05

13)    Filucnt do rozdziału nuklcozydów za pomocy HPLC: 50 mM KH₂P0₄ - 5% metanol (2 1). Sporządzić wodny roztwór 13,6 g bezwodnego KH₂P0₄ (mol = 136,1 g) o objętości 1,9 1 i dodać do niego 100 ml metanolu wysokiej czystości. Po dokładnym wymieszaniu roztwór przesączyć przez filtr o średnicy porów 0,2 pm.

14)    Roztwory wzorcowe 5-metylo-2'-dcoksycytydyny (5-Mc-dC). Rozpuścić 1 mg 5-Me-dC w 1 ml H₂0. Dokładne stężenie molowe 5-Me-dC w uzyskanym roztworze podstawowym oznaczyć metodę spektrofotomctryczną. W tym celu przygotować 3 roztwory poprzez 100-krotnc rozcieńczenie wodą roztworu podstawowego (20 pi roztworu podstawowego + 1980 pl H₂0) i zmierzyć ich absorbancję względem wody przy X = 279 nm (przy tej długości fali 5-Me-dC wykazuje lokalne maksimum pochłaniania). Stężenie 5-Mc-dC w roztworze podstawowym wylicza się korzystając / molowego współczynnika absorpcji wynoszącego dla 5-Me-dC 8770 przy X = 279 nm (r;₂-£ = 8770). Współczynnik ten — to teoretyczna wartość absorbancji roztworu związku o stężeniu 1 M. przy danej długości fali. Obliczenia dokonuje się układając proporcję:

1000 mM —8770 .v m\l — /l₂-g nm

gdzie: /1_2T9 nm oznacza uśrednioną absorbancję 3 rozcieńczonych 100-krotnic roztworów 5-Mc-dC. Obliczone w ten sposób stężenie 5-Me-dC (mM) mnoży się przez 100-krotnc rozcieńczenie, uzyskując stężenie 5-Me-dC w roztworze podstawowym, wyrażone w milimolach na litr (mM). Na kolumnę HPLC nastrzykujc się po 20 pl roztworu; należy obliczyć, ile nanomoli S-Me-dC znajduje się w 20 pl roztworu podstawowego. Na podstawie tej informacji przygotować 4 roztwory wzorcowe 5-Mc-dC — zawierające 0,25; 0,5; I i 2 nmol 5-Me-dC w 20 pl poprzez rozcieńczanie roztworu podstawowego wodą.

15)    Roztwory wzorcowe 2'-dcoksycyiydyny (dC) zawierające 2,5; 5; 10 i 20 nmol dC w 20 pl przygotować według sposobu opisanego dla 5-Me-dC (odczynnik 14). Molowy współczynnik absorpcji dla dC przy X = 271 nm wynosi 9300.

Uwaga: Do przygotowania wszystkich odczynników należy użyć wody 2 x destylowanej i przechowywać je w lodówce (2 6°C).

Aparatura i sprzęt:

1)    Zestaw wysokosprawnej chromatografii cieczowej wyposażony w pompę, ręczny dozownik prób, detektor UV, kolumnę z odwróconymi fazami typu ODS (C_l8) (np. Ultrasphcrc C₁₈ firmy Beckman, USA) i komputer do obróbki danych chromatograficznych,

2)    zestaw do podciśnieniowej filtracji eluentów wyposażony w sączki nylonowe o średnicy porów 0,2 pm.

3)    wirówka przystosowana do wirowań w probówkach na 50 ml,

4)    mikrowirówka wyposażona w rotor do probówek Eppcndorfa,

5)    homogenizator Dounce’a o pojemności 40 do 50 ml z ciasnym tłokiem typu B,

6)    spektrofotometr do pomiarów w zakresie UV,

7)    pH-mctr,

8)    zestaw nastawnych pipet automatycznych obejmujący zakres pipetowań od 1 pl do 5 ml,

9)    jednorazowe, zakręcane probówki polipropylenowe o pojemności 50 ml,

10)    probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml,

11)    łaźnia wodna z kontrolą temperatury,

12)    okulary i grube rękawice ochronne,

13)    moździerz procelanowy,

14)    ciekły azot.

Wykonanie:

I. Mały moździerz schłodzić przez wlanie do niego porcji ciekłego azotu, uzupełniając jego ilość aż do momentu ustania burzliwego parowania. W moździerzu umieścić 0.5 g wątroby bydlęcej (zamrożonej tuż po pobraniu) i rozcierać na proszek dodając od czasu do czasu niewielką ilość ciekłego azotu.

425