2

Rybonukleazy dzielą się na trzy podpodklasy 1/ Endorybonukleazy EC 3.1.26 2/ Egzorybonukleazy EC 3.1.13 i 3/ Restryktazy.

Przedmiotem ćwiczeń będzie rybonukleaza z trzustki świni - RNaza 1. Enzym ten jest endorybonukleazą i hydrolizuje wiązania fosfodiestrowe znajdujące się za nukleotyuami prym idy nowy mi. RNazy zwierzęce charakteryzują się zróżnicowanym optimum pH. Optimum pH dla jednej z grup rubonuklcaz wynosi 5,2 - 5,3 podczas gdy optimum pH drugiej grupy rybonukleaz zawiera się w przedziale 7,8 - 8,2. Najlepiej poznanym enzymem jest rybonukleaza trzustki bydlęcej RNaza I. Jest to enzym o masie cząsteczkowej 12 700 Da, zbudowana z 124 aminokwasów tworzących pojedynczy łańcuch peptydowy. Enzym zawiera cztery mostki disiarczkowe. Ta duża ilość mostków dwusiarczkowych i mała masa cząsteczkowa decydują o termostabilności enzymu. Rybonukleaza traci jedynie 20% aktywności po ogrzaniu przez 30 min w temp 100°C w pH 2-5. Enzym jest aktywowany przez NaCl, NaN02, Na₂SO.», KC1, KBr, NHjCl i hamowany przez p-chlorortęciobcnzocsan. detergenty anionowe, kwas hialuronowy heparynę, pektyny, amylozę.

Izolowanie i oznaczanie aktywności z trzustki wieprzowej/bydlęcej.

I. Izolacja

Materiał

Trzustka wołowa lub wieprzowa Odczynniki

120 mM roztwór IBSOj

(NHj^SOa in substantia wysuszony w temp 80^UC i roztarty na pył.

Wykonanie

IzpIacją-RNazY-^r^stki

5 gram tkanki homogenizujemy w 100 ml 120 mM H2SO4 w blenderze. Uzyskany homogenat wytrząsamy przez 2 godziny. Zawiesinę sączymy przez trzy warstwy gazy. Uzyskany osad zalewamy 50 ml 120 mM H₂S0₄ i wytrząsamy przez 30 min.

Oba przesącze łączymy i dodajemy siarczanu amonu do 65% nasycenia (430 g NRihSOo/L). Zawiesinę sączymy przez bibułę na lejku Buchnera. W przesączu podnosimy stężenie (NH.O2SO4 do 80% nasycenia (105g na litr przesączu) i umieszczamy w lodówce na 12 - 14 godz. Powstający osad odwirowujemy przy' 3000 obr/min przez 15 minut.

Osad zawierający surową frakcję RNazyl rozpuszczamy w H₂0 (1 g osadu na 5ml H₂0).

Oznaczanie aktywności.

1/2% roztwór RNA w H₂0

2/ Bufory do oznaczeń aktywności

a. bufor boranowy pH 7.6; b. bufor fosforanowy pi l 7.0; c. Bufor octanowy pH 4.0.