4

MATERIAŁ I METODY

Odczynniki:

•    0,25 M bufor Tris-octan pH 5,5

•    0,5 M bufor Tris-octan pH 5,5

•    1 mM p-nitrofenol w 0,25 M buforze Tris-octan pH 5,5

•    1 mM p-nitrofenylofosforan w 0,5 M buforze Tris-octan pH 5,5

•    10 mM p-nitrofenylofosforan w 0,5 M buforze pH 5,5

•    0,1 M NaOH

•    0,9 % NaCl

•    wyciąg z ziemniaka

WYKONANIE

A.    Wyznaczanie krzywej standardowej dla p-nitrofenolu

Z roztworu podstawowego (ImM p-nitrofenol w 0,25 M buforze Tris-octan pH 5,5) przygotuj po 2 ml roztworów o następujących stężeniach: 0,05 mM; 0,1 mM; 0,2 mM; 0,3 mM; 0,4 mM; 0,5 mM. Do 12 suchych probówek wiej po 0,5 ml roztworów p-nitrofenolu o odpowiednim stężeniu (przygotuj 2 próby dla każdego stężenia). Próba kontrolna zawiera 0,5 ml 0,25mM buforu Tris-octan pH 5,5. Do wszystkich prób dodaj po 2,5 ml 0,1 M NaOH. Natężenie uzyskanej barwy zmierz przy X = 405 nm wobec próby kontrolnej.

Na podstawie otrzymanych wyników wykreśl krzywą kalibracyjną, odkładając na osi rzędnych absorbancję, a na osi odciętych stężenie p-nitrofenolu.

Oblicz współczynnik kalibracji:

stężenie p-nitrofenolu [pmole/ml]

K    1 _cm

A 405nm

B.    Przygotowanie wyciągu z ziemniaka

Obrany i umyty ziemniak zetrzeć na tarce, przesączyć przez warstwę nylonu. Rozcieńczyć 100 razy 0,9 % roztworem NaCl do objętości 25 ml (w kolbce).

4