GENETYKA Anna Sadakierska Chudy , Grażyna Dąbrowska str7

96 Rozdział 7

Mutacje losowe u E. coli

W początkowym okresie badań nad bakteriami wielu bakteriologów sądziło, że to czynniki środowiska indukują powstawanie zmian w komórce bakteryjnej, umożliwiając jej przetrwanie i przystosowanie się do nowych w arunków.

Losowy charakter mutacji potwierdzają dwa testy:

a)    test fluktuacyjny Lurii i Delbrilcka,

b)    test Lederbergów - metoda replik (odcisków).

a) Luria i Delbriick przeprowadzili w 1943 roku dośw iadczenie, które dostarczyło niezbitych dowodów na to, że bakterie, podobnie jak organizmy eukariotyczne, są zdolne do mutacji spontanicznych. Zastosowali oni szczep E. coli wrażliwy na bakteriofaga Tl (Ton^s). W obecności faga w iększość bakterii ginie, rosną tylko te komórki, które uzyskały oporność (Ton^K) w w yniku mutacji (S i R są symbolami fenotypowej wrażliwości i oporności na faga, nie są natomiast oznaczeniami kodujących te cechy genów).Wcześniejsi badacze przypisywali taki efekt adaptacji, zakładali, że bakteria przystosowuje się do obecności faga. Doświadczalnie można jednak sprawdzić, czy oporność w populacji bakterii pojawia się bez względu na obecność bakteriofaga.

Jeśli kulturę bakterii początkowo stanów i mała liczba komórek (np. 100) i mutacje będą powstaw ały spontanicznie podczas wzrostu, w tedy w populacji rośnie liczba komórek opornych na infekcję fagiem. Liczba komórek opornych zależeć będzie od fazy wzrostu, w której powstała mutacja. Jeśli mutacja powstanie we wczesnej fazie w zrostu, to wiele komórek potomnych uzyska oporność. Jeśli mutacja zajdzie w późniejszej fazie wzrostu, to nieliczne komórki zyskają tę cechę i ostatecznie mała liczba kolonii będzie niewrażliwa na obecność faga. Gdyby jednak każda komórka bakteryjna miała te same zdolności uzyskania oporności w wyniku fizjologicznego przystosowania się, to oddzielne populacje miałyby podobną liczbę komórek opornych na Tl. Wykorzystując taki sposób myślenia, Luria i Delbriick wykonali następujące doświadczenie:

Pierwszy wariant

Kulturę bakterii Ton^s o małej gęstości (100 komórek) hodowano przez pewien czas do uzyskania próby o dużej gęstości (10 milionów' komórek na mililitr). Wysiano próbę na 10 płytek z pożyw ką agarow ą zawierającą faga Tl i liczono ilość opornych kolonii.

Drugi wariant

Kulturę bakterii Ton^s o małej gęstości komórek zaraz po przygotowaniu rozdzielono na 10 prób, które po hodowli do dużej gęstości wysiano na płytki z fagiem i liczono ilość opornych kolonii.

Luria i Delbriick zauważyli, że liczba mutantów opornych na 10 płytkach pochodzących z oddzielnych hodow li (wariant drugi) znacznie się różniła, natomiast liczba kolonii opornych na 10 płytkach uzyskanych z wysiania tej samej hodowli była podobna.

Prostym wyjaśnieniem tak dużego zróżnicowania liczebności wśród oddzielnie rosnących populacji są przypadkowe zmiany genetyczne, które albo zachodzą w późnej fazie wzrostu (mała liczba mutantów) albo we wczesnej fazie wzrostu (duża liczba mutantów). Brak zróżnicowania częstości mutacji w wariancie pierwszym doświadczenia można wytłumaczyć tym, że mutacja powstała zanim rozdzielono próby i zanim bakterie zetknęły się z fagiem. Uzyskane wyniki pozwoliły stwierdzić, że mutacje zachodzą losowo (spontanicznie) w genomie i nic są wynikiem przystosowania się do środowiska.

b) Test Lederbergów. podobnie jak poprzedni, jest prostym doświadczeniem polegającym na hodowli bakterii wrażliwych na antybiotyk czy bakteriofaga Tl na płytkach z niesclektywnym podłożem agarowym. Następnie za pomocą stempla (klocka obciągniętego sterylnym wclurem) wykonuje się odcisk z płytki macierzystej i bakterie przenosi się na 2 lub więcej płytek z podłożem selektywnym (np. zawierającym antybiotyk lub faga Tl). Wyrosną tylko kolonie oporne na dany czynnik.

Jeśli mutacja jest wynikiem przystosowania do środowiska (powstała po kontakcie z selektywnym podłożem), to układ wyrosłych kolonii na zrepli-kowanych płytkach powinien być różny.

- Jeśli mutacja zaszła jeszcze przed kontaktem z selektywnym medium (spontanicznie), to układ wyrosłych kolonii na zreplikownych płytkach powinien być identyczny.

Wyniki, które uzyskali Lederbcrgowie w swoim doświadczeniu, potwierdziły hipotezę o losowym charakterze mutacji.

Mutacje adaptacyjne u E. coli

U E. coli przeprowadzono badanie, które mogłoby sugerować, że bakteria potrafi programować mutacje zgodne z. presją selekcyjną. Szczep E. coli posiadający mutację nonsens w genie lacZ produkuje niefunkcjonalny enzym - uszkodzoną (ł-galaktozydazę. Komórki te nie mogą wykorzystywać laktozy jako źródła węgla, oznaczamy je lac\ Jeśli zajdzie mutacja, która zmieni kodon STOP w kodujący właściwy aminokwas, to funkcja enzymu zostanie przywrócona i komórki mogą rosnąć na podłożu z laktozą jako jedynym źródłem węgla.

Doświadczenie Cairnsa i współpr. z 1988 roku polegało na wysianiu bakterii lac na pożywki z laktozą jako jedynym źródłem w'ęgla. Liczba komórek, która pojawiła się na płytkach była znacznie większa niż w^r przypadku mutacji losowych. Komórki uzyskały genotyp i fenotyp lac‘ w wyniku mutacji adaptacyjnych, powstałych pod wpływem środow iska.

Od 1988 roku przeprowadzono wiele doświadczeń, które wykazały istnienie mutacji adaptacyjnych, jednak pogląd, że bakterie potrafią programować mutacje