img286

84 Dorota Hoja-Łukowicz

działu chromatograficznego rozpoczyna się zaraz po nałożeniu próbki. Kolumnę przemywa się dziesięcioma objętościami kolumny w celu usunięcia substancji balastowych.

- Elucja

Najlepszymi eluentami są odczynniki osłabiające oddziaływania elektrostatyczne, efekty hydrofobowe oraz wiązania wodorowe. W celu osiągnięcia ostrego profilu elucji stosuje się ciągły gradiend eluentu. Jeśli dana substancja wiąże się bardzo mocno do adsorbenta, to stosuje się czasowe zamknięcie kolumny na 30 minut do 2 godzin. Pozwala to na zajście dysocja-cji ligand - oczyszczana substancja przed elucją i daje pewność dobrego odzysku zaadsorbo-wanej substancji.

Jędn^zjTjętgd elucji jest zmiąrjąpłf powodująca zmianę stopnia jonizacji naładowanych grup chemicznych w miejscach wiążących. Efektywna desorpcja zachodzi poprzez obniżenie pH układu. Stabilność podłoża, liganda oraz zaadsorbowanych substancji w zależności od stężenia jonów wodorowych wyznacza najniższą dopuszczalną wartość pH eluentu (zwykle stosuje się Ipjjfop.octanowy ppH.3,0.).

Inną efektywną metodą elucji jest stosowanie bufprówo wzrastającej sile jonowej. Elucja może mieć charakter skokowy lub gradientu (zwykle stosuje się roztwór NąCJ, a enzymy eluuje się przy stężeniu 1 M NaCl lub niższym).

16.1.    Wykonanie ćwiczenia

16.1.1.Oczyszczanie p-glukuronidazy lizosomowej z wątroby szczura metodą chromatografii powinowactwa immunologicznego

16.1.1.1.    Materiały i odczynniki

Frakcja lizosomowa wątroby 3-miesięcznych szczurów, kolumna lgG_ann<(Ki -Sepharose4B, bufor wyjściowy (20 mM TRIS-HC1 pH 7.0,0.15 M NaCl), eluent (0.2 M glicyna-HCI pH 3.0), 0.7 % TR1S, odczynnik Bradforda, roztwór wzorcowy (BSA) o stężeniu lmg/ml, bufor octanowy (0.3 M CHjCOONa-CHjCOOH pH 4.5), substrat (3 mM P-D-glukuronid fenoloftaleiny), stoper (0.5 M glicyna-NaOH pH 10.4).

16.1.1.2.    Aparatura i sprzęt laboratoiyjny

Spektrofotometry: SPECORD UV-VIS, SPEKOL 221, kuweta kwarcowa, łaźnia wodna, pipety nastawne, probówki, statyw na probówki, czasomierz.

16.1.1.1. Wykonanie

Oznaczyć stężenie białka całkowitego we frakcji lizosomowej wątroby szczura metodą Bradforda (patrz ćwiczenie 15.1.2). Oznaczyć aktywność enzymatyczną p-glukuronidazy we frakcji lizosomowej wątroby szczura (patrz ćwiczenie 15.1.4). Na kolumnę lgG_in|y|10-Sepharose 4B o objętości 1 ml nałożyć 1 ml frakcji lizosomowej wątroby 3-miesięcznych szczurów. Kolumnę chromatograficzną przepłukać 20 ml buforu wyjściowego (20 mM TR1S-HCI pH 7.0, 0.1 JM NaCl). Elucję prowadzić 0.2M roztworem glicyna-HCI pH 3.0. Zbierać frakcje 0.5 ml (szybkość przepływu 40 ml/godz.) i natychmiast neutralizować je do pH 7.0, dodając 0.5 ml 0.7% roztworu TR1S. Detekcję białka w poszczególnych frakcjach wykonać w spektrofotometrze (SPECORD UV-V1S) przy długości fali X = 280 nm. Frakcje zawierające białko połączyć i oznaczyć stężenie białka (patrz ćwiczenie 15.1.2) oraz aktywność enzymatyczną P-glukuronidazy (patrz ćwiczenie 15.1.4).

16.1.1.4. Opracowanie wyników

Obliczyć stężenie białka całkowitego oraz aktywność enzymatyczną P-glukuronidazy we frakcji lizosomowej wątroby szczura. Obliczyć stężenie białka, aktywność enzymatyczną oraz aktywność właściwą P-glukuronidazy w eluacie. Wyznaczyć współczynnik oczyszczenia enzymu.

Literatura

Ardelt W.: Zasady izolowania enzymów [w:] Elementy enzymologii (red. J.Witwicki, W.ArdcIta), PWN, Warszawa 1989, s. 253-261.

Wasiak J.R.: Chromatografia [w:] Fizykochemiczne metody badawcze, (red. L. Werblan), Wydawnictwa Szkolne i Pedagogiczne 1982, s. 88-94.

Trayer I.P.: Affinity chromatography [w:] Techniques in protein and enzyme biochemistry (Ed. H.L. Komberg, J.C. Metcalfe, D.H. Northcorte, C.l. Pogson, K.F. Tipton), Elsevier, North - Holland 1978, s. 1-34.