11168148†167551053566200023099268908603 n

000191*', O.jpg (Obrazek JPEG, 300x300 pikseli)

ht!p.7/www.£«lroOLc0mfmcdjł/,pl*pl/Oriiphks/OOOO19H..O |pn

1.    Strypsynizować komórki (wg protokoÅ‚u z poprzednich ćwiczeÅ„).

2.    Przenieść komórki do probówek wirowniczych (falkony 50 ml).

3.    Å»wirować komórki (1200 obr/min, RFC-> 234,10 min).

4.    Zlać supematant, a zawiesinÄ™ komórek zawiesić w 1 ml podÅ‚oża hodowlanego (jeżeli hodowla byÅ‚a bardzo konllucntna, to zwiÄ™kszyć objÄ™tość podÅ‚oża hodowlanego). DokÅ‚adnie rozpipetować.

5.    Do probówek 1,5 ml dodać 10 pl bÅ‚Ä™kitu trypanu (0,4%) i 10 pi zawiesiny komórek. Wymieszać.

6.    Nanieść z jednej strony szkieÅ‚ka nakrywkowego komory Burkera po 10 pl.

7.    Policzyć komórki z 16 kwadratów w trzech powtórzeniach.

8.    Obliczyć liczbÄ™ komórek wg wzoru:

X*2* 10⁴ [komórek/ml]

X - uśredniona liczba komórek 2 - rozcieńczenie

Barwienie komórek bÅ‚Ä™kitem trypanu stanowi rutynowÄ… metodÄ™, szeroko stosowanÄ… w laboratoriach, w hodowlach komórkowych zarówno kontrolnych, jak i doÅ›wiadczalnych, pozwalajÄ…cÄ… na okreÅ›lenie procentowej iloÅ›ci komórek późno apoptotycznych i nekrotycznych.

Należy pamiÄ™tać, że bÅ‚Ä™kit trypanu po dÅ‚uższej inkubacji jest dla komórek toksyczny. Jego dziaÅ‚anie cytotoksycznc można stwierdzić podczas ponownej obserwacji preparatów po okoÅ‚o 30 minutowej inkubacji. Ilość komórek wybarwionych powinna wzrosnąć.