CCF20121201013

POINTĘ

SCIENTIFIC

AM1NOTRANSFERAZA ASPARAGINIANOWA (AST)

Nr kat. A7560

■= Aabs/minx1763

IU/I =

HISTORIA METODY

Kinetyczną metodę oznaczania aktywności aminotransferazy aspara-ginianowej opracował Karmen w 1955 roku [1], Procedura ta bazowała na zastosowaniu dehydrogenazy jabłczanowej i NADH. W latach sześćdziesiątych, Henry [2] oraz Amador i Wacker [3] wprowadzili modyfikacje prowadzące do wzrostu powtarzalności i zmniejszenia wpływu różnych substancji interferujących. W 1974 roku Komitet Enzymatyczny Skandynawskiego Towarzystwa Chemii Klinicznej i Fizjologii Klinicznej zaakceptował wprowadzone modyfikacje. Komitet ekspertów Międzynarodowej Federacji Chemii Klinicznej (IFCC) zaproponował dodawanie do mieszaniny reakcyjnej 5-fosfopirydoksalu (P-5-P) dla osiągnięcia maksymalnej aktywności, co zostało zarekomendowane i opublikowane w 1978 roku [4j. Prezentowana metodyka bazuje na rekomendacjach IFCC, lecz nie zawiera P-5-P, ponieważ diagnostyczne znaczenie zwiększonej aktywności AST jest w dalszym ciągu dyskutowane [5,6,7].

ZASADA METODY

AST

L - asparaginian + a - ketoglutaran ——>

-* szczawiooctan + L - glutaminian

szczawiooctan + NADH + H* ——    jabpczan + NAD' + H₂0

AST katalizuje reakcję przeniesienia grupy aminowej z L-asparaginia-nu na a-ketoglutaran, w wyniku której powstaje szczawiooctan i L-glutaminian. W następnej reakcji enzymatycznej katalizowanej przez dehydrogenazę jabłczanową (MDH) następuje redukcja szcza-wiooctanu z jednoczesnym utlenieniem NADH do NAD⁺. Spadek ab-sorbancji mierzonej przy długości fali 340nm jest więc proporcjonalny do ilości powstającego NAD⁺, a więc do aktywności aminotransferazy. Mieszanina reakcyjna zawiera ponadto dehydrogenazę mleczano-wą (LDH), która ochrania przed interferencją endogennego pirogro-nianu obecnego w normalnej surowicy krwi.

ODCZYNNIK

1. Skład odczynnika *)

a-kstcglutaran    12    mM

Kwas L-asparaginowy    200    mM

NADH    0,2    mM

LDH    800    U/l

MDH    600    U/l

Bufor Tris    pH 7,8 ±0,1

Niereaktywne stabilizatory

*) stężenia poszczególnych składników odnoszą się do zrekonstruowanego odczynnika. Rekonstytucję przeprowadzić wodą destylowaną do objętości podanej na etykiecie. Wymieszać do całkowitego rozpuszczenia.

2. Przechowywanie i stabilność odczynnika:

1.    Odczynnik nierozpuszczony przechowywać w temp. 2-8°C.

2.    Po rekonstytucji odczynnik jest stabilny przez:

48 godzin w temperaturze pokojowej (18-25°C);

30 dni w temperaturze 2-8°C.

3.    Odczynnik nie powinien być stosowany, jeżeli jego wyjściowa absorbancja mierzona wobec wody przy długości fali 340 nm jest poniżej wartości 0,800.

ZBIERANIE PRÓBEK

1.    Oznaczanie aktywności AST powinno być wykonywane w surowicy krwi wolnej od hemolizy (erytrocyty zawierająAST) [8],

2.    Aktywność AST w surowicy jest stabilna przez:

4 dni w temperaturze pokojowej (18-25°C);

10 dni w temperaturze 2-8 °C;

14 dni po zamrożeniu (-20°C).

WYKONANIE OZNACZENIA

1.    Odmierzyć 1ml odczynnika do probówki i ogrzać do temperatury 37°C przez 5 minut.

2.    Wyzerować aparat przy długości fali 340 nm wobec wody.

3.    Dodać 10Opl surowicy, zamieszać i inkubować w temperaturze 37°C przez 1 minutę.

4.    Dokładnie po jednej minucie odczytać wartość absorbancji i ponownie przenieść próbkę do temperatury 37°C. Dokonać pomiarów absorbancji w odstępach jednominutowych przez następne dwie minuty.

5.    Wyliczyć średnią różnicę absorbancji (Aabs/min).

6.    Aabs/min pomnożona przez wsp. 1768 daje wynik w IU/I.

7.    Próbki surowicy o aktywności większej niż 500 IU/I powinny byó rozcieńczone solą fizjologiczną w stosunku 1:1 i ponownie oznaczone. Wynik pomnożyć przez 2.

UWAGI TECHNICZNE

1.    Jeżeli spektrofotometr posiada termostatowane gniazdo kuwety, próbkę można pozostawić w aparacie przez cały czas oznaczenia.

2.    Surowice lipemiczne oraz ikteryczne mogą powodować zmętnienie próbki. W takich przypadkach wykonać oznaczenie dodając do 1ml odczynnika 50pl surowicy. Aabs pomnożyć przez 3376.

3.    Sposób wyliczenia wyniku:

Aabs/min x1,10x1000 6,22x0,10x1

1,10 - objętość całkowita

1000 - zamiana lU/ml ma IU/I

6,22 - współczynnik absorbancji milimolowej NADH

0,10 - objętość próbki

1    -    długość drogi optycznej

Jednostki SI: aby uzyskać wynik w nkat/1 pomnożyć IU/I przez 16,67.

4. Odczytu można dokonać w zakresie długości fali 330-350nm.

WARTOŚCI PRAWIDŁOWE [9],

1.    do 28 IU/I (30°C)

2.    do 40 IU/I (37°C)

UWAGA!

Zaleca się aby każde laboratorium określiło własne zakresy wartości prawidłowych.

INFORMACJE DODATKOWE

1.    Liniowość:    500 IU/I

2.    Badania porównawcze z metodą standardową

- współczynnik korelacji    0,999

równanie regresji    y=1,00x+1,6.

POWTARZALNOŚĆ:

badania wewnątrzseryjne    badania międzyseryjne

X	S.D.	C.V.%	X	S.D.	c.v.%
31	2,2	7,1	31	2,5	8,1
156	3,2	2,1	160	4,0	2,5

PIŚMIENNICTWO

1.    Karmen A., et al., J. Clin. Invest, 34, 126 (1955).

2.    Henry R.J., et al., Am. J. Clin. Path., 34, 381 (1960).

3.    Amador E„ Wacker W., Clin. Chem., 8, 343 (1962).

4.    Expert Panel of Enzymes of the International Federation of Clinical Chemistry., Clin. Chem., 24, 720 (1978).

5.    Jung K., Bohm. M., Enzyme 23, 201 (1978).

6.    Hafkenscheid J.C.M., Clin.Chem. 25/1, 55 (1979).

7.    Horder M., Bowers G.N., Clin.Chem., 23, 551 (1977).

8.    Henry R.J., Clinical Chemistry: Principles and Technics, 2nd Ed.,' Hagerstown (MD), Harper & Row, str 882 (1974).

9.    Tietz N.W., Fundamentals of Clinical Chemistry, Philadelphia, W.B, Saunders, str 682 (1976).

Pointę Scientific Polska Sp. z o.o., ul. Rumiana 76, 02-956 Warszawa tel./fax [phone] www.pointe.com.pl, e-mail: [e-mail]

7

REV 02/02