img154 3

10.2. Zasady izolacji drobnoustrojów ze środowiska

Próbka pobrana do badań powinna być reprezentatywna dla całej partii badanego materiału. Drobnoustroje są rozmieszczone w środowisku przypadkowo, w sposób nieregularny. Pobierając próbkę, nie mamy pewności, czy reprezentuje ona całe środowisko. Następnie konieczne jest wyodrębnienie czystych kultur drobnoustrojów. Według Roberta Kocha, czystą kulturą jest populacja wyrosła z jednej komórki. Populację taką tworzy szczep będący podstawą do określania gatunku na podstawie jego typowych cech. Wyprowadzenie czystych kultur z pojedynczych komórek, w ścisłym tego słowa znaczeniu, jest możliwe wyłącznie z jednoczesną kontrolą mikroskopową. Stanowi to duże utrudnienie, dlatego w badaniach laboratoryjnych znajdują zastosowanie metody wstępnego różnicowania przy użyciu techniki analizy grupowej. Umożliwia ona namnożenie określonej grupy drobnoustrojów, z której wyodrębnienie pojedynczych szczepów jest znacznie łatwiejsze niż bezpośrednio z badanego materiału. Istotnym czynnikiem izolacji kultur drobnoustrojów jest takie przygotowanie materiału badań, by komórki występowały w zawiesinie możliwie pojedynczo. Materiał wyjściowy stanowią zwykle kolonie bakterii lub grzybów wyrosłe na pożywkach agarowych w analizie grupowej. Przy użyciu wyjałowionego (wyżarzonego) oczka ezy pobiera się surowy materiał - całą kolonię lub jej część, i przenosi do probówki z 9 cm³ jałowego roztworu soli fizjologicznej albo wody peptonowej, rozcierając bardzo dokładnie masę komórkową tuż przy menisku cieczy. Takie postępowanie zapobiega zbrylaniu się materiału i zapewnia jednolite rozproszenie masy komórek w płynie. Wymieszana zawiesina komórek powinna zawierać ok. 10⁵-10⁸ komórek w 1 ml i może być użyta do izolacji szczepów.

Chcąc uzyskać wzrost pojedynczych kolonii bakteryjnych na podłożu agarowym, wylewa się do jałowych płytek Petriego upłynnione i ostudzone do ok. 45° podłoże (ogólne lub wybiórcze), które po zastygnięciu podsusza się kilkanaście minut w termostacie. Na powierzchnię tak przygotowanej pożywki nanosi się oczkiem ezy kroplę badanego materiału w przygotowanej zawiesinie i wykonuje posiew rysowy. Po inkubacji w optymalnej temperaturze uzyskuje się na ostatnich odcinkach posiewu rysowego pojedyncze, dobrze rozdzielone kolonie. Izolację kultur beztlenowców i tlenowców przeprowadza się identycznie, należy tylko zapewnić beztlenowe warunki hodowli (patrz ćw. 9).

Po inkubacji przeprowadza się obserwację wyrosłych kolonii, określając ich wielkość, kształt, konsystencję i zabarwienie. Wybrane kolonie przesiewa się na skosy agarowe, aby na końcu rysy uzyskać pojedyncze kolonie. Ich czystość sprawdza się każdorazowo w preparatach barwionych metodą Grama. Jeżeli w takich preparatach stwierdza się obecność mieszanej mikroflory, należy powtórzyć przesiewy kultur (pasażowanie) na skosach agarowych, aż do uzyskania jednakowych kolonii o zupełnie czystym składzie. Każda z takich kolonii stanowi czystą kulturę.

78