CCF20121201007

Ćwiczenie 12

Temat: Reakcje barwne charakterystyczne dla wybranych enzymów: katalaza, peroksydaza, oksydaza fenolowa i polifenolowa, ureaza, inwertaza. Określanie aktywności amylazy ślinowej i badanie wpływu pH na aktywność tego enzymu.

I. Oksydoreduktazy:

Katalaza i peroksydaza

Enzymy te są białkami złożonymi, należącymi do hemoprotein. Katalaza występuje głównie w erytrocytach, a także w komórkach wątroby i nerek. Enzym ten usuwa toksyczny H₂0₂ ze środowiska reakcji, zapobiega tworzeniu rodnika hydroksylowego, uczestniczy w usuwaniu reaktywnych form tlenu. Katalaza przyspiesza reakcję, w trakcie której jedna cząsteczka nadtlenku wodoru jest dawcą (donorem), zaś druga biorcą (akceptorem ) elektronów. Reakcja utleniania i redukcji przebiega zgodnie z równaniem

H₂0₂ + H₂0₂ -» 0₂ + 2H₂0

Peroksydaza występuje w erytrocytach, a także komórkach tkanki płuc, tarczycy, trzustki. Enzym ten podobnie jak katalaza uczestniczy w usuwaniu reaktywnych form tlenu. W reakcjach katalizowanych przez ten enzym substratami oddającymi elektrony i protony mogą być różne związki, natomiast akceptorem elektronów jest wyłącznie nadtlenek wodoru .

AH₂ + H₂0₂ -> A + 2H₂0

13.2.1.    Wykrywanie katalazy

Zasada: efektem działania katalazy jest wydzielenie się banieczek gazu - tlenu z nadtlenku wodoru po dodaniu kilku kropli krwi Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki, rozcieńczona krew płynem fizjologicznym 1:10 3% H,0₂

Przygotować dwie probówki do których wlać około 0,5 ml rozcieńczonej krwi . Do pierwszej probówki wlewamy około 1 ml 3% H₂0₂..Pod działaniem katalazy następuje obfite wydzielanie tlenu (banieczki gazu), natomiast drugą probówkę z krwią ogrzewamy do wrzenia, oziębiamy (pod kranem z wodą) i dodajemy 1 ml 3% H₂0₂. Banieczki gazu nie wydobywają się z roztworu, ponieważ enzym uległ dezaktywacji przy zagotowaniu.

13.2.2.    Wykrywanie peroksydazy

Zasada: katalityczną aktywność peroksydazy można wykryć na drodze przeniesienia tlenu z nadtlenku wodoru na benzydynę, która zostaje utleniona do niebieskiego barwnika.

benzydyna    benzydyna utleniona

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: rozcieńczona krew płynem fizjologicznym 1:10 CH3COOH 3% H₂0₂

benzydyna - nasycony roztwór

Do probówki wlać 0,5 ml rozcieńczonej krwi , dodać 1 kroplę kwasu octowego, następnie 5 kropli 3% H₂0₂ i 3 krople benzydyny. Roztwór barwi się na kolor niebieski.

‘l&Oksydazy

Oksydazy, są enzymami, które katalizują utlenianie substratu przez odebranie wodoru (protonów i elektronów), przy czym akceptorem wodorów jest tlen atomowy bądź cząsteczkowy. W obrębie komórki tego typu enzymy występują w mitochondriach oraz peroksysomach, a także w siateczce śród-plazmatycznej. W mitochondriach akceptorem wodorów jest zawsze tlen atomowy, co prowadzi do powstania wody zgodnie z równaniem:

AH₂ + 'A0₂-> A +H₂0