CCF20091110002

ROZDZIAŁ LIPIDÓW MÓZGU ŚWIŃSKIEGO METODĄ CHROMATOGRAFII CIENKOWARSTWOWEJ (TLC)

Tkanka nerwowa zawiera znaczne ilości różnych lipidów takich jak: tłuszcze właściwe (acyloglicerole), tłuszcze złożone: fosfolipidy (lecytyny, kefaliny, fosfatydyloseryny, sfingolipidy), cerebrozydy, gangliozydy oraz pochodny tłuszczów cholesterol. Celem poznania składu jakościowego i ilościowego lipidów w badanym materiale, związki te należy wyekstrahować stosując różne niskowrzące, najczęściej nie mieszające się z wodą rozpuszczalniki organiczne jak : eter i chloroform, octan etylu ale również aceton, etanol i metanol lub mieszaniny tych rozpuszczalników. Często z dobrym skutkiem do ekstrakcji stosuje się mieszaninę chloroform -metanol.

Zasadniczo wstępnie należy odwodnić tkankę i ekstrakcji poddać wysuszony preparat np. w aparacie Soxhleta. Należy pamiętać że nienasycone tłuszcze są nietrwałe i do badań strukturalnych proces ekstrakcji należy wykonywać w atmosferze azotu

Wyekstrahowane tłuszcze rozdziela się najczęściej metodami chromatograficznymi, technika chromatografii cienkowarstwowej na żelu krzemionkowym jest bardzo często stosowana z uwagi na szybkość i efektywność rozdziału.

Rozdzielone tłuszcze identyfikuje się na podstawie ich ruchliwości i porównanie z wzorcami oraz na podstawie charałyterystycznych reakcji.

Odczynniki:

1.    Mieszanina do ekstrakcji - chloroform : metanol, (1:1 v/v)

2.    Układy rozwij aj ące:

A)    chloroform : metanol: woda (14:6: 1 v/v/v)

B) chloroform : metanol: amoniak : woda ( 60 : 35 : 7 : 2,8 v/v/v/v)

C) chloroform : metanol: kwas octowy : aceton : woda 50 : 10 : 10 : 20 : 5 v/v/v/v/v)

3.    Żel krzemionkowy Silica gel 60 na folii aluminiowej (Merck DC-Fertigpłatten Silica gel 60)

4.    0,1 M roztwór KC1

5.    Wzorcowe roztwory lecytyny, kefaliny i cerebrozydów ( 3 mg/ml) w rozpuszczalnku (1), cholesterol (3 mg/ml) w etanolu

6.    Odczynniki do wybarwiania chromatogramów:

A) Odczynnik ogólny na tłuszczowce: 0,04% roztwór błękitu bromotymolowego w 0,0IM roztworze NaOH

' ■ B) Odczynnik ogólny na tłuszczowce: 20% roztwór siarczanu amonu

C)    Odczynnik do wykrywania fosforanów:

a)    1 g molibdenianu amonu w 8 ml wody destylowanej

b)    stężony HC1

c)    12 M kwas nadchlorowy

d)    aceton

Podane roztwory zmieszać bezpośrednio przed użyciem w stosunku objętościowym : a: b : c : d 8 : 3 : 3 : 36

D)    Odczynnik ninhydrynowy - 0,1% roztwór ninhydiyny w acetonie i 4% kwasie octowym

E)    Odczynnik na cholinę - 0,2 g dipikryloaminy rozpuścić w 100 ml 50% acetonu (Uwaga ! dipikryloamina jest silnie wybuchowa !)

Sprzęt:

1.    Komora do chromatografii cienkowarstwowej

2.    Spryskiwacz

3.    Mikropipeta automatyczna 20 ul i końcówki

4.    Rozdzielacz 500 ml

5.    Eksykator do barwienia w parach jodu