CCF20091118005

_Biologia nowotworzenia - Ćwiczenie 5 i 6

2.    Ten sam obraz zarejestrować przy zamkniętym dopływie światła (obraz nr 2), aby można było wykluczyć tzw. szum ciemny, związany z akumulacją ładunku ciemnego w pikselach matrycy kamery CCD [Chwirot, niepublikowane 1998].

3.    W celu wyeliminowania szumów wynikających z pracy kamery od obrazu nr 1 odjąć szum termiczny, czyli obraz nr 2, stosując następujące komendy:

-    ‘Oper’,

‘Image Calculator...’,

-    ‘ImgT,

-    ‘Fix’,

i 6

-    ‘Img 2’,

-    ‘Fix\

‘ = ‘ (tu otrzymuje się obraz wynikowy).

Odjęcie prądu ciemnego pozwala traktować intensywność pikseli tak skorygowanego obrazu jako wielkość wprost proporcjonalną do odpowiedniego czasu rejestracji obrazu [Chwirot, niepublikowane 1998],

4.    Z otrzymanego obrazu wyodrębnić składową czerwoną, aby usunąć wszystko to, co nie wybarwiło się czerwienią syriuszową:

’ - 'Oper',

'Color Separation',

-    ‘Red’.

5.    Z uzyskanego w ten sposób obrazu w skali szarości utworzyć histogram:

'Measure',

'Histogram',

-    'OK'.

Aby zarejestrowany obraz był odpowiednio naświetlony suma wartości średniej (M - mean) i 3 odchyleń standardowych histogramu (SD - standard deviation) nie może przekroczyć 200, ale powinna być jak najbliższa tej wartości. Jeżeli obraz przeznaczony do rejestracji okaże się zbyt jasny (M + 3SD > 200) lub niedoświetlony (M + 3SD dużo niższa od 200) należy odpowiednio zmniejszyć albo zwiększyć czas jego naświetlania. W przypadku zbyt słabo oświetlonego obrazu wyznaczana przez komputer wartość kolagenu podczas jego analizy mogłaby zostać zaniżona.

Z punktu widzenia zastosowań w analizie ilościowej istotne jest, aby stosowany układ miał liniową charakterystykę, to znaczy, żeby intensywność piksela w zarejestrowanym obrazie cyfrowym była wprost proporcjonalna do natężenia światła w odpowiednim punkcie preparatu. Gdyby charakterystyka ta nie była liniowa, konieczne stałoby się wykonywanie odpowiedniej korekcji przed analizą [Chwirot, niepublikowane 1998], Wartość sumy średniej i 3 odchyleń standardowych wiąże się z parametrami kamery, której praca ma charakter liniowy w granicach 0-200. Przy takich parametrach uzyskuje się wiarygodne wyniki analiz.

3.2. Wyznaczanie granicy tła i kolagenu na zarejestrowanym obrazie

Metoda analizy obrazów opiera się na wyznaczeniu wartości progowych tła i kolagenu na obrazie. Zastosowana, tzw. manualna metoda analizy jest w rzeczywistości zmodyfikowaną procedurą automatyczną przeprowadzaną przez program analySIS (Soft Imaging System).

3.2.1. Procedura wyznaczania granicy tła i kolagenu na obrazie

1. Z zarejestrowanego obrazu, sprawdzonego wcześniej pod względem prawidłowego oświetlenia, wyodrębnić składową czerwoną, aby pozbyć się wszystkiego co nie jest kolagenem, czyli nie zostało wybarwione czerwienią syriuszową:

11