwana do mleka,

wytwarzając temperaturę 135-15O°C, w której mleko pozostaje przez

1-2 s, a następnie jest rozpylane przez specjalną dyszę z jednoczesnym

chłodzeniem, podczas którego zostaje usunięta woda wprowadzona przy

wstrzyknięciu pary.

Częściowa sterylizacja zachodzi również podczas konserwacji jagód

i owoców pestkowych. Ogrzewanie słoja przeznaczonego do wekowania

przez 20 min w temperaturze 80°C zabija wszystkie komórki wegetatywne

i spory grzybów, chociaż przetrwalniki bakterii pozostają żywe. Jednakże

niskie pH związane z kwasowością pewnych owoców hamuje ich kiełkowanie.

Zakonserwowane owoce często utrzymują się przez lata mimo

obecności bakteryjnych przetrwalników. Właściwie nie ma takich przetrwalników

bakterii, które mogłyby kiełkować w pH poniżej 4, 5. Owoce

i warzywa o mniejszej kwasowości (fasola, groszek, marchew, grzyby)

także mogą być konserwowane przez pasteryzację, jeśli doda się do nich

1 czy 2 łyżki octu w celu zapewnienia wystarczająco niskiego pH.

Truskawkowa pleśń Byssochlamys nivea często jest spotykana w pasteryzowanych

truskawkach. Askospory tego grzyba wytrzymują temperaturę

do 86°C. W tej temperaturze ich wskaźnik D10 wynosi 14 minut.

„Suche gorąco". Zniszczenie bakteryjnych spor przez zastosowanie

suchego gorąca wymaga wyższych temperatur i dłuższego czasu ekspozycji

niż sterylizacja wilgotnym gorącem (tab. 6. 7). Przedmioty i produkty,

które są stosunkowo niewrażliwe na wysokie temperatury, jak szklane

naczynia, proszki, oleje itp., mogą być sterylizowane przez ogrzewanie

w ciągu 2 godz. w temperaturze 160°C w suchym sterylizatorze lub

w suszarce. Dla materiałów o dużej pojemności cieplnej lub właściwościach

termoizolacyjnych należy uwzględnić czas konieczny do osiągnięcia

temperatury sterylizacji. Zaleca się, aby zawsze obecny był wskaźnik

sterylizacji lub próba kontrolna zawierająca glebę z przetrwalnikami.

Ogrzewanie w 180°C przez 30 min może być stosowane tylko wówczas,

gdy sterylizowane materiały są odporne na tę temperaturę. Doświadczenie

wykazuje, że w takich warunkach wszystkie przetrwalniki zostają zabite.

Letalne działanie ciepła polega na koagulacji białek komórkowych.

Filtrowanie. Roztwory zawierające związki wrażliwe na temperaturę

(witaminy, niektóre aminokwasy, cukry i inne substraty) najwygodniej

jest sterylizować przez filtrowanie. Do tego celu już w laboratorium

Pasteura była używana nieglazurowana porcelana (świece Chamberlanda).

Obecnie w wielu laboratoriach i do sterylizacji wody używa się filtrów

z prasowanej ziemi okrzemkowej. Oprócz tego stosuje się też filtry ze

spiekanego szkła i filtry membranowe. Filtry membranowe z nitrocelulozy

i innych materiałów są wytwarzane o różnej średnicy porów,

a więc za ich pomocą mogą być oddzielane mikroorganizmy o różnej

wielkości i kształcie. Możliwość przyłączenia jednokierunkowych filtrów

membranowych do strzykawki zapewnia szybką rutynową sterylizację

roztworów, które nie przetrzymałyby sterylizacji cieplnej. Cząstki

wirusowe mają, niestety, zdolność przechodzenia przez filtry membranowe.

Należy zwrócić uwagę, że cukry takie jak glukoza i fruktoza

w czasie autoklawowania czy nawet gotowania mogą ulegać hydrolizie

i innym przekształceniom. Glukoza ma najwyższą stabilność w zakresie

pH 3-5, w którym może być autoklawowana w wodnych roztworach.

Jednakże w pH8 podczas 30-minutowego gotowania 40% glukozy

przekształca się we fruktozę. Sole metali (Fe, Mn, Mo, itp. ) przyspieszają

tę przemianę. Ponieważ fruktoza w tych warunkach jest następnie

przekształcana w kwasy huminowe, pożywka poddana takim zabiegom

brązowieje lub czernieje.

Naświetlanie. Spośród wielu różnych rodzajów promieniowania (UV,

promienie X i gamma) stosowanych niekiedy do całkowitej lub częściowej

sterylizacji, największe zastosowanie w laboratorium ma promieniowanie

ultrafioletowe (UV). Większość lamp UV wytwarza promieniowanie

w zakresie długości fal ok. 260 nm wybiórczo absorbowane przez kwasy

nukleinowe, skutkiem czego jest letalne działanie na bakterie poddane

dłuższej ekspozycji (rozdz. 15. 1. 4 i ryc. 14. 3). Promieniowanie UV

stosuje się do częściowej sterylizacji pomieszczeń, gdzie bakterie zabijane

są szybko, lecz zarodniki grzybów, mniej wrażliwe na UV, giną znacznie

wolniej.

