04

bydlęcej. Ćwiczenie obejmuje 3 główne etapy poza przygotowaniem wielu skomplikowanych odczynników — I) wyekstrahowanie DNA z wątroby bydlęcej; 2) enzymatyczną hydrolizę wyizolowanego DNA do nukleozydów oraz 3) analizę chromatograficzną uzyskanych hydrolizatów' DNA za pomocą IIPLC w celu oznaczenia ilościowego 2'-deoksycytydyny i 5-metylo-2'-deoksycytydyny (deoksynukleozydów zawierających cytozynę i 5-metylocytozynę). Z uwagi na czasochłonność każdego z tych etapów zaleca się wykonanie ćwiczenia w ciągu 4 kolejnych dni ćwiczeniowych. Opisaną metodę można wykorzystać również do analizy składu nuklcozydowego kwasów' nukleinowych.

Materiał: wątroba bydlęca (zamrożona tuż po pobraniu).

Odczynniki:

1)    Bufor pH 7.4: 250 mM mannitol - 70 mM sacharoza - 5mM HEPES. Aby przygotować 1000 ml odczynnika, wstępnie sporządzać 500 ml 20 mM roztworu soli sodowej HEPES o masie molowej 260,3 g (2,60 g + H₂0 do obj. 500 ml) oraz. 500 ml 20 mM HEPES w formie wolnego kwasu

0    masie molowej 238,3 g (2,38 g - H₂0 do obj. 0,5 IK a następnie mieszać oba roztwory pod kontrolą pll-mctru. aż do osiągnięcia pH 7,4. Do 250 ml tak sporządzanego bufoni dodać 4$5i g rnannitolu oraz 23,96 g sacharozy (wolnej od nukkazll i mieszając uzupełnić wodą do objętości 1000 ml.

2)    Bufor o pH 6,5 (100 ml): 5 mM cytrynian sodu - 20 mM chlorek sodu. Rozpuścić 0,147 g dwuwodnego cytrynianu trójsodowego (mol = 294,1 g) i 0.117 g NaCl (mol = 58,44 g) w 50 ml H₂0, doprowadzić do pil 6,5 pod kontrolą pH-mctru za pomocą rozcieńczonego roztworu HCI

1    uzupełnić ll₂0 do 100 ml.

3)    Roztwór pronazy (proteazy ze Streptomyces griseus wolnej od nukleaz) o stężeniu 20 mg-ml w odczynniku 2 (z. uwagi na kosztowność enzymu dostosować objętość odczynnika do ilości przygotowywanych preparatów DNA).

4)    Bufor o pH 8.5 (100 ml): 20 mM EDTA - 1,5% (m/v) laurynian sarkozylu - 20 mM Tris/HCI. Rozpuścić 0,584 g EDTA (mol = 292,2g), 1,5 g laurynianu sarkozylu i 0,242 g Tris (mol = 121,lg) w 70 ml ll₂0 i doprowadzić do pH 8,5 za pomocą rozcieńczonego MCI pod kontrolą pH-mctru, następnie uzupełnić wodą do 100 ml.

5)    Bufor o pH 7,5 (100 ml): 1 mM EDTA - 10 mM Tris/HCI. Rozpuścić 29 mg EDTA i 0,121 gTris w 80 ml H₂0 i doprowadzić do pH 7,5 za pomocą rozcieńczonego HCI pod kontrolą pH-metru; uzupełnić wodą do objętości 100 ml.

6)    7,5 M CH₃COONH_a (50 ml). Rozpuścić 28,9 g CH,COONH₄ (mol - 77,08 g) w H₂0, doprowadzając objętość do 50 ml.

7)    96% roztwór etanolu (schłodzony do -20^,:C).

8)    70% roztwór etanolu (schłodzony do - 20’C). Przygotować poprzez rozcieńczenie powyższego.

9)    Bufor o pH 4,8 (100 ml): 20 mM CH₃C()ONa - 0.1 mM ZnCl₂. Rozpuścić 1.4 mg ZnCI₂ (mol = 136,3 g) i 0,164 g bezwodnego CHjCOONa (mol = 82,03 g) w 70 ml H ₂0, doprowadzić do pH 4,8 za pomocą CH₃COOH pod kontrolą pH-mctru; uzupełnić wodą do 100 ml.

10)    Roztwór nuklcazy PI z Peniciłlium citrłnum w odczynniku 9 zawierający 145 Li enzymu w 1 ml roztworu. (Jednostka aktywności nuklcazy PI jest to ilość enzymu, która powoduje uwolnienie I pmol nukleotydów z RNA, w temp. 37³C i pH 5,3 w ciągu 1 min). Objętość odczynnika należy dostosować do potrzeb ćwiczenia.

11)    1 M bufor Tris/HCI o pH 7.5 (50 ml). Rozpuścić 6,05 g Tris w 35 ml H₂O_t doprowadzić do pil 7,5 za pomocą HCI pod kontrolą pH-mctru i uzupełnić wodą do 50 ml.

12)    Roztwór alkalicznej fosfatazy z Escherichia coli w 50 mM buforze Tris/HCI (pH 7,5), zawierający 333 U enzymu w 1 ml. (Jednostka aktywności fosfatazy zasadowej jest to ilość enzymu hydro-lizująca 1 pmol fosforanu p-nitrofenolu w pH 9,8 i temp. 37³C w ciągu I min). Przygotowanie roztworu zależy od posiadanego preparatu enzymu; np. do fiolki zwierającej liofilizat 2000 U fosfatazy zasadowej z E. coli dodać 0,3 ml odczynnika 11 oraz 5,7 ml H₂0 i delikatnie wymieszać.

424