025

Oddziaływanie biotyna-awidyna jest odporne na skrajne wartości pH, rozpuszczalniki organiczne, pewne czynniki denaturujące, np. 3 M GuaCl.

Biotynę można uwolnić traktując 8 M GuaCl w pH=1.5 lub podczas autoklawowania.

Najpowszechniej używanymi odczynnikami do biotynylacji są estry z N-hydroksybursztynimidem lub N-hydroksysulfobursztynimidem . W większości przypadków można założyć, że na powierzchni białka są wolne pierwszorzędowe reszty aminowe, nadające się do biotynylacji.

ALE!

pierwszorzędowe aminy mogą być bardzo istotne dla aktywności białka! -> utrata aktywności

niektóre przeciwciała zawierają miejsca wiążące antygen, które są bogate w reszty Lys -> utrata zdolności wiązania antygenu

W takiej sytuacji należy sprzęgać poprzez inne grupy funkcyjne, np. reszty SH.

Przeciwciała można zredukować w łagodnych warunkach, np. używając 2-merkaptoetyloaminy. Wtedy ulegają redukcji wiązania S-S w rejonie zawiasowym. Reakcję przeprowadza się w obecności EDTA, które przeciwdziała utlenianiu zależnemu od jonów metali. W niektórych przypadkach zalecane jest przedmuchiwanie buforu azotem.

Zaletą sprzęgania poprzez grupy SH jest możliwość bardziej precyzyjnego umiejscowienia znacznika.

WADY:

Grupy SH rzadko są dostępne, najczęściej są zaangażowane w tworzenie wiązań S-S.

Konieczne jest uprzednie zredukowanie białka, a następnie usunięcie czynnika redukującego przed reakcją sprzęgania.

W niektórych przypadkach konieczne jest wprowadzenie grupy SH.

Kolejną alternatywą jest sprzęganie poprzez reszty cukrowcowe.

•    Zastosowanie systemu biotyna-awidyna, biotyna -streptawidyna

Wiązanie biotyny przez awidynę jest bardzo mocne, ale awidyna wykazuje tendencję do niespecyficznego wiązania innych związków ze względu na swój wysoki punkt izoelektryczny (pl=10) oraz zawartość reszt cukrowcowych:

•    oddziaływania jonowe,

•    oddziaływania z miejscami wiążącymi węglowodany na powierzchni komórek.