Promieniowanie jonizujące. Promienie X, promieniowanie UV i promienie

gamma (np. 60Co) działają dzięki wytwarzaniu rodników hydroksylowych

atakujących makrocząsteczki. Nawet bardzo małe dawki promieniowania

okazują się wystarczające do zniszczenia komórek. Tłumaczy to

fakt, że w większości komórek znajduje się tylko jedna kompletna kopia

DNA, podczas gdy większość białek i polisacharydów występuje w wielu

kopiach. Tak więc pojedynczy atak na cząsteczkę DNA prowadzi do

śmierci komórki bez żadnych obserwowalnych zmian w innych cząsteczkach.

Dlatego też promieniowanie jonizujące może mieć zastosowanie do

sterylizacji żywności i innych stałych materiałów.

Metody chemiczne. Stwierdzono, że sterylizacja za pomocą tlenku

etylenu jest bardzo wygodna do sterylizacji żywności, lekarstw, instrumentów

i aparatów. Tlenek etylenu zabija zarówno formy wegetatywne,

jak i przetrwalniki, ale jest skuteczny tylko w obecności wody (co

najmniej 5-15%). Jest on używany w mieszaninie z azotem lub dwutlenkiem

węgla w postaci gazu zawierającego 2-50% tlenku etylenu.

Inny związek, β-propionolakton został wprowadzony do sterylizacji

pożywek i termolabilnych materiałów. Jest on znacznie aktywniejszy niż

tlenek etylenu, ale uważa się, że jest karcenogenny i wywołuje inne efekty

uboczne. Jest on dodawany w końcowym stężeniu 0, 2% do pożywki,

która jest następnie inkubowana 2 godz. w 37°C. Podczas przechowywania

do następnego dnia propiolakton ulega całkowitej degradacji. Węglowodany

pozostają nienaruszone. Napoje mogą być sterylizowane

z użyciem dietylodiwęglanu (0, 003-0, 020%).

Tradycyjne środki bakteriobójcze, takie jak woda bromowa (1%),

sublimat, czyli HgCl2 (1% roztwór w alkoholu), azotan srebra (0, 5%) lub

podchloryn wapnia stosuje się do zewnętrznej sterylizacji nasion, z których

można wyhodować sterylne rośliny. Zabieg ten trwa 5-30 min, jednakże

przed jego zastosowaniem należy doprowadzić powierzchnię nasion do

pełnej zwilżalności. Można to osiągnąć przez ich wstępne przemywanie

mydłem lub innymi środkami powierzchniowo czynnymi.

Aby umyć szklane naczynie i pozbawić je żywych mikroorganizmów,

wystarczy zastosować odpowiedni detergent, np. SDS (sodowy dodecylosiarczan)

rozpuszczony w gorącej wodzie, lub nawet zwykły

domowy preparat do mycia naczyń. Resztki środków myjących muszą

jednak być usunięte, w zależności od planowanego zastosowania

szkła, przez wielokrotne płukanie w czystej, najlepiej destylowanej

wodzie.

Procedury konserwujące

Substancje organiczne ulegają biologicznej degradacji, jeśli nie zostaną

zabezpieczone przed działalnością i namnażaniem się mikroorganizmów.

Znane są liczne procedury służące do zabezpieczenia i zakonserwowania

substancji pochodzenia organicznego. Do najważniejszych należą metody

zabezpieczania żywności i środków spożywczych. Problemami tymi

zajmuje się mikrobiologia żywności.

Zepsucie żywności przeznaczonej do spożycia dla ludzi może następować nie tylko

w wyniku degradacji prowadzonej przez mikroorganizmy, lecz także skażenia toksynami

wytwarzanymi przez bakterie lub grzyby. Do najważniejszych „producentów" toksyn

spotykanych w żywności należy Clostridium botulinum i kilka gatunków Staphylococcus.

Pierwszy z nich produkuje śmiertelną egzotoksynę atakującą układ nerwowy — neurotoksynę.

Gronkowce wytwarzają enterotoksynę odpowiedzialną za zatrucia pokarmowe

i działającą głównie na przewód pokarmowy. Niektóre grzyby wytwarzają mikotoksyny,

wśród których aflatoksyna produkowana przez Aspergillus flavus jest chyba najszerzej

znana.

Procedury konserwujące mające na celu zabezpieczenie żywności przed

zepsuciem wywołanym przez mikroorganizmy wykorzystują różne możliwości

oparte na metodach fizycznych i chemicznych.

