09

gdzie: a ilość pmol nuklcotydu w 5 ml eluatu, A/l = /l_nm - ^₂9o,3oo>* ^e molowy współczynnik absorpcji (tab. 10.1 s. 393).

Skład nukleotydowy wyrazić w procentach molowych sumy nukleotydów:

liczba umol danego nuklcotydu

procent molowy =-:-rr-.-r~.-tt— 100

suma pmol wszystkich nukleotydow

Ćwiczenie 10.31. Oznaczanie składu zasad azotowych DNA (G.R. Wyatt 1951: Blochem. J.. 48:584-590)

Zasada: Metoda jest oparta na chromatograficznym rozdziale wolnych zasad z kwaśnego hydrolizatu DNA. wyeluowaniu ich z chromatogramu i ilościowym oznaczeniu metodą spektrofotometryczną.

Materiał: Preparat DNA.

Odczynniki:

II Roztwory: 0.1 M HCI i 72% HCI0₄.

2| Izopropanol/HCI/H ₂0 (65:16,7:18,3).

3) Bibuła Whatman nr I.

Wykonanie:

1.    Hydroliza kwasowa DNA. Od ważkę DNA (4 5 mg) przenieść do wąskiej, grubo-ścienncj probówki, dodać 0,1 ml 72% roztworu HC10₄ i probówkę zatopić. Hydrolizę przeprowadzić w temp. 100"C (wrząca łaźnia wodna przez 1 godz.). W tych warunkach następuje rozkład DNA do wolnych zasad azotowych. Po oziębieniu ostrożnie otworzyć probówkę i dodać 0,4 ml H₂0. Zawartość probówki dokładnie wymieszać i odwirować. Supernatant zawierający zasady azotowe służy do nakraplania na bibułę.

2.    Przygotowanie chromatogramu. Przygotować pasek bibuły Whatman nr 1 o wymiarach 15x45 cm. W odległości 7 cm od krótszego boku wykreślić linię startu i nanieść ok. 20 pl kwasowego hydrolizatu DNA, osuszając bibułę strumieniem chłodnego powietrza.

3.    Rozwinięcie chromatogramu. Chromatogram rozwinąć w komorze stosując jako rozpuszczalnik izopropanol/HCI/H₂0 (65:16,7:18,3) w temperaturze pokojowej przez 24 godz. Chromatogram wysuszyć na powietrzu, a następnie w suszarce (w temp. 80°C przez 20 min).

4.    Identyfikacja zasad azotowych. Położenie zasad azotowych określić pod lampą UV w sposób podany w ćw. 10.30. Zasady zidentyfikować według załączonego schematu rozdziału wzorcowych zasad azotowych (rys. 10.13).

5.    Kluowanie zasad azotowych przeprowadzić identycznie jak w ćw. 10.30 z tym, żc zamiast 0,01 M roztworu HCI zastosować 0,1 M roztwór HCI.

6.    Spektrofotometryczne oznaczenie absorbancji eluatów i wyliczenie składu procentowego zasad azotowych DNA. Absorbancję eluatów w odniesieniu do próby odczynnikowej oznaczyć w spektrofotometrze w 1-cm kwarcowych kuwetach przy długości fali maksymalnej dla danej zasady (tab. 10.1) oraz w 290 nm (dla cytozyny w 300 nm).

419