BA RE CW01 ds1 cw0p01753

szaro w, określa się je jako „regiony hyperzmienne” (Vl-V9). Zmienne sekwencje VI-V8 scharakteryzowano u ponad 100 gatunków bakterii. Różna dynamika zmian w obrębie różnych części rRNA wynika ze zróżnicowanej funkcji poszczególnych fragmentów 16S rRNA. W zależności od obszaru, który zostanie wybrany do analiz, można badać przynależność na poziomie gatunku lub szczepu. W przypadku różnych drobnoustrojów zróżnicowana jest przydatność poszczególnych regionów hyperzmiennych. Region VI wykorzystywany jest do różnicowania szczepów Staphylococcus aureus, analiza V2 sprawdza się przy identyfikacji gatunków Mycobacterium, a V3 - gatunków Haemophilus. Obszar V6, złożony z 58 nukle-otydów, może służyć do różnicowania wszystkich gatunków bakterii z wyjątkiem pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae.

Metoda hybrydyzacyjna (H-rybotypowanie)

Jest to najstarszy wariant rybotypowania, przebiega wg klasycznego schematu metody fingerprinting przedstawionej na rys. 11 w skrypcie. Z hodowli analizowanych szczepów bakterii izolowany jest całkowity DNA, który następnie jest trawiony enzymem restrykcyjnym. Wybiera się taki enzym restrykcyjny, który posiada jedno miejsce cięcia w genie rrs, a drugie w genie rrl. Często używanym enzymem jest EcoRI, niekiedy Haell. Po trawieniu całkowitego DNA bakterii powstaje bardzo wiele prążków, które tworzą gęstą drabinkę w żelu agaro-zowym. Dla tego eksperymentu istotne są tylko te, które zawierają operon rrn. Na rysunku 2 przedstawiono operony rrn występujące w genomie Haemophilus influenzae. Jak wspomniano wyżej, bakterie tego gatunku posiadają 6 operonów rrn, które niosą 2 warianty obszaru polimorficznego; mniejszy posiada jedną kopię genu tRNA, a większy 2 kopie tego genu. Trawienie enzymem EcoRI powoduje powstawanie prążków o wielkości 1503 pz i 1748 pz. Obecność tych prążków jest charakterystyczna dla gatunku H. influenzae. Wielkość wszystkich innych prążków obserwowanych w eksperymencie wynika z lokalizacji, przed i za genem, najbliższego miejsca cięcia dla enzymu EcoRI. Na rysunku 2 pokazano ułożenie miejsc cięcia dla szczepu H. influenzae Rd. Tak więc w tym przypadku rybotypowania analizowany jest polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) dla sekwencji otaczających operony rrn. Otoczenie operonów nie jest konserwowane ewolucyjnie, obszary te charakteryzują się więc dużą zmiennością i zastosowanie tej techniki pozwala na identyfikację szczepów Ii. influenzae.

Po trawieniu całkowitego DNA enzymem EcoRI wykonywana jest elektroforeza w żelu agarozowym, po czym materiał jest przenoszony na filtr nylonowy. Po denaturacji filtr zo-

3