242 2

wynik nie jest możliwy do przewidzenia. Decyduje to o celowości stosowania wielokrotnej mutagenizacji i różnych mutagenów, które mogą wywoływać odmienne skutki oraz o konieczności szukania mutantów korzystnych wśród bardzo dużej liczby izolatów. Do najczęściej stosowanych mutagenów należą promieniowanie UV oraz MNNG. Pokrótce omówimy ich najważniejsze cechy użytkowe oraz warunki działania.

Promieniowanie UV. Najbardziej bójcze i równocześnie mutagenne jest promieniowanie elektromagnetyczne o długości fal 254 — 265 nm, w tzw. dalekim zakresie UY. Do ich emisji stosowane są lampy rtęciowe wytwarzające ponad 95% tego promieniowania. Spośród innych czynników mutagennych wyróżnia się ono szeregiem korzystnych właściwości, do których należą:

1)    ogólna dostępność i łatwość użycia źródła promieniowania;

2)    łatwość dozowania jego dawek przez dobór mocy lampy, odległości od zawiesiny komórek i czasu działania;

3)    łatwość odtwarzania warunków mutagenizacji;

4)    bardzo wysoka częstotliwość powstawania mutacji w stosunku do efektu letalnego;

5)    możliwość uzyskania wszystkich typów mutantów;

6)    możliwość wywołania mutacji w rosnących komórkach wegetatywnych, jak również w komórkach spoczynkowych, np. w sporach.

Te walory promieniowania UY sprawiają, że jest ono stosowane bardzo powszechnie i z dobrym skutkiem. W celu wykonania mutagenizacji przygotowuje się zawiesinę komórek w roztworze fizjologicznym soli (lub w podłożu hodowlanym) o gęstości 10⁵ — 10⁶ komórek w 1 ml. Ponieważ promienie UV nie wnikają głęboko do środowiska wodnego, zatem -wysokość warstwy zawiesiny komórek nie może przekraczać kilku mm. Zawiesina mieszana jest przy pomocy mieszadła magnetycznego. Źródło promieniowania UV, np. bakteriobójczą lampę o mocy 15 W, umieszcza się w odległości kilkudziesięciu cm nad zawiesiną. Mutagenizację prowadzi się zazwyczaj przez kilka minut, po czym wykonuje się posiewy na płytki z podłożem wzrostowym. Inny sposób mutagenizacji polega na działaniu promieni UV na komórki posiane na powierzchni agarowego podłoża wzrostowego na płytkach.

Niezależnie od promieniowania IJV dalekiego zakresu, stosuje się również tzw. bliskie promieniowanie UV o długości fali około 360 nm, połączone z działaniem 8-metoksypsoralenu jako czynnika uczulającego DNA na ten rodzaj promieniowania.

N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna (MNNG). Szczególną cechą MNNG jest wywoływanie tzw. „mutacji punktowych”, dotyczących pojedynczych genów oraz to, że środek ten działa maksymalnie efektywnie podczas procesu replikacji DNA. Wynikiem mutagenezy są często mutacje równoczesne, skupione w jednym regionie DNA. MNNG może być zatem używana do kontrolowanego procesu mutagenezy w określonym regionie genomu. Warunkiem tego jest zastosowanie MNNG w wybranej fazie replikacji DNA w hodowli zsynchronizowanej. Dodatek 100 pg MNNG/ml hodowli natychmiast hamuje syntezę DNA, powodując unieruchomienie regionu replikacyjnego na cały czas działania mutagenu. Region ten ulega mutagenizacji z częstotliwością ponad 200 razy większą aniżeli inny odcinek DNA o tej samej

242