1

0*0. Zastosowanie enzymów do ilościowej analizy metabolitów-oznaczanie stężenia glukozy w materiale biologicznym

A. Oznaczanie stężenia glukozy w surowicy krwi, kiełkach kukurydzy, i komórkach wątroby z użyciem heksokinazy i dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu

Enzymy są doskonałym narzędziem stosowanym w analizie wielu związków. Wykorzystuje sieje w analizie żywności, leków i diagnostyce medycznej. Szczególnie użyteczne są enzymy w badaniach biochemicznych i biotechnologicznych. W biochemii stosuje się je do analizy metabolitów (alkohol, glukoza, fruktoza, 2,3 difosfoglicerynian, kreatynina, cholesterol, C02 itd.). Metody analityczne z udziałem enzymów charakteryzują się wysoką specyficznością, powtarzalnością, szybkością i ogromna czułością. Dzięki specyficzności enzymów analiza może być wykonywana w homogenatach, płynach fizjologicznych i nie oczyszczonych próbach, a wysoka czułość pozwala na użycie do badań niewielkich ilości materiału. W oznaczeniach z udziałem enzymów bardzo często reakcje sprzężone są z procesami fosforylacji lub defosforylacji oraz utlenieniem lub redukcją NAD lub NADP. Enzymy stosuje się do analizy ilościowej cukrów tj. glukozy, fruktozy lub skrobi. W analizie glukozy wykorzystuje się enzymy metabolizujące ten cukier w cyklu glikolitycznym: heksokinazę i dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu (glikoliza, cykl pentozofosforanowy) ( 1 ), lub utlenienia glukozy z udziałem oksydazy glukozy sprzężone z aktywnością peroksydazy.

heksokinaza

1.    glukoza+ ATP -► glukozo-6-fosforan + ADP

dehydrogenaza

glukozo-6-fosforanu

glukozo-6-fosforan + NADP⁺ -► 6-fosfoglukonian + NADPH + H⁺

Powyższe reakcje prowadzą do spadku poziomu NAD i wzrostu poziomu NADH w mieszaninie reakcyjnej. Ilość powstającego w reakcji NADH jest proporcjonalna do ilości glukozy. Ilość glukozy wyznaczamy na podstawie rosnącej absorbancji próby mierzonej w X = 340nm. Zmiany te wynikają z tego, że widmo adsorpcyjne NAD i NADH jest różne. NAD⁺ posiada jedno maksimum absorbancji przyX= 260 nm a powstający po redukcji NADH zyskuje dodatkowy szczyt absorbancji w X= 340nm.

1. Odczynniki:

I. 5MHC10₄ 2.2,5M KOH

3.    100 mM bufor tris/HCl pH 8,0

4.    lOmMATP 5.3mMNADP⁺

6.    Mieszanina heksokinaza 140U/mI i dehydrogenaza glukozo-6-fosforanu 1 U/ml w lOOmM buforze Tris Cl" pH 8,0 + 0,9% albumina + 0,05% NaN3

7.    lOOmMMgClz

II.    Materiał:

1.    Osocze krwi

2.    Wątroba

3.    Kiełki pszenicy lub kukurydzy