Metody fizyczne. Sterylizacja cieplna została już omówiona powyżej. Żywność w metalowych

puszkach jest zazwyczaj autoklawowana. Kwaśne soki owocowe są trwałe,

nawet jeśli były pasteryzowane tylko tak, że komórki wegetatywne zostały zabite,

a spory pozostały żywe, gdyż endospory bakterii nie mogą kiełkować w kwaśnym

środowisku.

Filtracja sterylizująca przez mikropory w krążkach prasowanego azbestu lub celulozy jest

stosowana do jałowienia soków owocowych, wód mineralnych i leków. Wirowanie

i filtracja mają też zastosowanie do przerywania fermentacji wina na odpowiednim etapie,

tak aby pozostawić pewien poziom cukru.

Powszechnie stosowana starożytna metoda polegająca na suszeniu pewnych typów

żywności opiera się na fakcie, że wzrost mikroorganizmów wymaga określonej zawartości

wody (zazwyczaj powyżej 10%). Płatki owsiane, suszone owoce, siano i produkty

silosowane zawdzięczają swoją trwałość stanowi wysuszenia, ale po wystawieniu na

działanie wilgotnego powietrza i pochłonięciu wody są one natychmiast atakowane przez

pleśnie i bakterie.

Napromieniowywanie środków spożywczych ma jak dotychczas ograniczone zastosowanie.

Promienie UV są stosowane głównie do sterylizacji powietrza i pomieszczeń

w mleczarniach, chłodniach, dużych piekarniach i innych tego rodzaju zakładach.

W niewielkim stopniu wykorzystuje się możliwość zastosowania promieniowania jonizującego

do żywności. Nieszkodliwość naświetlania promieniami gamma została przetestowana

i ustalona w kilku przypadkach. Są także dowody, że niewielkie dawki promieniowania

potrzebne do sterylizacji nie wywołują znaczących zmian w sterylizowanych

produktach.

Bezpieczną metodą, coraz częściej stosowaną w gospodarstwach domowych i konkurującą

z wekowaniem, jest przechowywanie w niskich temperaturach. Niskotemperaturowe

zamrażarki i głęboko mrożące magazyny chłodnie utrzymują zamrożone produkty w temperaturze

poniżej — 20°C. Przechowywanie żywności w tych temperaturach nie zmniejsza

w poważniejszym stopniu ilości żywych mikroorganizmów ani nie niszczy ich toksyn, ale

całkowicie hamuje wzrost bakterii. Nawet bakterie psychrofilne nie są w stanie rosnąć

w temperaturze poniżej — 12°C.

Metody chemiczne. Konserwowanie przez zakwaszenie opiera się na tym, że tylko kilka

mikroorganizmów może rosnąć w niskim pH w warunkach beztlenowych. Do pozbycia się

ich wystarcza zazwyczaj pasteryzacja, a termooporne spory nie mogą wykiełkować w pH

poniżej 4. Naturalny sposób konserwowania przez zakwaszenie jest wykorzystywany

w produkcji kiszonej kapusty i ogórków lub wędlin typu salami i serwolatka. W wielu

przypadkach dodaje się kwasu octowego, mlekowego, cytrynowego czy winowego.

Zakwaszone, ale nie pasteryzowane produkty ulegają jednak zepsuciu pod wpływem

drożdży i innych grzybów w warunkach tlenowych.

Do konserwacji mięsa i produktów rybnych stosuje się wędzenie. Proces ten polega na

zmniejszeniu zawartości wody oraz nasyceniu produktów takimi substancjami zwalczającymi

drobnoustroje, jak fenole, krezole, aldehydy, kwas octowy i mrówkowy.

Solenie przeprowadza się przez zanurzenie konserwowanej żywności w 14-25% roztworze

soli kuchennej. Zabieg ten prowadzi do zmniejszenia zawartości wody oraz zahamowania

wzrostu mikroorganizmów powodujących psucie. W warunkach tych może się rozmnażać

zaledwie kilka rodzajów halofilnych bakterii.

Cukier w dużym stężeniu (50%) jest inhibitorem wzrostu. Tak więc zabezpieczenie

dżemów, marmolad i syropów jest przede wszystkim wynikiem ich kwasowości i zawartości

cukru.

Do zabezpieczenia przed psuciem niektórych produktów spożywczych konieczne są

środki chemiczne. W winach tradycyjnie stosuje się dodatek siarczynu. Soki i wina można

też konserwować dodatkiem dietylodiwęglanu.

Inne metody zabezpieczania produktów spożywczych polegają na dodawaniu kwasu

sorbowego, benzoesowego i mrówkowego. Powierzchnię owoców cytrusowych zabezpiecza

się za pomocą difenylu lub o-fenylofenolanu. Wreszcie, w celu zahamowania wzrostu

bakteryjnego były podejmowane próby zastosowania antybiotyków.

---