CCF20081011005

4) Oznaczanie katalazy metodą Eulera Josephsona

Szybkość reakcji rozkładu H2O2 przez katalazę zmniejsza się w miarę upływu czasu. Spadek szybkości spowodowany jest nie tylko wyczerpywaniem się substratu, lecz także toksycznym działaniem H2O2 (substratu) na białko enzymowe.

Reakcja ta jest początkowo typową reakcją I-go rzędu. Właściwą miarą aktywności katalitycznej enzymu jest szybkość reakcji w chwili t=0 czyli szybkość początkowa CVZ). proporcjonalna do stężenia dodanego enzymu.

Oznaczenie aktywności katalazy można przeprowadzić trzema metodami: manometryczną, spektrofotometryczną i miareczkową. Ta ostatnia metoda jest prosta i wygodna - polega na oznaczaniu ubytku substratu przez miareczkowanie manganometryczne próbek pobieranych z mieszaniny inkubacyjnej (zbuforowany roztwór substratu + roztwór enzymu). Miareczkowanie H2O2 nadmanganianem przebiega wg równania:

5 H₂0₂ + 2 Mn0₄‘ + 6H⁺    5 0₂ + 2 Mn²⁺ + 8 H₂0

Na tej podstawie można wyliczyć, że 1 cm³ 0,02 M KMn04 utlenia 50 pmoli H2O2.

Zasada metody: katalaza rozkłada nadtlenek wodoru na wodę i tlen. Ilość nie-rozłożonego H2O,

oznacza się manganometrycznie w próbkach z czynnym i nieczynnym enzymem. Z różnicy wylicza się ilość rozłożonego nadtlenku wodoru.

2 H₂0₂    -►    2 H₂0 + 0₂

5 H₂0₂ + 2 KMn0₄ + 4 H₂S0₄ -+ 5 0₂ + 2 KHS0₄ + 2 MnS0₄ + 8 H₂0 Materiał: kapusta lub chrzan

Postępowanie: 30 g świeżego materiału rozdrobnić w mikserze z 200 cm^J wody z dodatkiem 5 g CaCC>3, przesączyć i brać do analizy 10 cm . Do 4 kolbek stożkowych na 300 cm odmierzyć po

10 cm³ 0,05 M H2O2 + 40 cm H2O zbuforowanego do pH 6,8. Następnie co 30 sekund do kolejnych kolb dodawać po 2 cm^J wyciągu badanego enzymu. Dokładnie po upływie 5, 7, 9 i 12 minut działania enzymu przerwać reakcję dodając do kolejnych kolb po 10 cm³ 1 M H2S0₄. Równocześnie wykonać próbę kontrolną dodając do roztworu H2O2 10 cm^J H2S0₄, a dopiero na końcu 2 cm^J wyciągu enzymu. We wszystkich próbach odmiareczkować nierozłożony H2O2 0,02 M KMn0₄.

Opracowanie wyników, obliczyć ilość pmoli H2O2 rozłożonego przez enzym. Wyniki przedstawić rysując krzywą progresji tj zależność ilości rozłożonego substratu (pmole rozłożonego H->02) od czasu. Z wykresu wyznaczyć przez szybkość reakcji dla czasu zerowego

(V₀).

f

4