mikro kunicki7

epoksydowe, takie jak np. diepoksybutan (DEB). Jednym z najefektywrP-środków mutagennych tego typu jest N-metylo-K-nitro-N-nitrozoguaSS

skrócie MNNG lub nitrozoguanidyna). Wzory tych związków podano ri ^ 10-11: Związki te reagują z grupą —NH,, przekształcając ją w

CH₃‘CH₂—S0₃—CH3

EMS, sulfonian etylometylowy

ch₃- ch₂— so₃—CH₂—o

EES, sulfonian dietylowy

CH2—CH'

V

■CH—CH₂

V

DEB, diepoksybutan

no₂ nh

¹ #

CH₃—N —C

NH

!

no₂

MNNG, N- metyfo -W-nitro* -W-nitrozoguanidyna

Ryc. 10-11. Związki alkilujące o działaniu mutagennym

pfc _oWoduje unieczynnienia genu, a tylko zmienia kontrolę jego ekspresji, indukowanej na konstytutywną lub odwrotnie.

tageneza transpozonowa wymaga stosowania nośników transpozonów. d$hvć nimi fagi, a przede wszystkim plazmidy, dobrane w sposób uniemoż-Ęgt ‘L j_Ch replikację w komórce, której chromosom ma być biorcą transpozonu. Iw tv otrzymane w drodze mutagenezy transpozonowej mają ułatwioną selek-„P^względu na cechę oporności na antybiotyki — bardzo często kodowaną ^ffztranspozony.

Mutageneza ukierunkowana

pPiaaeneza ukierunkowana pozwala na wprowadzenie zmiany w określone ^r§O_sce genomu. Warunkiem jej przeprowadzenia jest znajomość sekwencji i:'9deotydowej odcinka DNA zawierającego miejsce, które ma być zmutowane, fiutageneza ukierunkowana oddaje olbrzymie usługi w precyzyjnym badaniu %nkqi genów strukturalnych i miejsc regulatorowych.

%- Istnieje bardzo dużo technik mutagerdzacji określonych miejsc w DNA. Tu ^ Jdówimy tylko jedną, tzw. mutagenezę kasetową (ryc. 10-12). Całkowicie zsek-!'v)encjonowany odcinek DNA, który chcemy zmutować w określonym miejscu, Ifionujemy w wektor plazmidowy. Po amplifikacji DNA usuwamy część wkio-l|bwanegó fragmentu za pomocą enzymów restrykcyjnych. Na to miejsce wprowadzamy kasetę, czyli dwuniciowy oligonukleotyd zsyntetyzowany in vitro

jest alkilem. Najsilniej jest alkilowana guanina w pozyqi 7, znacznie słabiej adfjlf i [Różniący się w określonym miejscu od oryginalnego fragmentu. Po transformacji nina w pozycji 1, jeszcze słabiej cytozyna w pozycji 3. Alkilowanie zmienia strukfl [ komórek bak

...

turę zasad, wskutek czego podlegają one odczepieniu od pentozy w łańcuchu^ polinukleotydowym. Ponieważ najczęściej alkilacji ulegają puryny (G i A), zatem) dochodzi do ich odłączenia, czyli tzw. depurynaqi. Do wolnego wiązania pef-tozy, pozostającego po depurynacji, może następnie przyłączyć się dowolna zasp da i często będzie nią inna niż została oderwana. Nitrozoguanidyna działff szczególnie wydajnie na replikujący się DNA.

Wszystkie te czynruki doprowadzają do podstawienia właściwej zasady—51 inną lub, tak jak barwniki akrydynowe, powodują opuszczenie lub dodanie jedne-p; go nukleotydu.

I komórek bakteryjnych każdy powstały klon będzie nośnikiem zmutowanej sek-i wencji.

Naprawa uszkodzeń DNA

Opisano wiele systemów usuwających uszkodzenia DNA w komórkach bakteryjnych. Niektóre z nich mają zasięg ograniczony do naprawy zmian określonego ie^|| typu, inne są bardziej uniwersalne.

Stosunkowo nieliczne mechanizmy naprawcze umożliwiają bezpośrednie usunięcie błędu bez naruszenia struktury otaczającego DNA. Należy tu oryginalny mechanizm foto reaktywacji usuwający z DNA wybiórczo dimery tyiruny. Enzymem kluczowym funkcjonowania tego systemu jest fotoliaza aktywowana przez światło widzialne, z maksimum absorpcji przy długości fali 380 nm. Enzym ten hydrolizuje wiązania kowalencyjne między dwiema cząsteczkami tyminy w dimerze. Drugi system bezpośredniego usunięcia błędu usuwa z DNA reszty metylowe i etylowe powstałe w wyniku działania czynników alkilujących. Enzym, metylotransferaza 0⁶-metyloguanidylowa kodowana przez gen ada, przenosi grupę metylową z guaniny na własne reszty cysternowe. Metylacja enzymu prowadzi do jego inaktywacji, ale jednocześnie pozytywnie reguluje jego syntezę. W rezultacie obserwowana jest adaptacja komórek do zwiększających się stężeń czynników alkilujących.

: i

Mutageneza transpozonowa

Opisane w poprzednim rozdziale ruchome elementy genetyczne, transpozony,; I znajdują zastosowanie jako biologiczny czynnik mutagenny. Mutagenne dzia-" ^:; łanie transpozonów jest związane z ich zdolnością do przemieszczania się zarówno w obrębie chromosomu, jak i między chromosomem a plazmidami. Wbudowanie się transpozonu w gen prowadzi najczęściej do jego inaktywacji.. Niejednokrotnie obserwowany jest polarny efekt mutacji, polegający na unie-czynnieniu innych genów w danym operonie, położonych dystalnie w stosunku do genu z wbudowanym transpozonem. Stosunkowo rzadko insercja transpo-

318

319