02

10.1.3. Izolowanie RNA

Typowa komórka ssaków zawiera około 10"⁵ pig RNA, z którego 80-85% stanowi rRNA (głównie 28S, 18S i 5S). Pozostałą część stanowią głównie małe RNA, m.in. tRNA, snRNA o określonej długości i sekwencji, które można izolować wieloma metodami. Cząsteczki mRNA stanowią populację niejednorodną i ich izolowanie wymaga podjęcia specjalnych kroków, które są omówione w ćw. 10.13.

W izolowaniu RNA krytyczne znaczenie ma kontrolowanie aktywności rybo-nukleaz komórkowych, które mogą doprowadzić do degradacji preparatu. Można wyróżnić dwie główne drogi postępowania mające na celu uniknięcie degradacji RNA przez rybonukleazy uwolnione w czasie lizy komórek, tj. 1) wprowadzenie inhibitorów RNaz; 2) zastosowanie metod, które powodują dezintegrację komórki z jednoczesną inaktywacją RNaz. Należy także wystrzegać się wprowadzenia rybo-nukleaz z zewnątrz, szczególnie zwracając uwagę na sprzęt laboratoryjny. Następujące uwagi mogą pomóc w uniknięciu problemów z zanieczyszczeniem RNaza-mi:

1)    Jednorazowy sterylny sprzęt laboratoryjny wykonany z tworzyw sztucznych jest zasadniczo wolny od RNaz i może być stosowany bezpośrednio do izolowania i przechowywania RNA.

2)    Sprzęt laboratoryjny wielokrotnego użytku wykonany ze szkła trzeba inkubować w temp. 180°C przez co najmniej 8 godz., natomiast sprzęt wykonany z tworzyw sztucznych, polietylenu i polipropylenu — płukać chloroformem.

3)    Sprzęt laboratoryjny można również umieszczać (zanurzać lub wypełniać) w 0,1% roztworze pirowęglanu dietylu (diethyl pyrocarbonate — DEPC), który jest silnym inhibitorem RNaz (w temp. 37°C przez 2 godz.). Po tym zabiegu należy przeprowadzić kilkakrotne płukanie w sterylnej wodzie i ogrzewanie w temp. 100°C przez 5 min. Postępowanie to jest konieczne, aby usunąć ślady DEPC, który mógłby modyfikować puryny RNA przez karboksymetylację. DEPC jest potencjalnym karcynogenem, wobec czego należy się z nim obchodzić ze szczególną ostrożnością.

4)    Zbiorniki aparatów do elektroforezy, w których będzie przeprowadzana analiza RNA, powinny być myte w roztworze detergentu, płukane w wodzie, a następnie przemywane etanolem i wypełniane 3% roztworem H₂0₂; po upływie 10 min w temperaturze pokojowej zbiornik powinno się przemywać wodą traktowaną 0,1% DEPC. 5) Dobrym zwyczajem jest wydzielenie sprzętu do pracy z RNA, oznaczenie go i przechowywanie w odrębnym miejscu.

Ćwiczenie 10.11. Izolowanie RNA z trzustki (P. Chomczynski, N. Sacchi 1987: Anal. Biochem., 162:156-159)

Zasada: Izotiocyjanian guanidyny należy do substancji najefektywniej denaturujących białka. Jest on także silnym inhibitorem rybonukleaz. Opisana metoda opiera się na ekstrakcji izotiocyjanianem guanidyny i mieszaniną fenol/chloroform w środowisku kwasowym. Wiązania dwusiarczkowe w białkach są zrywane przez 2-mer-kaptoetanol.

382