0
8

6.    Przenieść supernatant do nowej probówki i wytrącić 2 objętościami etanolu (odcz. 6) o temperaturze pokojowej. Odzyskać DNA przez nawinięcie na bagietkę. Płukać 2-krotnie w 70% roztworze etanolu (odcz. 7) i suszyć na powietrzu.

7.    Rozpuszczać DNA w 200 pl buforu TE.

Uwagi:

1)    Otrzymany DNA jest podatny na działanie enzymów restrykcyjnych i nadaje się jako substrat do reakcji amplifikacji (PCR).

2)    Wydajność tej metody wynosi 220 pg DNA ze 100 pl upakowanych erytrocytów pstrąga.

3)    Otrzymany DNA charakteryzuje się wartościami stosunku A₂₆₀/A₂₈₀ = 1,7-1,9.

4)    Jeśli objętość upakowanych erytrocytów przekracza 200 pl, trawienie proteina-zą K powinno trwać co najmniej 8 godz.

5)    Po wprowadzeniu DNA do buforu TE (etap 7.), można umieścić probówkę w temp. 95°C w celu usunięcia DNaz.

Ćwiczenie 10.8. Izolowanie DNA z archiwizowanych tkanek w celu zastosowania w reakcji PCR (R. Sepp i wsp. 1994: J. Clin. Pathoi, 47:318-323)

Możliwość badania próbek archiwizowanych tkanek na poziomie molekularnym pozwala na studia o charakterze retrospektywnym dotyczące dużej liczby osobników i śledzenie w dużych przedziałach czasu zmian genetycznych lub czynników infekcyjnych związanych z chorobami. Najbardziej popularną metodą archiwizacji tkanek jest ich utrwalenie w formalinie z następczym obłożeniem parafiną. Analiza klinicznie istotnych zmian w DNA archiwizowanej tkanki zależy od umiejętności jego izolowania. Jeżeli DNA ma być substratem w reakcji PCR (podrozdz. 10.3.5), to może być otrzymywany razem z innymi cząsteczkami.

Zasada: Próbki archiwizowanej tkanki są uwalniane z parafiny przez ogrzewanie, następnie podlegają rehydratacji i suszeniu.

Materiał: Archiwizowana tkanka w postaci bloków parafinowych.

Odczynniki:

1)    Ksylen.

2)    Etanol absolutny.

3)    Bufor do trawienia: 50 mM KC1 - 1,5 mM MgCl₂ - 10 mM Tris/HCl - 0,5% Tween 20 (pH 9,0) zawierający proteinazę K w stężeniu 200 pg/ml.

Aparatura: Aparat próżniowy.

Wykonanie:

1.    Z bloków parafinowych sporządzić skrawki o grubości 5-10 pm.

2.    Umieścić je w probówkach o pojemności 1,5 ml (jeden skrawek w jednej probówce).

3.    Do każdej probówki dodać 1 ml ksylenu (odcz. 1) i mieszać 30 min.

4.    Odwirować (14000 xg w temp. pokojowej przez 5 min), uważnie usunąć supernatant.

5.    Powtórzyć etapy 2.-4.

6.    Do każdej probówki dodać 0,5 ml etanolu absolutnego (odcz. 2), mieszać przez odwracanie probówki.

378