img031

celuloza

etanol

paliwo

chemikalia

produkty biotechnologiczne farmaceutyki

2. Cel ćwiczenia

%    W-'*:-

.Celem ćwiczenia jest poznanie dwóch podstawowych kierunków biokonwersji

materiałów celulozowych:

-    biosyntezy enzymów celulolitycznych i białka mikrobiologicznego (SCP i MBP)

-    enzymatycznej hydrolizy odpadów celulozowych.

•PN7.    *

3. Ząkres ćwiczenia

•    biosynteza enzymów celulolitycznych na podłożach zawierających odpady celulozowe oraz oznaczanie aktywności endo-l,4*p-glukanazy w płynach pohodowlanych

•    enzymatyczne scukrzanie pyłu bawełnianego oraz odpadów po produkcji ekstraktów kawy

•    fermentacja etanolowa enzymatycznych hydrolizatów celulozy.

4. Wykonanie ćwiczenia.

4.1. Hodowla pleśni Aspergillus niger na podłożach zawierających:

pył bawełniany (statyczne warunki hodowli, czas hodowli 10 dni) celulozę^k^igj^t^^^l^il^y^j^głębna, czas hodowli 5 dni)

Podłoża hodowlane wzbogacono w kiełki słodowe, (źródło azotu), ekstrakt z otrąb pszennych oraz sole mineralne. Po sterylizacji, podłoża zaszczepiono zawiesiną zarodników pleśni Aspergillus niger. Po skończonej hodowli odzielono części stałe podłoża od filtratu, stanowiącego roztwór enzymów celulolitycznych.

CWpcłOłf

•VCbiu>0 l^aoO-i

4.2. Oznaczanie w filtratach z podłoża hodowlanego aktywności endo-1,4-p-glukanazv

4.2.1. Oznaczanie ilości cukrów redukujących obecnych w płynie poho-dowlanym metodą Somogyi-Nelsona    0Lt7cjiU

Do 1 ml płynu pohodowlanego odpowiednio rozcieńczonego dodać lrpl odczynnika miedziowego i gotować we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut Po ^ ostudzeniu dodać lml odczynnika Nelsona, wymieszać i odczytać absorbancję na kolorymetrze. Specol przy długości fali 520nm.

Zawartość cukrów redukujących wyliczyć ze wzoru:

C = 0,3234 xExR=St)

gdzie.

C - ilość cukrów redukujących [ |J4Aml]

E - absorbancja

R - rozcieńczenie płynu pohodowlanego

0,3234 - przelicznik wynikający z krzywej wzorcowej wykonanej dla glukozy

4.2.2. Oznaczanie aktywności endo-1,4-p-glukanazy na podstawie ilości cukrów redukujących uwolnionych z CM-celulozy (metodą Somagyi-

^Nelsona>    GU!U^a

Warunki prowadzenia reakcjj: ■

substrat: 0,4% roztwór CM-celulozy w buforze octanowym 0.05M p pH 4,4.

Mieszanina reakcyjna:

OCfcWi louKOuC

do 0,5 ml odpowiednio rozcieńczonego filtratu dodać 0,5 ml roztworu CM- celulozy i próbę inkubować w temperaturze $fc°C przez 15 minut. Po skończonej inkubacji do każdej próby dodać po 1 ml odczynnika miedziowego i dalej prowadzić oznaczenia zgodnie z metodą Somogyi-Nelsona (p.4.2.1.).

e

Aktywność endo-1,4-P-glukanazy podać stosując wzór:

(0,3234 x ExRx 2)-C A =-

^ts“ IZ Uutc

gdzie:

A- aktywność endo-1,4-P-glukanazy [J/ml]

E- absorbancja przy długości fali 520 nm R- rozcieńczenie filtratu

C- ilość cukrów redukujących w filtracie [pM/ml] t- czas inkubacji [min]

H ^    ^