skanowanie0001

KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH

Odczynniki:

■    IM bufor octanowy o pH 4,7

■    10% r-r NaOH

” 0,5% r-r kwasu pikrynowego

■    wzorcowy r-r glukozy, c 4^5 mg/ ml

• 0,2 M r-r sacharozy w buforze octan, o pH 4,7

Ćwiczenie 1. Wykreślanie krzywej wzorcowej Przygotowanie krzywej wzorcowej:

1.    Przygotować i ponumerować 5 probówek. Do probówek dodać kolejno wzrastające ilości standartowego roztworu glukozy: 0,2; 0,4; 0,6 i 0,8; 1 ml i uzupełnić wodą destylowaną do objętości Ind.

2.    Do probówki nr 6 pobrać 1 ml wody destylowanej (próba ślepa).

3.    Do wszystkich probówek dodać 2 ml 0,5% kwasu pikrynowego i 2 ml 10% NaOH. Wymieszać i ogrzewać przez 5 min. we wrzącej łaźni.

4.    Dokonać odczytu wartości absorbancji przy długości fali 510 nm, wobec próby kontrolnej.

5.    Wykreślić na papierze milimetrowym ktzywa zależności absorbancji od stężenia glukozy.

Ćwiczenie 2. Badanie wpływu różnych stężeń inwertazy na szybkość hydrolizy sacharozy

Wyznaczanie optymalnego stężenia enzymu (takie stężenie enzymu, przy którym wydajność reakcji będzie największa).

1.    Podstawowy roztwór enzymu rozcieńczyć odpowiednio w oddzielnych probówkach (rozcieńczenie zależne od aktywności roztworu podstawowego enzymu): np. 20x, 30x, 50 razy.

2.    Przygotować po 5 probówek dla każdego rozcieńczenia, w celu oznaczenia szybkości reakcji katalizowanej przez różne stężenia enzymu.

3.    Do każdej probówki dodać 2 ml 0,5% kwasu pikrynowego i 2 ml 10% NaOH.

4.    W probówce nr 6 przygotować mieszaninę inknbacyina - 3 ml odpowiednio rozcieńczonego enzymu z 3 ml 0,2 M sacharozy (dla każdego rozcieńczenia).

5.    Inkubację sacharozy z różnymi stężeniami enzymu (wg tabeli nr 1) przeprowadzić w temperaturze pokojowej. Natychmiast po wymieszaniu (t=0) pobrać z probówki nr 6, 1 ml mieszaniny inkubacyjnej do probówki zawierającej 2 ml 0,5% kwasu pikrynowego oraz 2 ml 10% NaOH i wstawić do wrzącej łaźni wodną' na 5 min.

6.    Następnie po upływie odpowiednio: 5-10-15*20 min, pobierać 1 ml mieszaniny inkubacyjnej do uprzednio przygotowanych probówek z odczynnikami i wstawiać do wrzącej łaźni na 5 min.

16